KR100614029B1

KR100614029B1 - Ｌ-발린의 미생물학적 제조 방법

Info

Publication number: KR100614029B1
Application number: KR1020017009864A
Authority: KR
Inventors: 에게링로타르; 삼허만
Original assignee: 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-21
Publication date: 2006-08-23
Also published as: DK1155139T3; EP1155139B2; WO2000050624A1; EP1155139A1; KR20010108172A; JP4638048B2; SK12052001A3; ES2197076T3; CZ20013037A3; PT1155139E; EP1155139B1; JP2002537771A; DE19907567B4; DE19907567A1; DK1155139T4; ATE236991T1; DE50001708D1; US7632663B1; SK285870B6; ES2197076T5

Abstract

본 발명은 미생물에서 디히드록시산 합성(ilvD) 활성 및/또는 ilvD 유전자 발현을 강화시키는 L-발린을 미생물적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 그 대안으로 또는 그것과 조합하여, 미생물에서 아세토히드록시산 신타아제(ilvBN) 활성 및 이소머리덕타제(ilvC) 활성 및/또는 ilvBNC 유전자 발현이 강화된다. 본 발명의 방법에 따라서, L-발린의 형성을 감소시키는 대사 경로내에 포함된 적어도 하나의 효소의 활성이 약화되거나 제거되는 미생물이 사용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 트레오닌 디히드라타제(ilvA) 유전자에서 결실 돌연변이 및/또는 판토텐산염 합성의 하나 이상의 유전자에서 결실 돌연변이를 가지는 미생물이 본 발명의 방법에 사용된다.

ilvA, ilvBN, ilvD, ilvC, L-발린

Description

Ｌ-발린의 미생물학적 제조 방법{METHOD FOR MICROBIALLY PRODUCING L-VALINE}

본 발명은 청구항 제 1 항 내지 제 13 항에 따른 L-발린(L-valine)의 미생물학적 제조 방법과 청구항 제 14 항 내지 제 17 항에 따른 형질전환 세포 및 미생물에 사용 가능한 방법에 관한 것이다.

아미노산 L-발린은 동물 사료, 인간 음식물 및 의학 분야에 사용되는 상업적 으로 의미있는 산물이다. 상기 이유로 인하여 L-발린의 제조 방법을 향상시키는 것은 중요하다.

발린은 적당한 미생물을 적합한 배양액에서 발효시켜서 화학적 합성 또는 생물학적 기술로 제조할 수 있다. 미생물에 의한 생물학적 제조의 장점은 D-발린이 없는 발린의 L-형태인 정확한 스테레오 이성체 형태를 만든다는 것이다.

대장균(escherichia coli), 세라티아 마르세스센스, 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 프래붐(Brevibacterium flavum) 또는 브레비박테리움 랙토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)과 같은 다양한 종류의 박테리아는 글루코스가 포함된 배양액에서 L-발린을 생산할 수 있다. 특허 US 5 658 766 에는 아미노아실-tRNA 합성효소내의 돌연변이를 통하여 대장균에서 L-발린의 생성을 증가시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 또한 WO 96 06926 에는 리폰산 영양요구성을 통하여 대장균이 있는 L-발린 생성을 증가시키는 것이 알려져 있다. EP 0 694 614 A1 에는 α-케토부터산에 대한 저항력을 가지고 글루코스가 포함된 배양액에서 L-발린, L-이소류신 또는 L-류신을 생산하는 대장균족이 알려져 있다.

EP 0 477 000 에는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움과 진화종의 돌연변이 유전자를 통하여 발린 저항성을 가지는 L-발린 생성을 향상시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 상기 특허에는 또한 β-플루오로피루베이트, β-클로로피루베이트, β-머캡토피루베이트 또는 트리메틸피루베이트와 같은 다양한 피루베이트 유사체에 대한 저항성을 가진 코리네박테리움 또는 브레비박테리움과 진화종에 의하여 L-발린 생성을 향상시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 나카야마 등의 논문(Nakayama et al., 1961, J. Gen. Appl. Microbiol. Jpn) 에는 돌연변이에 의한 영양요구주를 통하여 L-발린 축적을 향상시킬 수 있다는 것이 알려져 있다.

특허 EP 0 356 739 A1 에는 아세토히드록시산 신타아제(ilvBN, 도 1 참조)를 코드화하는 DNA 범위를 확대하여 플라스미드 pAJ220V3 를 사용하여 L-발린의 생성을 향상시키는 것이 알려져 있다.

본 발명은 특히 코리네형 박테리아를 사용한 L-발린의 미생물적 제조를 위한 새로운 기본 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 목적은 미생물에서의 디히드록시산 디히드라타제(ilvD) 활성 및/또는 ilvD 유전자 발현을 강화시킴으로서 달성하고자 한다. 상기에서는 미생물의 아세토히드록시산 신타아제(ilvBN) 및 이소머리덕타제(ilvC) 활성 및/또는 ilvBNC 유전자 발현을 강화시키게 된다. 본 발명에 따른 방법을 위해서는 L-발린 생성을 억제, 약화 또는 제거하는 대사에 관여하는 최소한 하나의 효소의 활성을 가진 미생물이 추가로 사용될 수 있다. 그래서 본 발명에 따른 방법에서는 트레오닌 디히드라타제(ilvA) 유전자에서 결손 돌연변이 및/또는 하나 이상의 판토텐산염 합성 유전자에서 결손 돌연변이를 가지는 미생물이 사용된다.

"발린" 또는 "L-발린" 의 개념에는 본 발명의 청구항에서 자유 산 뿐만 아니라 칼슘염, 나트륨염, 암모늄염 또는 칼륨염과 같은 염도 포함된다.

본 발명에서 "강화" 라는 개념은 상기에서 언급한 효소인 ilvD, ilvB, ilvN 및 ilvC 의 세포간 활성의 상승을 의미한다. 효소 활성을 높이기 위해서는 특히 미생물에서의 내인성 활성을 높이게 된다. 효소 활성은 예를 들면, 촉매 중심의 변화를 통하여 많은 기질을 사용하거나 효소 억제제의 작용을 중지시킴으로서 높일 수 있다. 또한 높은 효소 활성은 예를 들면, 유전자 확대 또는 효소 생물적 합성을 억제시키는 인자를 배제함으로서 효소 합성을 높이게 된다. 내인성 효소 활성은 본 발명에 있어서 주로 해당하는 내인성 유전자 돌연변이를 통하여 높아지게 된다. 상기 종류의 돌연변이는 예를 들면, UV 광선 또는 돌연변이 해소 화학물질과 같은 전통적인 방법 또는 결실, 삽입 및/또는 뉴클레오티드 교환과 같은 유전공학적 방법으로 발생시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 유전자 발현을 강화시키기 위해서는 유전자 복제수를 높이게 된다. 상기에서 유전자는 유전자 구조체 및 벡터에 삽입되고, 유전자에 삽입된 정상적 유전자 서열을 포함하고, 특히 이것은 유전자 발현을 강화시키게 된다. 결과적으로 미생물은 주로 해당하는 유전자 구조를 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰으로 형질전환된다.

발린바이오 합성 유전자의 강한 발현에 의하여 효소가 디히드록시산 디히드라타제로 코드화된 ilvD 는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 우수한 방법으로 L-발린을 생산하게 된다. 본 발명에 따라서 상기 유전자의 강화된 발현이외에도 효소가 아세토히드록시산 신타아제로 코드화된 ilvBN 유전자와 효소가 이소머리덕타제로 코드화되는 ilvC 유전자가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-발린을 잘 생성시키게 된다. L-발린 생성의 또 다른 향상은 모든 상기 유전자의 과발현을 통하여 코리네박테리움 글루타미쿰에서 이루어지게 된다. 유전자 또는 유전자 구조는 서로 다른 복제 수를 가지는 숙주 또는 플라스미드에 놓이거나 염색체에 삽입되거나 증폭될 수 있다.

유전자 발현은 유전자 복제 수를 높이거나 유전자 발현에 긍정적인 영향을 주는 조절 인자를 강화시킴으로서 더욱 높일 수 있다. 그래서 조절 인자 요소는 전사 수준에서 강화시킬 수 있으며, 특히 강화된 전사 신호에 사용된다. 또한 구조 유전자의 반대 방향에 위치하는 활성제와 조절 영역도 돌연변이시킬 수 있다. 동일한 방법으로 구조적 유전자의 반대방향에 삽입되는 발현 카세트도 작용한다. 감응성 지원을 통하여 발효성 L-발린이 생성되는 동안에 발현이 추가적으로 증가하게 된다. 상기 이외에도 또한 번역이 강화될 수 있으며, 이로 인하여 예를 들면 m-RNA 의 안정성도 향상된다. 또한 높은 활성을 가지는 해당 효소로 코드화되는 유전자도 사용될 수 있다. 또한 해당하는 유전자의 과발현은 배지 조성과 균주 가이딩을 변화시킴으로서 도달할 수 있다. 상기에 대한 내용은 마르틴 등 (Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), 구에레로 등(Guerrero et. al., Gene 138, 35-41 (1994)), 튜시야 및 모리나가(Bio-Technology 6, 428-430 (1998)), 아이크만스 등(Eikmanns, Gene 102, 93-98 (1991)), 유럽특허 EP 0,472,869, 미국 특허 US 4,601,893, 쉬바르체르 및 퓔러(Schwarzer and P hler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991), 라인샤이드 등(Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), 라바레 등(LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) 및 특허출원 WO 96/15246 과 같은 것에 알려져 있다.

유전자 발현을 강화시키기 위해서는 상기에 언급한 조치를 모두 가능하게 조합하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 방법에 사용 가능한 미생물은 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 멜라제, 전분, 셀룰로스 또는 글리세린과 에탄올로부터 L-발린을 제조할 수 있다. 이것들은 바실루스(Bacillus)속의 그람 양성 박테리아 또는 상기에서 언급한 코리네박테리움 속의 코리네형 박테리아 또는 아르트로 박테리아를 의미한다. 코리네박테리움속에서는 특히 이미 전문분야에서는 성능이 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미쿰이 아미노산을 생성하게 된다. 상기 종류에는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 브레비박테리움 프래붐 ATCC14067, 브레비박테리움 랙토페르멘툼 ATCC13869, 브레비박테리움 티오게니타리스 ATCC19240, 코리네박테리 움 메라세코라 ATCC17965 및 기타 다른 것이 속한다.

유전자 ilvD 를 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 다른 유전자로부터 단절시키기 위하여 유전자 은행을 삽입한다. 유전자 은행의 삽입에 대해서는 일반적으로 잘 알려진 교과서와 핸드북에서 얻을 수 있다. 예를 들면 빈나커(Winnacker)의 교과서인 유전자와 클론(Gene und Klone), 유전자공학 입문 (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) 또는 샘브룩(Sambrook) 등의 핸드북인 분자 클로닝(Molecular Cloning), 실험실 매뉴얼 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)과 같은 것들이 있다. 잘 알려진 유전자 은행은 벡터에 삽입된 코하라(Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)) 등의 E. coli K-12 stem W3110 이다. 배스(Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) 등은 E. coli K-12 NM554 (Raleigh et al., 1998, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575)에 삽입된 코스미드벡터 SuperCos I(Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Science USA, 84: 2160-2164)를 참고로 한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 은행에 대하여 설명하였다. 대장균에서 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자 은행을 제조하기 위해서는 pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) 또는 pUC19 (Norrander et al., 1983, Gene, 26: 101-106)와 같은 플라스미드도 사용할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자 은행을 제조하기 위해서는 pJC1(Cremer et al., Mol. Gen. Genet. (1990) 220: 3221-3229) 또는 pECM2 (J ger et al., J. Bacteriol. (1992) 174: 5462-5465)와 같은 플라스미드를 사용할 수 있다. 숙주로 는 제한 결함과 재배치 결함이 있는 특히 상기의 박테리아문이 적당하다. 상기에 대한 예를 들면 그랜트(Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) 등이 설명한 대장균 DH5αmcr 문 또는 리블(Liebl et al., FEMS Lett (1989) 65: 299-304) 등이 유리시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 R127 문이 있다.

최종적으로 유전자 은행은 형질전환(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580, 1983) 또는 일렉트로포레이션 (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347)을 통하여 지표 스템에 삽입된다. 지표 스템은 관심 대상인 유전자에서 영양요구성과 같은 결손 표현형을 생기게 하는 돌연변이인 것으로 나타낸다. 지표 스템과 돌연변이 개체는 개시된 원 또는 계통 모음에서 얻어지거나 경우에 따라서는 자체적으로 제조하여야 한다. 본 발명에 따른 범위에서는 디히드록시산 디히드라타제에 대하여 코드화한 ilvD 유전자가 없는 코리네박테리움 글루타미쿰 돌연변이 개체 R127/7이 분리된다. 예를 들면 ilvD 유전자와 같은 흥미 대상인 유전자를 운반하고 발현시키는 재결합 플라스미드가 있는 ilvD 돌연변이 개체 R127/7과 같은 것은 지표 스템이 형질전환된 후에 지표 스템은 예를 들면 L-발린 부족 현상과 같은 해당 물성이 달라진 것을 나타내게 된다.

제조된 분리 유전자와 DNA-단편은 생거 (Sanger et al., Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977) 등의 방법과 같이 서열결정을 정하여 분석한다. 알려진 유전자에 대한 동일성의 정도는 예를 들면 GenBank (Benson et al., 1998, Nucleic Acids Research, 26: 1-7)와 같은 데이터 뱅크에 실려 있는 개시된 방법을 사용하여 분석된다 (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410).

상기 방법에서 유전자 ilvD 를 위하여 코드화된 코리네박테리움 글루타미쿰의 DNA 서열이 포함되고 본 발명의 SEQ ID NO:1 구성부분이 된다. 또한 상기에서 설명한 방법을 사용한 상기 DNA 서열로부터 해당 효소의 아미노산 서열이 유도된다. SEQ ID NO:2 에서 ilvD 유전자 생성물의 아미노산 서열, 즉 디히드록시산 디히드라타제가 얻어진다.

얻어진 특정 유전자는 최종적으로 단독 또는 조합하여 다른 것과 함께 적당한 미생물에 발현시켜 사용될 수 있다. 유전자를 발현시키는 기존의 알려진 방법은 발현 신호를 사용하여 삽입될 수 있는 플라스미드 벡터를 사용하여 증폭하는 것으로 구성된다. 플라스미드 벡터로서는 해당하는 미생물에서 응답할 수 있는 것이 문제가 된다. 코리네박테리움 글루타미쿰을 위해서는 예를 들면, 벡터 pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) 또는 pZ8-1 (유럽 특허 0 375 889) 또는 pEKEx2 (Eikmanns et al., Mocrobiology 140: 1817-1828 (1994) 또는 pECM2(J ger et al., Journal of Bacteriology 174(16): 5462-5465 (1992)) 가 문제된다. 상기 종류의 플라스미드를 예를 들면, pJC1ilvD, pECM3ilvBNCD 및 pJC1ilvBNCD 가 있다. 상기 플라스미드는 유전자 ilvD 및 공동의 유전자 ilvD 를 유전자 ilvB, ilvN 과 ilvC 로 이동시키는 대장염/코리네박테리움 글루타미쿰 전이 벡터이다.

본 발명의 발명자는 또한 유전자 ilvB, ilvN 과 ilvC 를 단독 또는 조합하여 상기 미생물에서 유전자의 강화가 잘 작용하도록 하고 아미노산의 합성을 감소시키 는 L-이소류신이 생성되는 것을 발견하였다. 상기의 감소된 합성은 ilvA 유전자를 제거함으로서 이루어질 수 있고, L-이소류신 합성에 특정된 효소를 위하여 트레오닌디히드라타제(ilvA)를 코드화한다.

준비된 재조합 DNA-기술을 이용하여 결실이 이루어진다. 상기 방법을 사용함으로서 예를 들면, 트레오닌디히드라타제용으로 코드화된 ilvA 유전자를 염색체에서 제거할 수 있다. 상기에 적합한 방법에 대해서는 쉐퍼 (Schaefer et al., Gene (1994) 145: 69-73) 등과 또는 링크(Link et al., Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237) 등도 설명하였다. 또한 유전자의 부분만도 결실될 수 있거나, 트레오닌디히드라타제 유전자의 돌연변이 단편도 교환될 수 있다. 결심됨으로서 트레오닌디히드라타제 활성이 손실된다. 상기 종류의 돌연변이 개체는 ilvA 유전자에서 결실되는 코리네박테리움 글루타미쿰 스템 ATCC13032ㅿilvA이다.

본 발명의 발명자는 또한 D-판토텐산염의 감소된 합성을 가지고 더 조합, 주로 ilvA 유전자를 더 제거하고 조합하여 유전자 ilvD, ilvB 와 ilvC 가 강화되고, 미생물에서 L-발린 생성에 잘 작용하며, 그래서 예를 들면, panB 및 panC 유전자에서 결실되는 것을 발견하였다. 감소된 D-판토텐산염 합성효소에 해당하는 바이오 합성 효소와 그 활성을 약화 또는 제외시킴으로서 달성된다. 상기에서 예를 들면, 효소 케토판토산염히드록시메틸트랜스퍼라제 (EC 2.1.2.11), 케토판토산염리덕타제, 판토텐산염리가제(EC 6.3.2.1) 및 아스파르트산염디카르복실라제(EC 4.1.1.11)가 문제된다. 효소와 그 활성을 제거 또는 약화시키는데는 돌연변이 발생법이 가능하다.

상기에는 예를 들면 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 화학적 반응제, 또는 UV 광선을 돌연변이 발생에 사용하는 방법이 속하며, 최종적으로 D-판토텐산염이 부족한 원하는 미생물을 모색하게된다. 돌연변이 유발과 돌연변이 개체 모색의 방법은 일반적으로 알려져 있고, 밀러(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, 대장균 및 관련된 박테리아(Cold Spring Harber Laboratory Press, 1992))의 책 또는 미국 박테리아 학회(Washington D.C., USA, 1981)의 "일반 박테리아학의 방법 매뉴얼" 에 알려져 있다.

또한 여기에는 재조합 DNA 기술도 속한다. 상기 방법을 사용하여 케토판토산염히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토텐산염리가제, 케토판토인산리덕타제 또는 아스파르트디카르복실라제를 위하여 코드화한 유전자 panB, panC, panE 및 panD 는 단독 또는 함께 염색체에서 결실된다. 상기에 대한 적합한 방법은 쉐퍼(Sch fer et al., Gene (1994) 145: 69-73) 또는 린크(Link et al., Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237)에 설명되어 있다. 또한 유전자의 부분만도 결실될 수 있거나, 케토판토산염히드록시메틸트랜스퍼라제, 판토텐산염리가제, 케토판토인산리덕타제 또는 아스파르트디카르복실라제의 돌연변이 단편도 교환될 수 있다. 결실 또는 교환시킴으로서 각 효소 활성이 손실 또는 감소된다. 상기 종류의 돌연변이 개체는 panBC 오페론에서 결실되는 코리네박테리움 글루타미쿰 스템 ATCC13032 ㅿpanBC 이다.

본 발명에 따라서 제조된 미생물은 연속 또는 불연속적으로 배치 공정(정량 배양) 또는 공급 배치(유입 공정) 또는 반복된 공급 배치 공정(반복 유입공정)에서 L-발린 생산을 위하여 배양시킬 수 있다. 기존의 알려진 배양 방법에 대한 요약은 히밀(Chmiel)의 교과서(Bioprozesstechnik 1. 바이오 공정 기술 입문, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 또는 스토르하스(Storhas)의 교과서 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig /Wiesbaden, 1994)에 설명되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적당한 방법으로 각각의 미생물에 대한 요구에 적당하여야 한다. 다양한 미생물의 배양 배지에 대한 설명은 미국 박테리아 학회 (Washington D.C., USA, 1981)의 핸드북 "일반 박테리아학의 방법 매뉴얼"에 알려져 있다. 탄소원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 멜라제, 전분, 셀루로스와 같은 당분과 탄수화물, 콩기름, 해바라기 기름, 땅콩 기름 및 야자 기름과 같은 기름과 지방, 팔미틴산, 스테아린산 및 리놀산과 같은 알콜을 비롯하여 초산과 같은 유기질 산이 사용된다. 상기 물질은 단독 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 추출물, 콩가루 및 요소와 같은 유기질 질소 함유 화합물 또는 암모늄술페이트, 암모늄클로라이드, 암모늄포스페이트, 암모늄카보네이트 및 암모늄니트레이트와 같은 유기 화합물이 사용될 수 있다. 질소원은 단독 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 인산원으로는 칼륨디히드로젠포스페이트 또는 디칼륨히드로젠포스페이트 또는 적당한 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 성장에 필수적인 마그네슘술페이트 또는 철 기질과 같은 또 다른 금속염을 가지고 있어야 한다. 결과적으로 상기의 언급된 재료 이외에 아미노산과 비타민과 같은 핵심적인 성장제가 추가로 사용될 수 있다. 언급된 사용 재료는 배양액에 일회성의 형태로 넣을 수 있거나 배양 과정에 적당한 방법으로 넣을 수 있다.

배양액의 pH 조절을 위하여 적당한 방법으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 넣게 된다. 거품 생성을 조절하기 위하여 지방산 폴리글리콜에스테르와 같은 거품 방지제를 사용할 수도 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여 예를 들면 항생물질과 같이 배지에 적합한 선택적으로 작용하는 물질을 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여 공기와 같은 산소 또는 질소 함유 가스 혼합물을 배양액에 넣는다. 배양액의 온도는 일반적으로 20℃ 내지 50℃, 주로 25℃ 내지 45℃에 놓인다. 배양은 L-발린이 최대로 생성될 때까지 계속 진행된다. 상기 목표는 일반적으로 10 시간 내지 160 시간 내에 도달한다.

생성된 L-발린의 농도는 기존의 알려진 방법 (Jones과 Gilligan (1983) Journal of Chromatography 266: 471-482) 을 사용하여 정할 수 있다.

본 발명은 다음과 같은 실시 예를 사용하여 더욱 자세히 설명된다.

실시예 1 : 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 디히드록시산 디히드라타제용으로 코드화된 ilvD 유전자의 클로닝, 서열결정 및 발현.

1. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 ilvD 돌연변이 개체의 분리.

스템 코리네박테리움 글루타미쿰 R127(Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334)을 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘을 사용하여 돌연변이 가 발생되도록 하였다 (Sambrook et al., Molecular cloning, A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). 상기에는 하룻밤 동안 250 l N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘이 흡수된 코리네박테리움 글루타미쿰 5 ml가 사용되고 30℃와 200Upm에서 30분 동안 배양시켰다(Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: 326). 세포는 최종적으로 살균 NaCl 용액(0.9%)으로 세척하였다. 15g/l 한천 플레이트가 있는 최소 배지 플레이트 CGXII에 복제 처리하여(Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175: 5595-5603) L-발린, L-이소류신 및 L-류신(각각 0.1g/l)을 첨가할 때만 성장하는 돌연변이 개체를 분리된다.

디히드록시산 디히드라타제의 효소 활성은 이들 돌연변이 개체의 원료 추출물에서 구하였다. 상기에서 클론은 60ml LB-배지에서 배양시키고 지수적으로 성장하는 상태에서 원심 분리시켰다. 세포 펠렛은 0.05M 인산 칼륨 완충액으로 한번 세척하고 동일한 완충액에 다시 현탁시켰다. 세포 처리액은 10분 동안 초음파 처리하였다(Branson0Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co., Danbury, USA). 최종적으로 세포 조각은 4℃에서 13000 rpm 으로 30분 동안 원심분리시켜서 분리해내고 잔류물은 원료 추출물로서 효소 시험에 사용하였다. 효소 시험의 반응물에는 0.2ml 0.25M Tris/HCl, pH 8, 0.05ml 원료 추출물과 0.15ml 65mM 알파,β-디히드록시-β-메틸발러레이트가 포함되었다. 시험물은 30℃에서 배양시키고, 10분, 20분 및 30분 후에는 각 200 l의 시편을 채취하고 이것의 케토메틸발러레이트 농도를 HPLC 분석을 사용하여 구하였다 (Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). 표 1에 나타난 것과 같이 스템 R127/7은 디히드록시산 디히드라타제 활성을 나타내지 않고, 그 반대로 이성질체 환원물 활성과 아세토히드록시산 신타아제 활성은 2 중 사슬 아미노산 합성물의 다른 효소로서 존재하였다.

2. 코리네박테리움 글루타미쿰의 ilvD 유전자의 클로닝

염색체 DNA는 Schwarzer와 Phler(Bio/Technology 9 (1990) 84-87)에서 설명한 것과 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 R127로부터 분리시켰다. 이것은 제한 효소 Sau3A(Boehringer Mannheim)과 함께 갈라졌으며 사카로스-밀도-구배-원심분리 (Sambrook et al., Moelecular cloring. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)에 의하여 분리되었다. 약 6-10kb의 단편 크기 범위를 가지는 부분은 벡터 pJC1(Cremer et al., Molecular and Gernal Genetics 220 (1990) 478-480)을 가지는 리간드 형성을 위하여 사용하였다. 벡터 pJC1은 여기에서 BamHI와 함께 선형화되고 인이 제거되었다. 이중의 5 ng는 염색체 DNA의 언급된 부분의 20 ng와 함께 떨어져 나가고 이로 인하여 돌연변이 개체 R127/7은 일렉트로포래이션(Haynes and Britz, FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334)에 의하여 형질전환되었다. 형질전환체는 2중 체인의 아미노산의 첨가없이 성장할 수 있 는 CGXII 한천 플레이트에서 성능을 측정하였다. 5000 개 이상 시험한 형질전환체는 복제 플레이팅과 2번 배양한 후에 30 ℃ 에서 8 개의 클론이 최소 배지 플레이트에서 성장하였다. 상기 클론으로부터 Schwarzer (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) 가 제안한 것과 같이 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 DNA의 제한 분석은 모든 8 개의 클론에는 이후에는 소위 pRV로 나타내는 동일한 플라스미드를 함유하고 있었다. 플라스미드는 4.3 kb의 삽입물을 가지고 그 성능에 대한 재형질전환을 통하여 ilvD 돌연변이 개체 R127/7을 보충하여 시험하였다. 서브클로닝을 통하여 돌연변이 개체 R127/7의 보충에 반드시 필요한 범위는 2.9 Scal/χhol 단편으로 제한되었다(도 2).

3. ilvD 유전자의 서열결정

2.9 kb Scal/χhol 단편의 핵산 서열은 Sanger등의 디데옥시 사슬 종결법에 따라서 실시하였다(Proceedings of the National of Science of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). 상기에는 자동-해독 서열결정 키트(Auto-Read Sequencing kit)를 사용하였다(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). 뉴클레오티드 서열은 프로그램 패키지 HUSAR(Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB)를 사용하여 분석하였다. 뉴클레오티드 서열은 ID SEQ NO:1 으로 표현되었다. 분석은 ilvD 유전자로 확인된 1836 염기쌍의 오픈 리딩(reading) 플레임에서 이루어지고 SEQ ID NO:2 로 표현되는 612 개의 아미노산의 폴리펩티드로 코드화되었다.

4. ilvD-유전자의 발현

플라스미드 pRV는 제한 효소의 생산자의 언급에 맞추어서 제한 효소 Scal과 χhol로 이해된다(Roche, Boehringer, Mannheim). 최종적으로 2.9kb ilvD 단편은 이온교환 기둥을 사용하여 분리시켰다(Quiagen, Hilden). 분리된 단편의 χhol 단면의 돌출된 말단부는 크레노(Klwnow) 폴리머로 메웠었다. 벡터 pJC1(Cremer et al., Mol. Gen. Genet (1990) 220: 478-480)은 PstI 단면, 경우에 따라서는 크레노 폴리머로 처리하였고, 최종적으로 단편과 벡터가 연결된다. 리간드 합성을 사용하여 E. coli 스템 DH5αmcr(Grant et al., Proceedings of the National Sciences of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649)가 형질전환되었다(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580). 클론의 플라스미드 제조(Sambrook et al., Moelecular cloring. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)를 통하여 재조합된 플라스미드 pJC1ilvD를 포함하고 있는 클론이 인지되었다. 상기 플라스미드를 사용하여서 Haynes(1989, FEMS Microbiol. Lett. 61: 329-334)가 설명한 것과 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 일렉트로포레이션 방법으로 형질전환시켰다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032ㅿpJC1과 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032ㅿ pJC1ilvD로부터 최종적으로 ilvDdp 의하여 코드화된 디히드록시산 디히드라타제 활성도가 구해졌다. 여기에서 클론은 60ml LB-배지에서 배양시키고 지수적으로 성장하는 단계에서 원심분리시켰다. 세포 펠렛은 0.05M 인산 칼륨 완충액으로 한번 세척하고 동일한 완충액에 다시 현탁시켰다. 세포 처리액은 10분 동안 초음파 처리하였다(Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co., Danbury, USA). 최종적으 로 세포 조각은 4℃에서 13000 rpm 으로 30 분 동안 원심분리시켜서 분리해내고 잔류물은 원료 추출물로서 효소 시험에 사용하였다. 효소 시험의 반응물에는 0.2ml 0.25M Tris/HCl, pH 8, 0.05ml 원료 추출물과 0.15ml 65mM α, β-디히드록시-β-메틸발러레이트가 포함되었다. 시험물은 30℃에서 배양시키고, 10분, 20분 및 30분 후에는 각 200 l의 시편을 채취하였고 이것의 케토메틸발러레이트 농도를 HPLC 분석을 사용하여 구하였다(Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). 표 2 에서와 같이 스템 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032ㅿpJC1ilvD은 대조 스템과는 반대로 디히드록시산 디히드라타제 활성도가 증가하는 것을 나타내고 있다.

실시예 2. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 ilvA 결실 돌연변이 개체의 구성.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 로부터 ilvA 유전자의 내부 결실은 쉐퍼(Sch fer et al., Gene 145: 69-73 (1994))가 제시한 시스템을 사용하여 실시하였다. 비활성 벡터 pK19mobsacBㅿilvA 를 구성하기 위하여 EcoRI-단편의 벡터 pBM21 (M ckel et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 833-842) 에 놓인 ilvA 유전자로부터 내부 241 bp BgIII-단편이 제거된다. 여기에서 벡터는 BgIII으로 잘리도록 하고, 한천 겔 전기영동법으로 ilvA 내부 BgIII-단편을 분리시킨 후에 재연결되도록 하였다. 최종적으로 벡터로부터 불완전한 유전자는 EcoRI-단편으로서 분리되도록 EcoRI로 선형화시킨 벡터 pK19mobsacB(Sch fer 1994, Gene 145: 69-73) 에 연결되도록 하였다. 얻어진 비활성 벡터 pK19mobsacBㅿilvA는 형질전환시켜서 E. coli 스템 S17-1에 삽입시켰고(Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) 염색체 결합마다 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 에 따라 전이시켰다(Sch fer et al., 1990, Journal of Bacteriology 172: 1663-1666). 카나마이신 저항성 클론은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 얻어지고, 여기에서 비활성 벡터는 게놈에 통합 삽입된다. 벡터의 결실을 선택하기 위하여 카나마이신 저항성 클론을 15g/l 한천, 2% 글루코스/10% 사카로스가 있는 사카로스 함유 LB-배지 (Sambrook et al., Moelecular cloring. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)에 펼쳐지도록 하고 2 번째 재조합에 의하여 벡터를 다시 손실되게 하였다(J ger et al., 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). 최소 배지 플레이트(15g/l 한천이 있는 배지 CGXII(Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-5603))에 미생물을 과량 넣고 2mM L-이소류신을 사용 또는 사용하지 않거나 50 g/ml 카나마이신을 사용 또는 사용하지 않음으로서 36 클론이 분리되고, 벡터를 제거함으로서 카나마이신이 감응적으로되고 이소류신이 변이체(영양요구성)로 되었으며, 상기에서 불완전한 ilvA 유전자( ilvA-Allen)은 게놈에 삽입되었다. 스템은 ATCC13032ㅿilvA로 나타내며 계속 사용 하게 된다.

실시예 3. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 판토텐산염 생합성 panB 및 panC 유전자의 클로닝.

오페론의 클로닝.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA는 분리되었으며 제한 내부 핵산분해효소 Sau3A 를 사용하여 절단된다. 영양학적으로 분리된 후에 DNA-단편은 3 내지 7 kb 및 9 내지 20 kb 의 크기 범위에서 추출되었고 다음에 이어지는 단일 BamHI 에서 벡터 pBR322 의 인터페이스는 연결되었다. 삽입 클론은 10 g/ml 테트라사이클린으로 LB 플레이트에 과량의 미생물을 넣은 후에 테트라사이클린 활성도에 의하여 분리된다. 혼합된 클론으로부터 플라스미드를 제조 (Sambrook et al., Molecular cloring. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)함으로서 9 내지 20 kb 의 삽입 크기를 가지는 각각 400 플라스미드가 얻어지는 8 개의 플라스미드 혼합체와 3 내지 7 kb 의 삽입 크기를 가지는 각각 500 플라스미드가 얻어지는 9 개의 플라스미드 혼합체가 분리되었다. E. coli panB 돌연변이 개체 SJ2(Cronan et al., 1982, J. Bacteriol. 149: 916-922)는 이들 유전자 은행과 함께 일렉트로포레이션(Wehrmann et al., 1994, Microbiology 140: 3349-3356)에 의하여 형질전환되었다. 형질전환체는 CGXII-배지(J. Bacteriol. (1993) 175: 5595-5603)에 직접 더해진다. 판토텐산염 공급업이 성장 가능한 클론으로부터 플라스미드-DNA가 분리되고(Sambrook et al. 1989) 재형질전환에 의하여 D-판토텐산염 부족을 증명하는 8개의 클론이 얻어졌다. 8개의 플라스미드를 사용하여 제한 을 기입하였다. 아래에서는 pUR1으로 언급되는 조사된 벡터는 9.3kb 크기의 삽입을 얻었다(도 3). E. coli panC 돌연변이 개체 DV39(Vallari et al., 1985, J. Bacteriol. 164: 136-142)의 형질전환은 벡터 pUR1이 이들 돌연변이 개체의 panC 결핍을 보충할 수 있는 위치에 있다는 것을 나타내었다. pUR1의 삽입에 대한 2.2kb 크기의 단편은 Sanger 등의 디데옥시-사슬-종결법에 따라서 서열결정되었다 (Proc. Natl Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463-5467). 영양학적 분석은 Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Schweden)의 자동 레이저-형광 서열기(A.L.F.)를 사용하였다. 얻어진 뉴클레오티드 서열은 프로그램 패키지 HUSAR(Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB)를 사용하여 분석하였다. 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3 로 표현된다. 분석은 2 개의 오픈 리딩 플레임에 의하여 인지되었다. 오픈 리딩 플레임에는 813 염기쌍이 삽입되고 다른 미생물로부터 이미 알려진 panB 유전자에 대하여 높은 균일성을 나타내었다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 얻어진 panB 유전자는 271 아미노산의 폴리펩티드용으로 코드화된다(SEQ ID No. 4 참고). 2 번째의 오픈 리딩 플레임에는 837 개의 염기쌍이 삽입되고 다른 미생물로부터 이미 알려진 panC 유전자에 대하여 높은 균일성을 나타내었다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 얻어진 panC 유전자는 279 아미노산의 폴리펩티드용으로 코드화된다(SEQ ID No. 5 참고).

실시예 4. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 panBC 결실 돌연변이 개체의 구성.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 ilvA 의 게놈 panBC-단편은 쉐퍼(Sch fer et al., Gene 145: 69-73 (1994))가 제시한 시스템을 사용하여 실시하였다. 결실 벡터 pK19mobsacB panBC를 구성하기 위하여 Smal/Sall로 절단되었던 panbc, pUC18이 있는 3.95kb 크기의 Sspl/Sall 단편이 연결되었다. 최종적으로 1293 bp 크기의 EcoRV/NruI 단편이 panBC 유전자의 겹쳐진 범위로부터 제한 소화 및 재연결에 의하여 제거되었다. pK19mobsacB로 클로닝하기 위하여 2개의 프라임 5'-GAGAACTTAATCGAGCAACACCCCTG, 5'-GCGCCACGCCTAGCCTTGGCCCTCAA와 pUC18에서 결실된 panBC-범위의 폴리머 사슬 반응(PCR)이 확장되었으며, 그래서 0.5kbㅿpanBC 단편을 얻을 수 있었으며, 말단부에는 하나의 Sall 및 EcoRI 인터페이스가 얻어졌다. PCR은 Sambrook (Moelecular cloring. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)에 따라서 55℃의 어닐링 온도에서 실시되었다. 얻어진 단편은 미리 EcoRI/Sall로 절단되고 인산 알칼리로 처리된 벡터 pK19mobsac와 같이 연결되었다. 얻어진 비활성 벡터 pK19mobsacBㅿpanBC는 형질전환시켜서 E. coli 스템 S17-1에 삽입시켰고 (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) 염색체 결합마다 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 따라 전이시켰다 (Sch fer et al., 1990, Journal of Bacteriology 172: 1663-1666). 카나마이신 저항성 클론은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 얻어지고, 여기에서 비활성 벡터는 게놈에 삽입된다. 벡터의 결실을 선택하기 위하여 카나마이신 저항성 클론을 15g/l 한천, 2% 글루코스/10% 사카로스가 있는 사카로스 함유 LB-배지 (Sambrook et al., Moelecular cloring. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)에 펼쳐지도록 하고 2 번째 재조합에 의하여 벡터를 다시 손실되게 하였다(J ger et al., 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). 최소 배지 플레이트(15g/l 한천이 있는 배지 CGXII(Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-5603))에 미생물을 과량 넣고 2mM L-이소류신을 사용 또는 사용하지 않거나 50 g/ml 카나마이신을 사용 또는 사용하지 않음으로서 36 개의 클론이 분리되고, 벡터가 결실됨으로서 카나마이신이 감응성으로 되고 이소류신이 변이체(영양요구주)로 되었으며, 상기에서 불완전한 pan 유전자(ㅿpanBC-Allele)는 게놈에 삽입되었다. 스템은 ATCC13032ㅿpanBC로 나타내게 된다. 스템 ATCC13032ㅿpanBC를 얻기 위하여 상기 실시 예에서 상세히 설명한 것과 동일한 방법으로 panBC 결실도 ATCC13032ㅿilvA에 도입하였다.

실시예 5. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유전자 ilvD, ilvbn 및 ilvC 의 발현.

아세토히드록시산 신타아제(ilvBN)과 이소머리덕타제(ilvC)(Cordes et al., 1992, Gene 112: 113-116 및 Keilhauser et al., 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603) 및 디히드록시산 디히드라타제(ilvD)(실시예 1)의 유전자는 발현을 위하여 벡터 pECM3에 클로닝되었다. 벡터 pECM3는 pECM2(J ger et al., Journal of Bacteriology 174(16): 5462-5465 (1992))의 파생체이고, 상기 벡터는 카나마이신 저항성을 가지는 약 1 kbp BamHI/BgIII DNA-단편의 결실에 의하여 얻어진다.

벡터 pKK5(Cordes et al., 1992, Gene 112: 113-116)에는 유전자 ilvBNC 가 이미 벡터 pJC1(Cremer et al., Molecular and Gernal Genetics 220 (1990) 478-480)에서 클로닝되었다. 상기로부터 5.7kb XbaI-ilvbnc-단편이 분리되고 ilvD 유전자를 함유한 것과 함께 벡터 pRV의 3.1 kb XbaI 단편은 XbaI와 같이 선형화된 벡터 pECM3 에 삽입된다. 리간드 합성물은 여기에서 E. coli 스템 DH5αmcr로 형질전환 된다. 하나의 클론으로부터 플라스미드 pECM3ilvBNCD 가 얻어진다.

일렉트로포래이션(Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334)과 클로로암페니콜 저항체(3 g/ml)에서 선택하는 방법으로 플라스미드 pECM3ilvBNCD는 스템 ATCC13032ㅿilvA에 삽입되고 스템 ATCC13032ㅿilvA/pECM3ilvBNCD 가 얻어진다.

실시예 6. 다양한 코리네박테리움 글루타미쿰 스템을 가지는 L-발린의 생산.

발린 생성을 조사하기 위하여 표 4 에 나타낸 스템을 60ml의 브레인 하트 인퓨전 배지(brain Hearth Infusion medium)(Difco Laboratories, Detroit, USA)에서 30℃에서 14시간 동안 예비 배양시켰다. 최종적으로 세포은 0.9% NaCl 용액(부피비)으로 세척하고 이들 현탁액과 함께 각각 60ml CgXII 배지를 OD600 0.5가 되도록 넣었다. 배지는 Keilhauser(Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603)가 제시한 배지와 동일하였다. ilvA 스템을 배양시키기 위하여 배지에는 250mg/l L-이소류신을 추가하였다. 이것들을 표 3에 나타내었다.

48 시간동안 배양시킨 후에 시편을 채취하여서 세포을 원심분리하고 잔류물을 여과시켰다. 잔류물의 L-발린 농도는 존과 길링갠(Jones and Gilligan, J. Chromatogr. 266 (1983) 471-482)이 구한 것과 같이 o-프티디알디하이드가 있는 아미노산의 에비산 회전체가 삽입된 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 구하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

<110> Forschungszentrum Juelich GmbH <120> Valinherstellung <130> P14PCT <140> PCT/EP 00/01405 <141> 2000-02-21 <150> 199 07 567.0 <151> 1999-02-22 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2952 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 agtacttgga gcgccaaaag gcactgggca agccagttca gttgaacttc gatgacgaca 60 ccgatgggaa tacaacacaa acagaaagcg ttgaatccca agagaccgga caagccgcgt 120 ctgaaacctc acatcgtgat aaccctgcgt cacagcacta gagtgtaata agccgtccga 180 accaaaggtc cacacctctg cacgagtaga agctcaccca agttttcaaa gtgccgttga 240 ttcttgacaa ccacccgccg ctctttagag cagatttgaa aagcgcatca tgatcccact 300 tcgttcaaaa gtcaccaccg tcggtcgcaa tgcagctggc gctcgcgccc tttggcgtgc 360 caccggcacc aaggaaaatg agttcggcaa gccaattgtt gccatcgtaa actcctacac 420 ccagttcgtg cccggacacg ttcaccttaa gaacgtcggc gatattgtgg cagatgcagt 480 gcgcaaagcc ggtggcgttc caaaggaatt caacaccatc gtcgatgacg gcatcgccat 540 gggacacggc ggcatgctgt actccctgcc atcccgtgaa atcatcgccg actccgtcga 600 atacatggtc aacgcacaca ccgccgacgc catggtgtgt 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Tyr Thr Gln Phe Val Pro 35 40 45 Gly His Val His Leu Lys Asn Val Gly Asp Ile Val Ala Asp Ala Val 50 55 60 Arg Lys Ala Gly Gly Val Pro Lys Glu Phe Asn Thr Ile Val Asp Asp 65 70 75 80 Gly Ile Ala Met Gly His Gly Gly Met Leu Tyr Ser Leu Pro Ser Arg 85 90 95 Glu Ile Ile Ala Asp Ser Val Glu Tyr Met Val Asn Ala His Thr Ala 100 105 110 Asp Ala Met Val Cys Ile Ser Asn Cys Asp Lys Ile Thr Pro Gly Met 115 120 125 Leu Asn Ala Ala Met Arg Leu Asn Ile Pro Val Val Phe Val Ser Gly 130 135 140 Gly Pro Met Glu Ala Gly Lys Ala Val Val Val Glu Arg Val Ala His 145 150 155 160 Ala Pro Thr Asp Leu Ile Thr Ala Ile Ser Ala Ser Ala Ser Asp Ala 165 170 175 Val Asp Asp Ala Gly Leu Ala Ala Val Glu Arg Ser Ala Cys Pro Thr 180 185 190 Cys Gly Ser Cys Ser Gly Met Phe Thr Ala Asn Ser Met Asn Cys Leu 195 200 205 Thr Glu Ala Leu Gly Leu Ser Leu Pro Gly Asn Gly Ser Thr Leu Ala 210 215 220 Thr His Ala Ala Arg Arg Ala Leu Phe Glu Lys Ala Gly Glu Thr Val 225 230 235 240 Val Glu Leu Cys Arg Arg Tyr Tyr Gly Glu Glu Asp Glu Ser Val Leu 245 250 255 Pro Arg Gly Ile Ala Thr Lys Lys Ala Phe Glu Asn Ala Met Ala Leu 260 265 270 Asp Met Ala Met Gly Gly Ser Thr Asn Thr Ile Leu His Ile Leu Ala 275 280 285 Ala Ala Gln Glu Gly Glu Val Asp Phe Asp Leu Ala Asp Ile Asp Glu 290 295 300 Leu Ser Lys Asn Val Pro Cys Leu Ser Lys Val Ala Pro Asn Ser Asp 305 310 315 320 Tyr His Met Glu Asp Val His Arg Ala Gly Arg Ile Pro Ala Leu Leu 325 330 335 Gly Glu Leu Asn Arg Gly Gly Leu Leu Asn Lys Asp Val His Ser Val 340 345 350 His Ser Asn Asp Leu Glu Gly Trp Leu Asp Asp Trp Asp Ile Arg Ser 355 360 365 Gly Lys Thr Thr Glu Val Ala Thr Glu Leu Phe His Ala Ala Pro Gly 370 375 380 Gly Ile Arg Thr Thr Glu Ala Phe Ser Thr Glu Asn Arg Trp Asp Glu 385 390 395 400 Leu Asp Thr Asp Ala Ala Lys Gly Cys Ile Arg Asp Val Glu His Ala 405 410 415 Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Val Val Leu Arg Gly Asn Ile Ser Pro 420 425 430 Asp Gly Ala Val Ile Lys Ser Ala Gly Ile Glu Glu Glu Leu Trp Asn 435 440 445 Phe Thr Gly Pro Ala Arg Val Val Glu Ser Gln Glu Glu Ala Val Ser 450 455 460 Val Ile Leu Thr Lys Thr Ile Gln Ala Gly Glu Val Leu Val Val Arg 465 470 475 480 Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Gly Pro Gly Met Gln Glu Met Leu His Pro 485 490 495 Thr Ala Phe Leu Lys Gly Ser Gly Leu Gly Lys Lys Cys Ala Leu Ile 500 505 510 Thr Asp Gly Arg Phe Ser Gly Gly Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly His 515 520 525 Val Ser Pro Glu Ala Ala His Gly Gly Val Ile Gly Leu Ile Glu Asn 530 535 540 Gly Asp Ile Val Ser Ile Asp Val His Asn Arg Lys Leu Glu Val Gln 545 550 555 560 Val Ser Asp Glu Glu Leu Gln Arg Arg Arg Asp Ala Met Asn Ala Ser 565 570 575 Glu Lys Pro Trp Gln Pro Val Asn Arg Asn Arg Val Val Thr Lys Ala 580 585 590 Leu Arg Ala Tyr Ala Lys Met Ala Thr Ser Ala Asp Lys Gly Ala Val 595 600 605 Arg Gln Val Asp 610 <210> 3 <211> 2164 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 gcttcggggt accaattcct ttaagaacca tcagatcaat ctgttgtaca ttctcggcca 60 gattcagctt ttcggtaagg acgaaacact ttcacttgaa tcggcagcaa agtttcttaa 120 agtttctaag gcaactgcaa cgaggtattt tagaactctc cgagaaatgg 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cggcgtgcgc ttggatcacc tggaaattgt cgatccagcc accctcgaac cattagaaat 1920 cgacggcctg ctcacccaac cagcgttggt ggtcggcgcg attttcgtgg ggccggtgcg 1980 gttgatcgac aatatcgagc tctagtacca accctgcgtt gcagcacgca gcttcgcata 2040 acgcgtgctc agctcagtgt ttttaggtgc gcggtgcgga tcggaaccgg gagttggcca 2100 ctgcggtggc gtggcctcac ccgacagcgc ccatgccgcc tgacgagctg cacccaacgc 2160 caca 2164 <210> 4 <211> 271 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Pro Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe 1 5 10 15 Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu 35 40 45 Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr 50 55 60 Leu Ser Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr 65 70 75 80 Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr 85 90 95 Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met 100 105 110 Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile 115 120 125 Ala Gln Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly 130 135 140 His Ile Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val 145 150 155 160 Val Gln Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg 165 170 175 Ala Leu Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro 180 185 190 Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile 195 200 205 Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln 210 215 220 Asp Ala Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu 225 230 235 240 Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile 245 250 255 Ala Asp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe 260 265 270 <210> 5 <211> 279 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His 1 5 10 15 His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly 20 25 30 His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val 35 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Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg 260 265 270 Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu 275

Claims

미생물에서 디히드록시산 디히드라타제(ilvD) 활성 또는 ilvD 유전자 발현을 강화시켜서 L-발린을 미생물학적으로 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 미생물에서 추가적으로 아세토히드록시산 신타아제 (ilvBN) 활성 및 이소머리덕타제(ilvC) 활성 또는 ilvBNC 유전자 발현을 강화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 미생물에서의 내인성 ilvD 활성 또는 ilvBNCD 활성을 높이는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 내인성 ilvD-유전자 또는 ilvBNCD-유전자 돌연변이에 의해서 높은 활성을 가진 적합한 효소를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전자 복제 수를 높여서 ilvD- 유전자 발현 또는 ilvBNCD 유전자 발현을 강화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 유전자 복제 수를 높이기 위하여 유전자 구조체에 ilvD 유전자 또는 ilvBNCD 유전자를 삽입하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, ilvD 유전자 또는 ilvBNCD 유전자를 함유한 유전자 구조체로 미생물을 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, L-발린 생성을 감소시키는 대사에 관여하는 적어도 하나의 효소 활성이 약화 또는 제거된 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, L-이소류신의 합성에 관여하는 효소 트레오닌디히드라타제(ilvA)의 활성을 약화 또는 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, D-판토텐산염의 합성에 특이적으로 관여하는 하나 이상의 효소 활성이 약화 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 효소 케토판토산염히드록시메틸트랜스퍼라제(pan B) 또는 효소 판토텐산염리가제(panC)의 활성이 약화 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
ilvD 유전자 또는 ilvBNCD 유전자를 함유한 유전자 구조체로 형질전환된 미생물에 있어서, D-판토텐산염의 합성에 특이적으로 관여하는 하나 이상의 효소 활성이 약화 또는 제거된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제 13 항에 있어서, 효소 케토판토산염히드록시메틸트랜스퍼라제(pan B) 또는 효소 판토텐산염리가제(panC)의 활성이 약화 또는 제거된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, L-이소류신의 합성에 관여하는 효소 트레오닌디히드라타제(ilvA)의 활성이 약화 또는 제거된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
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