KR102344689B1 - L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 - Google Patents

L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 L-발린 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것으로, 본 출원의 활성 강화 또는 활성 감소된 효소들의 조합을 포함하는 미생물을 배양하는 경우, 고수율의 L-발린 생산이 가능하다.

Description

L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 L-발린 생산 방법 {A microorganism producing L-valine and a method for producing L-valine using the same}
본 출원은 L-발린 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것이다.
분지쇄 아미노산 중 하나인 L-발린은 미생물에 있어서 피루브산으로부터 출발하여 아세토젖산(acetolactic acid), 디하이드록시 이소발레르산(dihydroxy isovaleric acid), 케토이소발레르산(ketoisovaleric acid)을 경유하여 생합성된다. 이러한 중간 대사산물들은 아세토하이드록시산 신타제(acetohydroxy acid synthase), 아세토하이드록시산 이소메로 리덕타아제(acetohydroxy acid isomeroreductase), 디하이드록시산 디하이드레타제(dihydroxy acid dehydratase), 트랜스아미나제 B(transaminase B)에 의하여 촉매된 반응에 의하여 생성된다. 그러나, 상기 효소들은 케토부티르산(ketobutyric acid)과 피루브산으로부터 시작되는 L-이소류신 생합성에도 관여하며, 중간대사물인 케토이소발레르산으로부터 2-이소프로필말산(2-isopropylmalic acid), 3-이소프로필말산(3-isopropylmalic acid), 케토이소카프로산(ketoisocaproic acid)을 경유하여 L-류신이 생합성되기도 한다. 따라서, 상기와 같이 분지쇄 아미노산, 즉 L-발린, L-이소류신, L-류신은 그 생합성 과정에 동일한 효소를 사용하기 때문에 한가지의 분지쇄 아미노산을 발효를 통해 공업적으로 제조하는 데는 어려움이 있는 것으로 알려져 있으며, 추가적으로 최종 산물인 L-발린 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 발생하여 이를 공업적으로 대량 제조하기에는 제약이 따른다는 문제점을 갖고 있다.
다만, 지금까지 피드백 저해를 통한 발린의 생산방법에 관한 연구는 있었으나(미국 등록특허 제10457919호), 본 출원의 활성 강화 또는 활성 감소된 효소들의 조합을 통한 발린의 생산능 증대에 관한 연구는 없었다.
이에 본 발명자들은 효과적인 L-발린 생산방법에 대해 지속적인 연구를 한 결과, 다이하이드록시산 디하이드라타제(dihydroxy-acid dehydratase)의 활성 강화; 및 트랜스아미나제 C(transaminase C)의 활성 감소, 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)의 활성 약화, 시트레이트 신타아제(citrate synthase)의 활성 감소 또는 이들의 조합을 포함하는 미생물이 상기 효소들의 야생형에 비하여 L-발린 생산능이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 갖는, L-발린 생산 미생물을 제공하는 것이다.
(1) 감소된 트랜스아미나제 C의 활성
(2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성
(3) 감소된 시트레이트 신타아제의 활성
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-발린의 생산방법을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는, 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 L-발린 생산 미생물을 제공하는 것이다.
(1) 감소된 트랜스아미나제 C의 활성
(2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성
(3) 감소된 시트레이트 신타아제의 활성
하나의 구체예로, 상기 발린 생산 미생물은 상기 미생물은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성 및 감소된 트랜스아미나제 C의 활성을 갖는 미생물일 수 있다.
다른 구체예로, 상기 발린 생산 미생물은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성 및 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성을 갖는 미생물일 수 있다.
또 다른 구체예로, 상기 발린 생산 미생물은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성 및 감소된 시트레이트 신타아제의 활성을 갖는 미생물일 수 있다.
또 다른 구체예로, 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성 및 감소된 시트레이트 신타아제의 활성에 추가적으로, 감소된 트랜스아미나제 C의 활성 또는 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성을 갖는 미생물일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "다이하이드록시산 디하이드라타제(dihydroxy-acid dehydratase)"는 피루브산(pyruvate)에서 아세토락테이트(acetolactate)를 거쳐 다이하이드록시-이소발러레이트(dihydroxy-isovalaerate)에서 케토아이소-발러레이트(ketoiso-valerate)를 거쳐 L-발린을 생산하는 생합성 경로에서 L-발린의 전구체인 케토아이소-발러레이트(ketoiso-valerate)의 합성에 관여하는 효소를 의미한다. 본 출원에서는 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성을 강화시켜 케토아이소-발러레이트의 합성을 증가시킴으로 인하여 L-발린의 생산량 증가를 도모할 수 있다.
본 출원에서 용어, "트랜스아미나제 C(transaminase C)"는 피루브산(pyruvate)으로부터 L-알라닌을 합성하는 경로에 관여하는 효소를 의미한다.
본 출원에서 용어, "피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)"는 피루브산으로부터 아세틸 조효소A(acetyl-coA) 합성에 관여하는 효소를 의미한다.
본 출원에서 용어, "시트레이트 신타아제(citrate synthase)"는 아세틸 조효소 A로부터 시트레이트(citrate)를 합성하는 효소를 의미한다.
본 출원에서 용어, "강화"란 본래 미생물이 천연의 상태, 또는 변이 전 상태에서 나타내는 단백질의 활성, 즉 내재적 활성 또는 단백질을 코딩하는 유전자의세포 내 1 카피일 때와 비교하였을 때, 그 활성이 증가된 것을 의미하며, 특정 단백질의 활성을 가지지 않는 미생물에 그 단백질을 도입하여 이의 활성을 부여하는 활성의 도입 역시 포함하는 개념이다.
상기 "내재적 활성"은 본래 미생물이 천연의 상태, 또는 비변이 상태에서 나타내는 단백질의 활성 상태를 의미한다. 구체적으로 상기 "활성의 강화"는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 단백질 자체의 활성이 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로 인한 내재적 유전자 증폭, 외부로부터의 유전자 도입, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 단백질을 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 변형하는 방법, 상기 단백질의 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하거나 상기 단백질의 활성이 강화되도록 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 유도시켜 염색체 상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 변형하는 방법, 외부로부터 유전자를 도입하거나 염색체로 유전자를 삽입하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본원의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하여 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 또는 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
본원에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 뉴클레오티드 서열을 결손, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 뉴클레오티드서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 구체적으로는 강력한 프로모터로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예로 cj1 내지 cj7 프로모터 (대한민국 등록특허공보 제0620092호), spl1,7 또는 13 프로모터 (대한민국 등록특허 공보 제1783170호), PgapA 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 뉴클레오티드 서열을 결손, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체에 의하여 수행될 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니다.
이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성이 없던 것이 나타나거나, 또는 이의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % 또는 500 %, 최대 1000 % 또는 2000 %까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 미생물은 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성이 야생형, 변이 전 미생물 또는 해당 단백질이 비변형된 미생물에 비해 강화되어 다이하이드록시-이소발러레이트(dihydroxy-isovalaerate)로부터 L-발린의 전구체인 케토아이소-발러레이트(ketoiso-valerate) 합성이 증가됨으로써 L-발린 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "감소"란 본래 미생물이 천연의 상태, 또는 변이 전 상태에서 나타내는 단백질의 활성, 즉 내재적 활성 또는 단백질을 코딩하는 유전자의세포 내 1 카피일 때와 비교하였을 때, 그 활성이 약화되거나 또는 활성이 없는 것(결손)을 모두 포함하는 개념으로, 활성이 0%이상 내지 100%미만인 것을 의미한다.
이러한 단백질 "활성의 감소" 는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 단백질 자체의 활성이 제거된 경우 또는 본래 기능 이하의 효과를 도출하는 것을 의미하는 것이다.
상기 "활성의 결손"은 효소 또는 단백질의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 것을 의미한다.
본 출원에 있어서 상기 활성의 결손은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결손시키는 방법; 2) 상기 단백질의 활성이 제거되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 3) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 "활성의 약화"는, 특별히 이에 특별히 이에 제한되지 않으나, 본래 기능 이하의 효과를 도출하는 것을 의미하는 것으로, 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 일부를 결실시키는 방법; 해당 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약한 서열로 교체하는 방법(예컨대, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법)등으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 활성 약화를 위하여 공지된 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 감소는, 상응하는 단백질의 활성이 제거 되거나, 또는 이의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 0%, 1%, 5%, 10 %, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%로 감소 되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 미생물에서 트랜스아미나제 C의 활성은 자연의 야생형 균주, 변이 전 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비해 감소된 것일 수 있다. 하나의 구체예로 상기 미생물은 트랜스아미나제 C 유전자가 결손되어 트랜스아미나제 C 단백질의 활성이 없거나 트랜스아미나제 C 유전자의 개시코돈 암호화 서열이 GTG로 변형되어 트랜스아미나제 C 단백질의 발현이 감소하여 활성이 약화된 것일 수 있다.
또한, 구체적으로, 상기 미생물에서 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성은 자연의 야생형 균주, 변이 전 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비해 감소된 것일 수 있다. 하나의 구체예로 상기 미생물은 피루베이트 디하이드로게나아제 유전자가 결손되어 피루베이트 디하이드로게나아제 단백질의 활성이 없거나 피루베이트 디하이드로게나아제 유전자의 개시코돈 암호화 서열이 GTG로 변형되어 피루베이트 디하이드로게나아제 단백질의 발현이 감소하여 활성이 약화된 것일 수 있다. 다른 하나의 구체예로 상기 미생물에서 피루베이트 디하이드로게나아제 유전자의 서열이 변이되어 상기 미생물은 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 432번째 또는 435번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 야생형 단백질보다 약화된 활성을 가지는 피루베이트 디하이드로게나아제 변이체가 발현하는 것일 수 있다. 이때, 상기 야생형 단백질보다 약화된 활성을 가지는 피루베이트 디하이드로게나아제 변이체는 각각 서열번호 5 또는 서열번호 6의 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 구체적으로, 상기 미생물에서 시트레이트 신타아제의 활성은 자연의 야생형 균주, 변이 전 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비해 감소된 것일 수 있다. 하나의 구체예로 상기 미생물은 시트레이트 신타아제 유전자의 결손으로 시트레이트 신타아제 단백질 활성을 나타내지 않거나 시트레이트 신타아제 유전자의 개시코돈 암호화 서열이 GTG로 변이됨으로써 시트레이트 신타아제 단백질의 발현이 감소하여 이의 활성이 약화된 것일 수 있다. 다른 하나의 구체예로 상기 미생물에서 시트레이트 신타아제 유전자의 서열이 변이되어 상기 미생물은 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 241번째 또는 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 야생형 단백질보다 감소된 활성을 가지는 시트레이트 신타아제 변이체를 발현하는 것일 수 있다. 이때, 상기 야생형 단백질보다 감소된 활성을 가지는 시트레이트 신타아제 변이체는 각각 서열번호 7 또는 서열번호 8의 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
'다른 아미노산으로 치환'은 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것이면 제한되지 않는다. 구체적으로 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아르파르트산, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 아르기닌 및 글루타민 중 어느 하나의 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 약화된 활성을 가지는 피루베이트 디하이드로게나아제는 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 432번째 또는 435번째 위치에 상응하는 아미노산이 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
또한, 보다 구체적으로, 감소된 활성을 가지는 시트레이트 신타아제는 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 241번째 또는 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 극성 또는 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
본 출원에서 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 단백질 또는 펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사한 위치를 지칭한다.
본 출원에서, 본 출원에 사용되는 단백질 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 단백질과 본 출원의 단백질 서열을 정렬함으로써, 본 출원의 단백질의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.
본 출원에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의
주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다. 보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP,BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질 (mature protein) 의 N- 및/또는 C-말단으로부 터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이, 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein,divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질과 대비하여 단백질의 활성이 감소 또는 약화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하(염기성, 산성), 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산 서열들의 결손 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원의 용어, "L-발린 생산 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 L-발린을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 말한다. 또한, 상기 L-발린을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 L-발린을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니 아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다.
보다 더욱 구체적으로는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으며, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 강화된 활성을 갖는 다이하이드록시산 디하이드라타제;및 감소된 활성을 갖는 트랜스아미나제 C, 약화된 활성을 갖는 피루베이트 디하이드로게나아제 또는 감소된 활성을 갖는 시트레이트 신타아제 중 선택되는 어느 하나 이상의 조합이 도입된 L-발린 생산량이 증가될 수 있는 에스케리키아 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 가지는 변형된 L-발린을 생산하는 미생물의 모균주는 L-발린을 생산하는 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다.
(1) 감소된 트랜스아미나제 C의 활성
(2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성
(3) 감소된 시트레이트 신타아제의 활성
L-발린을 생산하는 미생물은 천연형 미생물 자체 또는 외부 L-발린 생산 기작과 관련된 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성을 강화시키거나 감소(약화 또는 억제)시켜 향상된 L-발린 생산능을 가지게 된 미생물일 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 미생물은 야생형 또는 변이전 모균주보다 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성이 강화되고 야생형 또는 변이전 모균주보다 트랜스아미나제 C의 활성이 감소된 L-발린 생산 미생물 일 수 있다. 이때, 상기 다이하이드록시산 디하이드라타제는 ilvD 유전자에 의해 코딩되며, 상기 트랜스아미나제 C는 avtA 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상기 유전자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 구체예로, 상기 미생물은 야생형 또는 변이전 모균주보다 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성이 강화되고 야생형 또는 변이전 모균주보다 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성이 약화된 L-발린 생산 미생물 일 수 있다. 이때, 상기 다이하이드록시산 디하이드라타제는 ilvD 유전자에 의해 코딩되며, 상기 피루베이트 디하이드로게나아제는 aceE 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상기 유전자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구체예로, 상기 미생물은 야생형 또는 변이전 모균주보다 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성이 강화되고 야생형 또는 변이전 모균주보다 시트레이트 신타아제의 활성이 감소된L-발린 생산 미생물 일 수 있다. 이때, 상기 다이하이드록시산 디하이드라타제는 ilvD 유전자에 의해 코딩되며, 상기 시트레이트 신타아제는 gltA 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상기 유전자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물에 추가적으로 야생형 또는 변이전 모균주보다 트랜스아미나제 C의 활성이 감소되거나 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성이 감소된 L-발린 생산 미생물이거나, 또는 야생형 또는 변이전 모균주보다 트랜스아미나제 C의 활성이 감소되고 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성이 감소된 L-발린 생산 미생물일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 L-발린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는, L-발린의 생산 방법에 대한 것이다.
(1) 감소된 트랜스아미나제 C의 활성
(2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성
(3) 감소된 시트레이트 신타아제의 활성
본 출원의 "L-발린"은 L-발린 그 자체 형태뿐 아니라, 이의 염 형태도 모두 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양 물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀)등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물,옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃내지 50℃ 구체적으로는 30℃내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-발린 을 회수하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 L-발린을 회수하는 것은 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 L-발린을 회수할 수 있다. 예컨대 원심 분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외 여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산방법은, 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-발린을 정제할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물로의 변형하는 것을 포함하는, L-발린 생산능을 증가시키는 방법을 제공한다.
(1) 감소된 트랜스아미나제 C의 활성
(2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성
(3) 감소된 시트레이트 신타아제의 활성
본 출원의 또 하나의 양태는 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 갖는 미생물의 L-발린의 생산용도를 제공한다.
(1) 감소된 트랜스아미나제 C의 활성
(2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성
(3) 감소된 시트레이트 신타아제의 활성
본 출원의 L-발린 생산 미생물을 배양하는 경우, 고수율의 L-발린 생산이 가능하다. 이에, 산업적인 면에서 생산의 편의성 및 제조원가 절감의 효과를 기대할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 발린 생산 기반 균주 제작 및 평가
야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067과 ATCC13869에 각각 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-spin Total DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머 쌍 및 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행, 각각 537bp의 유전자 단편을 각각 얻었다. PCR은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응의 조건에서 수행하였다.
상기 두 단편을 주형으로 서열번호 9와 서열번호 12를 의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하여 1044bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편 2"라 명명함)을 얻었다.
상기 얻어진 변이 도입 단편 2를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하여 변이 도입 단편 2를 포함한 벡터를 제작하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.
프라이머 염기 서열 서열번호
프라이머 1 AATTTCTAGAGGCAGACCCTATTCTATGAAGG 9
프라이머 2 AGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGAC 10
프라이머 3 GTCCCTCGTGTCTGTAAAGACCGAAACACT 11
프라이머 4 AATTTCTAGACGTGGGAGTGTCACTCGCTTGG 12
이후, 상기 pDZ-ilvN(A42V)를 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067과 ATCC13869균주에 각각 형질전환시켜 염색체 상에서 상동성 재조합을 유도하였다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다.
이후 상기에서 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 18과 서열번호 21을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이가 제대로 도입되었음을 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V 및 CJ8V라고 각각 명명하였다.
야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067과 ATCC13869 균주, 상기의 CJ7V 및 CJ8V 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다. 영양배지에서 계대 배양된 각 균주들을, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플플라스크에 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하여 하기 표 2에 나타내었다.
<영양배지 (pH 7.2)>
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
균주 OD600 발린(g/L)
ATCC14067 95 1.5
CJ7V 77 2.2
ATCC13869 115 1.0
CJ8V 89 1.9
상기의 결과에서 보듯이, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 13869 균주와 대비하여 ilvN(A42V)유전자 변이가 도입된 CJ7V 및 CJ8V 균주의 발린 생산능이 증가된 것을 확인하였다.
실시예 2: 발린 고 생산능 균주 제작 및 평가
실시예 2-1. 발린 생합성 유전자 ilvD 강화 균주 제작 및 평가
발린 생합성 유전자인 ilvD 발현을 강화한 발린 고 생산능 균주를 제작하기 위하여 하기 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍, 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍 및 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 ilvD 유전자의 프로모터 교체를 위한 pDZ-Pcj7-ilvD 벡터를 제작 하였다.
ilvD 강화 벡터 제작 프라이머 서열
프라이머 염기 서열 서열번호
프라이머 5 TTCGAGCTCGGTACCCGGTCTAGAGCACTTTCGCTCGCACC 13
프라이머 6 GATTTGAAAAGCGCATCAGAAACATCCCAGCGCTAC 14
프라이머 7 GTAGCGCTGGGATGTTTCTGATGCGCTTTTCAAATC 15
프라이머 8 GAAACACTATGATCCCACTTCGTTCAAAAGTCACCACCGTC 16
프라이머 9 GACGGTGGTGACTTTTGAACGAAGTGGGATCATAGTGTTTC 17
프라이머 10 GCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCGTGTGCAACGCCGTC 18
구체적으로, pDZ-Pcj7-ilvD 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 13과와 서열번호 14의 프라이머 쌍, 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머 쌍 및 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행, 각각의 단편을 얻었다. PCR 은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응의 조건에서 수행하였다.
상기 단편들을 주형으로 서열번호 13과 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용한오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하여 얻어진 변이 도입 단편 3에 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)을 처리하고 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 라이게이션하여 pDZ-Pcj7-ilvD 벡터를 제작하였다.
이후, 상기 제작된 pDZ-Pcj7-ilvD를 발린 생산 기반 균주인 CJ7V, CJ8V 및 KCCM11201P에 각각 형질 전환시켜 염색체 상에서 상동성 재조합을 유도하였다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 13과 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이가 제대로 도입되었음을 확인한 후 상기 선별된 재조합 균주를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V:ilvD, CJ8V:ilvD, KCCM11201P:ilvD라 명명하였다.선별된 ilvD 유전자 강화 균주들의 발효 역가를 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였고, 그 결과는 하기와 같다.
ilvD 강화 균주 L-발린 생산능
균주 OD600 발린(g/L)
CJ7V 77 2.2
CJ7V:ilvD 73 2.6
CJ8V 89 1.9
CJ8V:ilvD 88 2.2
KCCM11201P 62 2.6
KCCM11201P:ilvD 60 2.9
상기의 결과에서 보듯이, 발린 생합성 유전자 중 하나인 ilvD를 강화하였을 시 발린 생산 기반균주 CJ7V, CJ8V 및 KCCM11201P균주 모두 발린 생산능이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 2-2. avtA 결손 및 약화(a1g) 균주 제작 및 평가
발린 고 생산능 균주를 제작하기 위해, avtA를 약화(avtA 유전자의 개시코돈을 GTG로 변형) 또는 결손시키고자 하였다. 이에 하기 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍 및 서열번호 21 및 22의 프라이머 쌍을 이용하여 avtA 약화 균주(avtA 유전자의 개시코돈을 GTG로 변형)제작용 벡터 및 하기 서열번호 23 및 24의 프라이머 쌍 및 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍을 이용하여 avtA 결손균주 제작용 벡터를 제작하고, 각각 pDZ-avtA(A1g), pDZ-avtA(del)라 명명하였다.
구체적으로, avtA 약화 벡터(pDZ-avtA(A1g))를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 19와 서열번호 20의 프라이머 쌍 및 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트를 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편을 주형으로 서열번호 19와 서열번호 22의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 4를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 라이게이션하여 pDZ-avtA(A1g) DNA를 제작하였다.
avtA 결손 벡터(pDZ-avtA(del))를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 23와 서열번호 24의 프라이머 쌍 및 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편을 주형으로 서열번호 23와 서열번호 26의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 5를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 라이게이션하여 pDZ-avtA(del) 벡터 DNA를 제작하였다.
avtA 약화 및 결손균주 벡터 제작 프라이머 서열
프라이머 염기 서열 서열번호
프라이머 11 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGACCGCTTCCTTGGCTGCCTGAAGATG 19
프라이머 12 TGCTTGGCTTCACAAGAGACAAGCCT 20
프라이머 13 AGGCTTGTCTCTTGTGAAGCCAAGCA 21
프라이머 14 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGACCTCATCAGAGATAAGAACAGCATC 22
프라이머 15 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGATACTCCGGTCTGCTTTATGCAGGTA 23
프라이머 16 AACTAACCTAGTCGCTTAAGAGACAAGCCTATCTGC 24
프라이머 17 GCAGATAGGCTTGTCTCTTAAGCGACTAGGTTAGTT 25
프라이머 18 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGAAAGTGCCACGAGCATTTCATCAGCT 26
이후, pDZ-avtA(del), pDZ-avtA(A1g)를 발린 생산 균주인 CJ7V:ilvD, CJ8V:ilvD 및 KCCM11201P:ilvD에 각각 형질 전환시켜 염색체 상에서 상동성 재조합을 유도하였다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다.
이후 상기에서 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 각각 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 유전자 서열 분석을 통하여 변이가 제대로 도입되었음을확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V:ilvD-avtA(del), CJ7V:ilvD-avtA (a1g), CJ8V:ilvD-avtA(del), CJ8V:ilvD-avtA (a1g), KCCM11201P:ilvD-avtA(del), KCCM11201P:ilvD-avtA (a1g)로 하기와 같이 명명하여 실시예 1과 동일한 방법으로 역가 평가 수행하였다.
avtA 결손 및 약화균주 L-발린 생산능
균주 OD600 발린(g/L)
CJ7V:ilvD 73 2.6
CJ7V:ilvD-avtA(del) 71 2.8
CJ7V:ilvD-avtA(a1g) 73 2.6
CJ8V:ilvD 89 1.9
CJ8V:ilvD-avtA(del) 86 2.1
CJ8V:ilvD-avtA(a1g) 89 2.0
KCCM11201P:ilvD 60 2.9
KCCM11201P:ilvD-avtA(del) 57 3.2
KCCM11201P:ilvD-avtA (a1g) 60 2.9
상기의 결과에서 보듯이, avtA 결손의 경우 발린 생산능 강화 효과가 있었으며 avtA 발현을 약화시킨 경우에는 CJ8V:ilvD-avtA (alg)균주에서 CJ8V:ilvD 균주 대비 발린 생산능 증가를 확인하여 대조균인 ilvD 강화 균주들과 동등 또는 그 이상 수준의 발린 생산능을 보였다. 표 4에서의 CJ7V, CJ8V 및 KCCM11201P균주와 비교하면 ilvD 강화 및 avtA 결손이나 약화의 경우 모두 발린 생산능이 강화되었음을 확인하였다.
실시예 2-3. aceE 결손 및 약화(a1g, Q432A, K435A) 균주 제작 및 평가
발린 고 생산능 균주를 제작하기 위해, aceE를 약화 또는 결손시키고자 하였다. 이에 aceE가 약화된 균주를 제작하기 위해 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍을 이용하여 aceE 유전자의 개시코돈이 GTG로 변형된 균주 제작용 벡터 하기 서열번호 27 및 32, 서열번호 33 및 36의 프라이머 쌍을 이용하여 aceE(Q432A) 균주 제작용 벡터 및 서열번호 27 및 34, 서열번호 35 및 36의 프라이머 쌍을 이용하여 aceE(K435A) 균주 제작용 벡터를 제작하였고 또한 서열번호 37 및 38, 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍을 이용하여 ace 결손(aceE(del))균주 제작용 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 벡터들을 각각 pDZ-aceE(A1g), pDZ-aceE(Q432A), pDZ-aceE(K435A), pDZ-aceE(del)라 명명하였다.
구체적으로, aceE의 개시코돈을 약화하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 27와 서열번호 28의 프라이머 쌍 및 서열번호 29와 서열번호 30을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편를 주형으로 서열번호 27과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 6을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하여 pDZ-aceE(A1g) 벡터 DNA를 제작하였다.
aceE(Q432A) 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 27과 서열번호 28 및 서열번호 33과 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편을 주형으로 서열번호 27과 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 7을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하여 pDZ-aceE(Q432A) 벡터 DNA를 제작하였다.
aceE(K435A) 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 27과 서열번호 34 및 서열번호 35와 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편을 주형으로 서열번호 27과 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 8을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하여 pDZ-aceE(K435A) 벡터 DNA를 제작하였다.
aceE(del) 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 37과 서열번호 38 및 서열번호 39와 서열번호 40의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편을 주형으로 서열번호 37과 서열번호 40의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 9를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하여 pDZ-aceE(del) 벡터 DNA를 제작하였다.
aceE 결손 및 약화균주 벡터 제작 프라이머 서열
프라이머 염기 서열 서열번호
프라이머 19 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGATACCGTCCAACCGGTACTTTGAACC 27
프라이머 20 TTGATCGGCCACTTCCACAC 28
프라이머 21 GGTGTGGAAGTGGCCGATCAA 29
프라이머 22 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGAGATCGTCTTCAGAAAGGCGACCCTC 30
프라이머 23 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAACCGTGGCATCAAGGACACCTCTGA 31
프라이머 24 AGCTTCTTCATTGCGTGGGTTG 32
프라이머 25 CAACCCACGCAATGAAGAAGCT 33
프라이머 26 AAGCGTCAGTGCCTTCATCTG 34
프라이머 27 CCAGATGAAGGCACTGACGCTT 35
프라이머 28 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGAAGATGGAGTCACCGGTGCGCTGGAA 36
프라이머 29 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAACCTTTCCCTGGAATTTTTTCCTTT 37
프라이머 30 TGTCCCTTGAGGTGATTTCCACACCTCCTGTTGGAATG 38
프라이머 31 TCCAACAGGAGGTGTGGAAATCACCTCAAGGGACAGA 39
프라이머 32 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGATGCTGCGCGGCAAGCGCCGTGGATT 40
이후, pDZ-aceE(del), pDZ-aceE(A1g), pDZ-aceE(Q432A), pDZ-aceE(K435A) 를 발린 생산 균주인 CJ7V:ilvD, CJ8V:ilvD 및 KCCM11201P:ilvD에 각각 형질 전환시켜 염색체 상에서 상동성 재조합을 유도하였다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다.
이후 상기에서 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 27과 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이가 제대로 도입되었음을 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V:ilvD-aceE(del), CJ7V:ilvD-aceE (a1g), CJ7V:ilvD-aceE(Q432A), CJ7V:ilvD-aceE(K435A), CJ8V:ilvD-aceE(del), CJ8V:ilvD-aceE (a1g), CJ8V:ilvD-aceE(Q432A), CJ8V:ilvD-aceE(K435A), KCCM11201P:ilvD-aceE(del), KCCM11201P:ilvD-aceE(a1g), KCCM11201P:ilvD-aceE(Q432A), KCCM11201P:ilvD-aceE(K435A)로 하기와 같이 명명하여 실시예 1과 동일한 방법으로 역가 평가 수행하였다.
aceE 결손 및 약화균주 L-발린 생산능
균주 OD600 발린(g/L)
CJ7V:ilvD 73 2.6
CJ7V:ilvD-aceE결손 21 1.1
CJ7V:ilvD-aceE약화(a1g) 69 2.8
CJ7V:ilvD-aceE약화(Q432A) 59 2.7
CJ7V:ilvD-aceE약화(K435A) 62 3.0
CJ8V:ilvD 89 1.9
CJ8V:ilvD-aceE결손 29 1.1
CJ8V:ilvD-aceE약화(a1g) 87 2.0
CJ8V:ilvD-aceE약화(Q432A) 77 2.1
CJ8V:ilvD-aceE약화(K435A) 81 2.4
KCCM11201P:ilvD 60 2.9
KCCM11201P:ilvD-aceE결손 13 1.0
KCCM11201P:ilvD-aceE약화(a1g) 59 3.0
KCCM11201P:ilvD-aceE약화(Q432A) 43 2.9
KCCM11201P:ilvD-aceE약화(K435A) 53 3.4
상기의 결과에서 보듯이, 다이하이드록시산 디하이드라타제(ilvD)의 활성이 강화된 균주에서 aceE가 추가적으로 결손된 균주의 경우, 생육 및 당소모 속도가 급격히 저하되어 발린 생산능이 감소하였다. 이에 반해 aceE가 약화된 균주들의 경우, 약화 정도에 따라 차이가 있긴 하였으나 생육 및 당소모 속도가 저하가 미미하였으며 발린 생산능이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 2-4. gltA 약화(a1g, N241T, M312I) 균주 제작 및 평가
발린 고 생산능 균주를 제작하기 위해, gltA를 약화시키고자 하였다. 이에 서열번호 41 및 42, 서열번호 43 및 44의 프라이머 쌍을 이용하여 gltA 유전자의 개시코돈이 GTG로 변형된 gltA 약화 균주 제작용 벡터, 서열번호 45 및 46, 서열번호 47 및 50의 프라이머 쌍을 이용하여 gltA(N241T) 균주 제작용 벡터 및 서열번호 45 및 48, 서열번호 49 및 50의 프라이머 쌍을 이용하여 gltA(M312I) 균주 제작용 벡터를 제작하고, 각각 각각, pDZ-gltA(A1g), pDZ-gltA(N241T), pDZ-gltA(M312I)라 명명하였다.
gltA 개시코돈 약화 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 41와 서열번호 42 및 서열번호 43과 서열번호 44의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편(A,B)를 주형으로 서열번호 41와 서열번호 44의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 10을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 라이게이션하여 pDZ-gltA(A1g) 벡터 DNA를 제작하였다.
gltA(N241T) 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 45과 서열번호 46 및 서열번호 47과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편(A,B)를 주형으로 서열번호 45과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 11을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ 벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 라이게이션하여 pDZ-gltA(N241T) 벡터 DNA를 제작하였다.
gltA(M312I) 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 서열변호 45와 서열번호 48 및 서열번호 49와 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응 조건으로 PCR을 수행하였다. 각각의 얻어진 단편(A,B)를 주형으로 서열번호 45과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(Overlapping) PCR을 실시하였고 얻어진 변이 도입 단편 12를 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ 벡터에 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 라이게이션하여 pDZ-gltA(M312I) 벡터 DNA를 제작하였다.
gltA 약화균주 벡터 제작 프라이머 서열
프라이머 염기 서열 서열번호
프라이머 37 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAACCCTGAAGCTGTCAGTTCCTAGCA 41
프라이머 38 CCCTTTCAAACACATTTGTTC 42
프라이머 39 CGAACAAATGTGTTTGAAAGGG 43
프라이머 40 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGATGCGCGGTGTGCGTACGCAGCCAGC 44
프라이머 41 GCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGATATGTGAGCACTGGCTCTACCGAGT 45
프라이머 42 AGGTGGAGCAGGTCTGCTCGTG 46
프라이머 43 CACGAGCAGACCTGCTCCACCT 47
프라이머 44 TGTCCGAAGCCGATGAGGCGGAC 48
프라이머 45 CGTCCGCCTCATCGGCTTCGGACA 49
프라이머 46 GCCTGCAGGTCGACCTAGATCTAGAGTCAGAGATTACGAGATCTTCCGGT 50
이후, pDZ-gltA(A1g), pDZ-gltA(N241T), pDZ-gltA(M312I)를 발린 생산 균주인 CJ7V:ilvD, CJ8V:ilvD 및 KCCM11201P:ilvD에 각각 형질 전환시켜 염색체 상에서 상동성 재조합을 유도하였다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다.
이후 상기에서 선별된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 45과 서열번호 50의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이가 제대로 도입되었음을 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V:ilvD-gltA (a1g), CJ7V:ilvD-gltA(N241T), CJ7V:ilvD-gltA(M312I), CJ8V:ilvD-gltA(a1g), CJ8V:ilvD-gltA(N241T), CJ8V:ilvD-gltA(M312I), KCCM11201P:ilvD-gltA(a1g), KCCM11201P:ilvD-gltA(N241T), KCCM11201P:ilvD-gltA(M312I)로 명명하고 실시예 1과 동일한 방법으로 역가 평가 수행하였다.
gltA 약화균주 L-발린 생산능
균주 OD600 발린(g/L)
CJ7V:ilvD 73 2.6
CJ7V:ilvD-gltA(a1g) 69 2.7
CJ7V:ilvD-gltA(N241T) 61 2.8
CJ7V:ilvD-gltA(M312I) 63 2.8
CJ8V:ilvD 89 1.9
CJ8V:ilvD-gltA(a1g) 87 1.9
CJ8V:ilvD-gltA(N241T) 80 2.2
CJ8V:ilvD-gltA(M312I) 81 2.1
KCCM11201P:ilvD 60 2.9
KCCM11201P:ilvD-gltA(a1g) 59 3.0
KCCM11201P:ilvD-gltA(N241T) 51 3.2
KCCM11201P:ilvD-gltA(M312I) 55 3.1
상기의 결과에서 보듯이, 다이하이드록시산 디하이드라타제(ilvD)의 활성이 강화된 균주에서 gltA 약화 균주들의 경우, 약화 정도에 따라 차이가 있긴 하였으나 생육 및 당소모 속도가 저하가 미미하였으며 발린 생산능이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 2-5. 유효변이 형질 조합균주 제작 및 평가
상기 실시예 2-2 내지 2-4에서 확인한 결과로부터 각 변이의 다양한 조합시 발린 생산능에 시너지 효과가 있는지 확인하고자 하였다. pDZ-avtA(del), pDZ-aceE(K435A)벡터를 실시예 2-4에서 제작한 발린 생산 균주인 CJ7V:ilvD-gltA약화(N241T), CJ8V:ilvD-gltA약화(N241T), KCCM11201P:ilvD-gltA약화(N241T)에 각각 형질 전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신(kanamycin) 25㎎/ℓ를 함유한 배지에서 선별하였다.
이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 23과 서열번호 26의 프라이머 쌍 및 서열번호 27과 서열번호 36의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 삽입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 하기와 같이 명명하여 실시예 1과 동일한 방법으로 역가 평가를 수행하였다.
유효 조합 균주 L-발린 생산능
균주 OD600 발린(g/L)
CJ7V:ilvD-gltA약화(N241T) 61 2.8
CJ7V:ilvD-gltA약화(N241T)-aceE약화(K435A) 59 3.2
CJ7V:ilvD-gltA약화(N241T)-avtA결손(del) 62 3.0
CJ8V:ilvD-gltA약화(N241T) 80 2.2
CJ8V:ilvD-gltA약화(N241T) aceE약화(K435A) 78 2.6
CJ8V:ilvD-gltA약화(N241T) avtA결손(del) 83 2.5
KCCM11201P:ilvD-gltA약화(N241T) 51 3.2
KCCM11201P:ilvD-gltA약화(N241T) aceE약화(K435A) 50 3.6
KCCM11201P:ilvD-gltA약화(N241T) avtA결손(del) 52 3.6
상기의 결과에서 보듯이, ilvD 강화 및 gltA 약화 형질에 aceE 약화형질 및 avtA 결손 형질이 각각 도입되었을 시 생육 및 당소모속도는 동등수준이며, 발린 생산능이 더욱 증가되는 것을 확인하였다.
상기에서 pDZ-aceE(K435A)벡터를 KCCM11201P:ilvD-gltA약화(N241T) 균주에 형질전환시켜 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 ace(K435A) 변이가 도입된 균주를 CA08-1592로 명명하고 2020년 7월 3일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12761P로 기탁번호를 부여 받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12761P 20200703
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism producing L-valine and a method for producing L-valine using the same <130> KPA191562-KR <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 613 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Corynebacterium sp. dihydroxy-acid dehydratase <400> 1 Met Ile Pro Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Val Gly Arg Asn Ala Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Leu Trp Arg Ala Thr Gly Thr Lys Glu Asn Glu Phe 20 25 30 Gly Lys Pro Ile Val Ala Ile Val Asn Ser Tyr Thr Gln Phe Val Pro 35 40 45 Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Ala Val Asp 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Arg Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr 100 105 110 Ala Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly 115 120 125 Met Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser 130 135 140 Gly Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Asp Gly Val Ala 145 150 155 160 His Ala Pro Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp 165 170 175 Ala Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Ala Ser Ala Cys Pro 180 185 190 Thr Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys 195 200 205 Leu Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu 210 215 220 Ala Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr 225 230 235 240 Val Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val 245 250 255 Leu Pro Arg Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala 260 265 270 Leu Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu 275 280 285 Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp 290 295 300 Glu Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser 305 310 315 320 Asp Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Gly Ile Pro Ala Leu 325 330 335 Leu Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser 340 345 350 Val His Ser Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg 355 360 365 Ser Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro 370 375 380 Gly Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp 385 390 395 400 Glu Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His 405 410 415 Ala Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser 420 425 430 Pro Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp 435 440 445 Asn Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val 450 455 460 Ser Val Ile Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Val Leu Val Val 465 470 475 480 Arg Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His 485 490 495 Pro Thr Ala Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu 500 505 510 Ile Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly 515 520 525 His Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu 530 535 540 Asn Gly Asp Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val 545 550 555 560 Gln Val Ser Asp Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp 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Ala Gln Met Leu Glu Glu Leu Pro His 145 150 155 160 Lys Pro Lys Ala Val Ile Val Thr Ser Pro Gly Asn Pro Thr Gly Thr 165 170 175 Ile Ile Asp Pro Glu Glu Leu Glu Arg Ile Ala Lys Trp Cys Asp Asp 180 185 190 Asn Asp Ala Val Leu Ile Ser Asp Glu Asp Tyr His Gly Met Ser Phe 195 200 205 Gly Arg Pro Leu Ala Thr Ala His Gln Phe Ser Lys Asn Ala Ile Val 210 215 220 Val Gly Thr Leu Ser Lys Tyr Phe Ser Met Thr Gly Trp Arg Val Gly 225 230 235 240 Trp Ile Ile Val Pro Asp Glu Leu Val Thr Ser Ile Glu Asn Leu Gln 245 250 255 Ala Ser Leu Ser Leu Cys Ala Pro Ala Ile Gly Gln Ala Ala Gly Arg 260 265 270 Ala Ala Phe Thr Leu Glu Ala Gly Ala Glu Leu Asp Ala His Val Glu 275 280 285 Ala Tyr Arg Glu Ala Arg Glu Val Phe Val Asp Lys Leu Pro Glu Ile 290 295 300 Gly Leu Gly Thr Phe Ala Asp Pro Asp Gly Gly Leu Tyr Leu Trp Val 305 310 315 320 Asp Val Ser Ala Tyr Thr Asp Asp Ser Glu Glu Trp Val Leu Arg Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Ala Gly Val Ala Val Ala Pro Gly Val Asp Phe Asp Pro 340 345 350 Glu Glu Gly His Lys Trp Ile 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Asp 210 215 220 Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile 225 230 235 240 Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu 245 250 255 Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn 260 265 270 Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu 275 280 285 Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser 290 295 300 Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg 305 310 315 320 Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu 325 330 335 Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn 340 345 350 Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr 355 360 365 Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro 370 375 380 Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala 385 390 395 400 Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys 405 410 415 Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His 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625 630 635 640 Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala 645 650 655 Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln His Met Asp Gly His 660 665 670 Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro 675 680 685 Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg 690 695 700 Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile 705 710 715 720 Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val 725 730 735 Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr 740 745 750 Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala 755 760 765 Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn 770 775 780 Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala 785 790 795 800 Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala 805 810 815 Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val 820 825 830 Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro 835 840 845 Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr 850 855 860 Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val 865 870 875 880 Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser 885 890 895 Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Pro Thr Ser 900 905 910 Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu 915 920 <210> 8 <211> 437 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Corynebacterium sp. citrate synthase variant <400> 8 Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu 1 5 10 15 His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu 20 25 30 Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu 35 40 45 Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys 50 55 60 Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr 85 90 95 Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe 100 105 110 Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser 115 120 125 Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala 130 135 140 Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro 145 150 155 160 Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys 165 170 175 Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro 180 185 190 Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg 195 200 205 Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met 210 215 220 Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln 225 230 235 240 Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn 245 250 255 Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu 260 265 270 His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys 275 280 285 Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn 290 295 300 Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Ile Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys 305 310 315 320 Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile 325 330 335 Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu 340 345 350 Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr 355 360 365 Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe 370 375 380 Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly 385 390 395 400 Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn Lys Ile 405 410 415 Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val 420 425 430 Pro Arg Glu Glu Arg 435 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttcgagctcg gtacccggtc tagagcactt tcgctcgcac c 41 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gatttgaaaa gcgcatcaga aacatcccag cgctac 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtagcgctgg gatgtttctg atgcgctttt caaatc 36 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaaacactat gatcccactt cgttcaaaag tcaccaccgt c 41 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gacggtggtg acttttgaac gaagtgggat catagtgttt c 41 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcatgcctgc aggtcgactc tagagcgtgt gcaacgccgt c 41 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gctcggtacc cggggatcct ctagaccgct tccttggctg cctgaagatg 50 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgcttggctt cacaagagac aagcct 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aggcttgtct cttgtgaagc caagca 26 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcctgcaggt cgacctagat ctagacctca tcagagataa gaacagcatc 50 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gctcggtacc cggggatcct ctagatactc cggtctgctt tatgcaggta 50 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 aactaaccta gtcgcttaag agacaagcct atctgc 36 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcagataggc ttgtctctta agcgactagg ttagtt 36 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gcctgcaggt cgacctagat ctagaaagtg ccacgagcat ttcatcagct 50 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gctcggtacc cggggatcct ctagataccg tccaaccggt actttgaacc 50 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ttgatcggcc acttccacac 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ggtgtggaag tggccgatca a 21 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gcctgcaggt cgacctagat ctagagatcg tcttcagaaa ggcgaccctc 50 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gctcggtacc cggggatcct ctagaaccgt ggcatcaagg acacctctga 50 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 agcttcttca ttgcgtgggt tg 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 caacccacgc aatgaagaag ct 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 aagcgtcagt gccttcatct g 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ccagatgaag gcactgacgc tt 22 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gcctgcaggt cgacctagat ctagaagatg gagtcaccgg tgcgctggaa 50 <210> 37 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gctcggtacc cggggatcct ctagaacctt tccctggaat tttttccttt 50 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tgtcccttga ggtgatttcc acacctcctg ttggaatg 38 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tccaacagga ggtgtggaaa tcacctcaag ggacaga 37 <210> 40 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gcctgcaggt cgacctagat ctagatgctg cgcggcaagc gccgtggatt 50 <210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gctcggtacc cggggatcct ctagaaccct gaagctgtca gttcctagca 50 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ccctttcaaa cacatttgtt c 21 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 cgaacaaatg tgtttgaaag gg 22 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gcctgcaggt cgacctagat ctagatgcgc ggtgtgcgta cgcagccagc 50 <210> 45 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gctcggtacc cggggatcct ctagatatgt gagcactggc tctaccgagt 50 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 aggtggagca ggtctgctcg tg 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cacgagcaga cctgctccac ct 22 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tgtccgaagc cgatgaggcg gac 23 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cgtccgcctc atcggcttcg gaca 24 <210> 50 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gcctgcaggt cgacctagat ctagagtcag agattacgag atcttccggt 50

Claims (15)

  1. 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제(dihydroxy-acid dehydratase)의 활성; 및 하기 (1) 내지 (3)에서 선택되는 어느 하나 이상의 조합을 갖는, L-발린 생산 미생물.
    (1) 감소된 트랜스아미나제 C(transaminase C)의 활성
    (2) 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)의 활성
    (3) 감소된 시트레이트 신타아제(citrate synthase)의 활성
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 감소된 트랜스아미나제 C의 활성을 갖는, 미생물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성을 갖는, 미생물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 강화된 다이하이드록시산 디하이드라타제의 활성; 및 감소된 시트레이트 신타아제의 활성을 갖는, 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 감소된 트랜스아미나제 C의 활성 또는 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제의 활성을 갖는, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다이하이드록시산 디하이드라타제는 ilvD 유전자에 의해 코딩되는, 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 트랜스아미나제 C는 avtA 유전자에 의해 코딩되는, 미생물
  8. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트 디하이드로게나아제는 aceE 유전자에 의해 코딩되는, 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 시트레이트 신타아제는 gltA 유전자에 의해 코딩되는, 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 약화된 피루베이트 디하이드로게나아제는 서열번호 3 의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 432번째 또는 435번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 감소된 시트레이트 신타아제는 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 241번째 또는 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 미생물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 L-발린 생산 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-발린의 생산방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-발린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, L-발린의 생산방법.
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