KR101251540B1

KR101251540B1 - Ｌ-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 ｗ 균주 및 이를 이용한 ｌ-발린의 제조방법

Info

Publication number: KR101251540B1
Application number: KR1020100098300A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박진환
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2013-04-08
Also published as: KR20120036555A

Abstract

본 발명은 L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 W 균주 및 이를 이용한 L-발린의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)가 제거되어 있는 L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 W 균주 및 이를 이용한 L-발린의 제조방법에 관한 것이다.
부위특위적 돌연변이 방법에 의해 수득된 본 발명에 따른 변이 대장균 W 균주는 분지쇄 아미노산의 하나인 L-발린을 고농도로 생성할 수 있어, L-발린의 산업적 생성 미생물로 유용하다.

Description

Ｌ-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 Ｗ 균주 및 이를 이용한 Ｌ-발린의 제조방법 {Mutant Escherichia coli W with Improved Productivity of L-valine and Method for Preparing It Using the Same}

본 발명은 L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 W 균주 및 이를 이용한 L-발린의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)가 제거되어 있는 L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 W 균주 및 이를 이용한 L-발린의 제조방법에 관한 것이다.

현재 대부분의 L-발린은 Corynebacterium glutamicum 과 Escherichia coli K-12 균주 기반으로 제작된 변이 균주로부터 생산되고 있는데, 이들 균주는 아세트산과 같은 부산물의 과 축적으로 인해 세포 성장이 저해되어 L-발린의 고농도 생산이 어렵다는 단점이 있다. 대장균 K-12 균주는 도 1에 나타난 듯이, L-발린에 대한 내성이 매우 낮아서 L-발린의 대량 생산에 한계가 있다. 이에, 부산물의 생성을 억제함으로써 세포성장을 용이하게 하여, 고농도의 L-발린 생산을 가능케 하는 균주의 개발이 요구되고 있다.

한편, 분지쇄 아미노산(Branched Chain Amino Acid)이란, 9종의 필수아미노산 중 발린, 류신 및 이소류신의 3종을 지칭하는 것으로, 대부분의 아미노산이 간장에서 대사되는데 비해, 분지쇄 아미노산은 주로 근육에서 대사되어 활동시에 에너지원으로서 이용되는 아미노산을 말한다.

현재 분지쇄 아미노산의 시장 점유율은 전체 아미노산 시장의 약 1%에 불과 하지만, 최근 분지쇄 아미노산이 활동시 근육의 유지 및 증량에 중요한 역할을 한다고 알려지면서 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 특히 L-발린의 경우 높은 환원력을 지니고 있어, 모돈의 비유 능력을 높인다고 알려지면서, 사료 성분으로 유용하게 쓰이고 있다. 또한 L-발린은 의약품의 전구체로 사용되는 고부가가치 아미노산으로서, 급격한 시장 성장이 예상된다. 현재까지 대부분의 L-발린은 Brevibacterium, Corynebacterium 또는 Serratia 등의 균주로부터 생성되어 왔으나, 최근 배양이 용이하고, 분자생물학적 기술이 발달한 대장균(Escherichia coli K-12)에서의 생성이 보고되고 있다. 특히, 일본 아지노모토 사에서는 무작위 돌연변이화 기법으로 L-발린에 내성을 갖는 균주를 선별하여 23.4g/ℓ의 L-발린 생성을 보고하였다 (US 6,737,255). 또한, 본 발명진들이 최근에 Escherichia coli K-12를 rational design 방법으로 개량하여 7.55g/L L-발린의 생산을 보고한 바 있다 (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:7797-7802, 2007; 한국특허 등록번호: 10-0832740).

또한, rational design 방법에 의한 L-발린 생성 미생물 제조가 최근 Corynebacterium glutamicum에서 보고 되었는데, aceE 유전자를 결실시키고, L-발린 생합성에 관여하는 오페론(ilvBNCE)을 증폭한 후, 회분식 발효를 통해 1.17 g/L/h의 L-발린을 생산하였다(Blombach et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:2079-2084, 2007). 또 다른 보고에서는 세가지 유전자(aceE, pqo, pgi)를 결실시키고, L-발린 생합성에 관여하는 오페론(ilvBNCE)을 증폭한 후, 회분식 발효를 통해 48 g/L 의 L-발린을 생산하였다는 내용이 발표되었다 (Blombach et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 79:471-479, 2008). 그러나 아직까지 대장균에서는 Corynebacterium glutamicum을 능가하는 L-발린의 생산성과 농도가 보고된 바 없다.

또한, 대장균 중 산업적으로 가장 많이 사용되는 K-12 균주의 경우, L-발린에 대한 내성이 매우 약해서 minimal inhibitory concentration(MIC)가 겨우 0.02mM에 불과하다고 알려져 있다 (Kutukova et al., FEBS Lett., 579:4629-4634, 2005). 따라서, 대장균 K-12 균주는 L-발린 생산에 매우 불리한 대사적 특징을 갖는다고 할 수 있다.

따라서, 당업계에서는 부산물의 과량 축적과 낮은 L-발린 내성 등, L-발린 생산에 저해가 되는 요소들을 모두 제거한 L-발린 고생성능을 갖는 미생물의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 L-발린 고생성능을 갖는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 대장균 W에서 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)를 제거시킬 경우, L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 제조할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 L-발린 고생성능 변이 대장균 W 균주 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 대장균 W 균주를 이용한 L-발린의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 W에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)를 제거시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제작되고, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)가 제거되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) ilvA가 약화 또는 결실; (b) lacI 유전자가 결실; (c) ilvB, ilvN ^mut , ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및 (d) 서열번호 23의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 배양한 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-발린의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 L-발린 고생성능을 가지는 대장균 W 기반 변이 균주는 기존의 대장균 K-12 균주 및 Corynebacterium glutamicum 균주 기반의 L-발린 생산균주보다 월등히 우수한 L-발린 생성능을 가지므로, 대장균 W 균주는 L-발린의 대량 생산을 위한 산업적 생성 미생물로 매우 유용하다고 할 수 있다.

도 1은 대장균 K-12 W3110 균주와 대장균 W 균주의 L-발린에 대한 내성 평가 결과를 나타낸 그래프이다(A:대장균 K-12, B: 대장균 W, ●:L-발린 첨가 안됨, ○:0.1mM, ▲:0.5mM,△: 2.0mM).
도 2는 대장균 K-12 W3110 균주와 대장균 W 균주의 ilvG 유전자의 염기서열을 비교함으로써, 대장균 W 균주의 ilvG 유전자에는 frameshift mutation이 없음을 나타낸 도면이다.
도 3은 대장균의 L-발린 생합성 경로 및 야생균주 W로부터 목적유전자만을 조작하여 L-발린 생성 미생물을 제작하는 과정을 나타낸 설명도이다.
도 4는 ilvBNCED 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pKBRilvBNCED의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 설명도이다.
도 5는 피드백 저해가 제거된 변이 AHAS I 을 함유한 pKBRilvBN^mutCED의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 설명도이다.
도 6은 Corynebacterium glutamicum과 Streptomyces cinnamonensis의 AHAS small subunit(encoded by ilvN), 그리고 대장균 K-12 W3110의 AHAS I small subunit(encoded by ilvN)의 N-terminal 부분의 아미노산 서열을 align 하여 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 ygaZH 유전자와 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pTrc184ygaZHlrp의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 설명도이다.
도 8은 L-발린 생성능을 갖는 대장균 W 변이 미생물인 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp) 균주의 회분식 발효 결과를 나타낸 것이다(●:L-발린, ○:OD₆₀₀, □:Glucose).
도 9는 AHAS I 에 존재하는 피드백 저해가 제거된 L-발린 고생성능을 갖는 대장균 W 변이 미생물인 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp) 균주의 회분식 발효 결과를 나타낸 것이다(●:L-발린, ○:OD₆₀₀, □:Glucose).

본 발명에서는 대장균 W에서 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, AHAS I(Acetohydroxy Acid Synthase Ⅰ)에 존재하는 피드백 저해를 제거시킬 경우, L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 제조할 수 있다는 사실을 확인하고자 하였다.

본 발명에서는, 부산물을 거의 축적하지 않고, 고성장이 가능하다고 알려진 대장균 W(Shiloach and Bauer, Biotechnol. Bioeng., 17:227-239, 1975)에 L-발린 내성 테스트를 수행한 결과, 대장균 W가 대장균 K-12 보다 L-발린에 100배나 높은 내성을 갖는다는 것을 새로이 확인하고, 대장균 W로부터 부위특이적 돌연변이화 방법에 의해 L-발린 고생성능을 갖는 미생물을 개발할 수 있음을 확인하였다.

즉, L-발린 생합성경로와 경쟁관계에 있는 pathway에 관여하는 유전자인 ilvA를 결실시키고, 또한, AHAS I(Acetohydroxy Acid Synthase Ⅰ)에 존재하는 피드백 저해를 제거함으로써, L-발린 고생성능 미생물을 제작하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 L-발린 생합성 유전자를 증폭하고 이의 지속적인 발현을 위해 lacI 유전자를 결실하였으며, 경쟁 pathway에 관여하는 유전자인 ilvA 유전자를 결실한 후, AHAS I 에 존재하는 피드백 저해를 제거하고, L-발린 엑스포터를 코딩하는 ygaZH 오페론과 L-발린 생합성에 유리한 global regulator인 Lrp를 코딩하는 lrp 유전자를 추가로 증폭하여 대장균 W L-발린 생산균주(E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp))를 제작하여 회분식 발효를 수행한 결과, L-발린 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)를 제거시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 ilvN(acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자) 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)의 제거는 ilvN 유전자를 피드백 저해가 해제된 돌연변이 유전자(ilvN ^mut )로 치환시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법은 (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 피드백 저해가 해제된 돌연변이 유전자(ilvN ^mut )는 strong promoter를 포함하는 발현벡터에 함유되어 치환되는 것을 특징으로 하며, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter, trp promoter 등을 예시할 수 있다.

상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터이다.

본 발명에 있어서, 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법은 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자는 서열번호 21 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 23의 염기서열을 가지는 것을 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법은 global regulator인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 lrp 유전자는 서열번호 24의 염기서열을 가진다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) ilvA가 약화 또는 결실; (b) lacI 유전자가 결실; (c) ilvB, ilvN ^mut , ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및 (d) 서열번호 23의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주에 관한 것이다.

상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주는 서열번호 24의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp)를 제조한 다음, 회분식 발효를 수행한 결과, 아세트산, 피루브산 등의 부산물은 저농도로 생성되면서, L-발린이 고농도로 생성되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 배양하여 L-발린을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-발린의 제조방법에 관한 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 대장균 K-12 W3110 균주와 대장균 W 균주의 L-발린에 대한 내성 평가 및 비교

1-1: 대장균 K-12 W3110 균주와 대장균 W 균주의 L-발린에 대한 내성 비교

대장균 K-12 W3110 균주(ATCC 39936) 및 대장균 W 균주(ATCC9637)를 각각 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 2g (NH4)₂HPO₄, 6.75g KH₂PO₄, 0.85g citric acid, 0.7g MgSO₄ㆍ7H₂O, 5 ml trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분이 있고 KOH로 pH를 6.8로 맞춘 R/2배지 100㎖을 함유하고 10 g/L glucose가 추가된 250㎖ 베플 플라스크에 상기 전배양액 1㎖을 접종하고, L-발린을 각각 0, 0.1, 0.5, 2.0mM의 농도로 첨가한 후 31℃에서 250rpm으로 24시간 배양하였다.

상기 배지를 정기적으로 채취하여, OD₆₀₀을 측정한 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 대장균 K-12 W3110 야생균주는 L-발린이 첨가되지 않은 배지에서만 정상적인 성장을 보였을 뿐, 0.1, 0.5, 2.0mM의 L-발린이 첨가된 배지에서는 모두 성장하지 못하는 결과를 보였다. 상기 결과로부터, 대장균 K-12 W3110 야생균주는 L-발린에 대한 내성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다.

또한, 도 1B에 나타난 바와 같이, 대장균 W 야생균주는 K-12 W3110 야생균주와 달리, L-발린이 첨가되지 않은 배지에서 뿐만 아니라 0.1, 0.5, 2.0mM의 L-발린이 첨가된 배지에서 모두 정상적인 성장을 보였다. 상기 결과로부터, 대장균 W 야생균주는 L-발린에 대한 내성이 매우 높은 것을 알 수 있었다.

1-2: 대장균 W 균주의 ilvG 유전자의 염기서열 확인

대장균 K-12 W3110 균주가 L-발린에 대한 내성이 매우 낮은 이유는 ilvG(acetohydroxy acid synthase II large subunit을 암호화하는 유전자)에 frameshift mutation이 있기 때문이라고 알려져 있다 (Lawther et al., Nucleic Acids Research 15:2137-2155, 1987). 즉, L-발린이 미생물에 첨가되면, acetohydroxy acid synthase(AHAS) isoenzyme I, III 등 두 개의 효소가 L-발린에 의해 피드백 저해를 받아 활성이 거의 없게 되며, 나머지 하나의 AHAS II는 frameshift mutation에 의해 기능이 없기 때문에 활성이 없다. 따라서 AHAS의 기능 저하로 인해, 2-ketobutyrate와 pyruvate의 중합이 용이하지 못하고, 그 결과 2-aceto-2-hydroxybutyrate가 만들어질 수 없기 때문에 세포내에 독성이 강한 2-ketobutyrate가 과량 축적되어 궁극적으로 세포가 성장할 수 없게 되는 것이다.

상기 1-1의 결과로 보듯이, 대장균 W 균주는 대장균 K-12 W3110 균주와 달리 높은 L-발린 내성을 보이는 것으로 보아 대장균 W 균주의 ilvG 유전자에는 frameshift mutation이 없을 것으로 예상되었고, 상기 내용의 확인을 위해 대장균 W 균주의 ilvG 유전자의 염기서열을 확인하였다. 대장균 W 균주의 염색체 DNA는 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 서열번호 1과 2의 프라이머와, 대장균 W genomic DNA 주형을 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 절편을 sequencing 하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, ilvG 유전자의 979번째 염기 위치에 A와 T가 삽입되어 정상적인 gene expression frame을 갖는 것을 알 수 있었다. 상기 결과로 볼 때, 대장균 W 균주의 ilvG 유전자에는 frameshift mutation이 없으며, 그 결과 높은 L-발린 내성을 갖는다는 것을 확인하였다.

[서열번호 1] ilvGup: 5'-ctctttaggcattccttcga-3'

[서열번호 2] ilvGdo: 5'-ggcaacggtcaattcgatat-3'

실시예 2: L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 W 균주의 제작 및 L-발린의 생성능 측정

2-1: L-발린 생성능이 개선된 변이 대장균 W 균주의 제작

2-1-1: lacI 유전자의 결실

L-발린 생성 미생물인 대장균 W(ATCC 9637)에서 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000) 및 이를 응용한 방법(Lee et al., Mol. Syst. Biol. 3:149, 2007)을 이용하여, lac operon의 repressor를 암호화하는 유전자로, lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사를 억제하는 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.

[서열번호 3] lacI1stup: 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctctta gattgcagcattacacgtcttg-3'

[서열번호 4] lacI1stdo: 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatg cacttaacggctgacatggga-3'

2-1-2: ilvA 유전자의 결실

2-1-1에서 수득된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W에 ilvA 유전자를 결실시키기 위하여, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 상기 2-1-1에 언급한 one step inactivation 방법 및 이를 응용한 방법으로 ilvA(isoleucine 생합성 경로의 첫 번째 효소인 threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)를 결실시켰다 (도 3).

즉, 2-1-1에서 제작된 lacI 유전자가 제거된 대장균 W 컴피턴트 세포에서 상기 유전자 ilvA의 결실을 유도하였다.

[서열번호 5] ilvA1stup: 5'-atggctgactcgcaacccctgtccggtgctccggaaggtgccgaatattt gattgcagcattacacgtcttg-3'

[서열번호 6] ilvA1stdo: 5'-ctaacccgccaaaaagaacctgaacgccgggttattggtttcgtcgtggc cacttaacggctgacatggga-3'

2-1-3: pKBRilvBNCED vector의 제작

서열번호 7 내지 12의 프라이머들과 대장균 K-12 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 L-발린 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 ilvB(acetohydroxy acid synthase I large subunit을 암호화하는 유전자), ilvN(acetohydroxy acid synthase I small subunit을 암호화하는 유전자), ilvC(acetohydroxy acid isomeroreductase를 암호화하는 유전자), ilvE(branched chain amino acid aminotransferase를 암호화하는 유전자) 및 ilvD(dihydroxy-acid dehydratase를 암호화하는 유전자) 등을 순차적으로 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 절편을 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKilvBNCED 벡터를 수득하고, sequencing으로 염기서열을 확인하였다. 상기 pKKilvBNCED 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 9.0kb 절편과, pBR322 벡터를 PciI 및 SphI 효소로 절단한 1.9kb 절편을 ligation 하여 pKBRilvBNCED 벡터를 최종 수득하였다 (도 4). 참고로 상기 pKBRilvBNCED 벡터는 본 연구진이 이전에 출원한 특허(한국 등록번호: 10-0832740)에 보고한 바 있다.

[서열번호 7] ilvBNf: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'

[서열번호 8] ilvBNr: 5'-actcgaattcatggcaagttcgggcacaacat-3'

[서열번호 9] ilvCf: 5'-agtgctgcagacgaggaatcaccatggctaac-3'

[서열번호 10] ilvCrSX: 5'-gctcctgcagtctagagctagcgagctcttaacccgc-3'

[서열번호 11] ilvEDepfs: 5'-actcgagctctttccacgtctgctcaatgaatat-3'

[서열번호 12] ilvEDr: 5'-tacgtctagattaaccccccagtttcgatttatc-3'

2-1-4: pKBRilvBN ^mut CED vector의 제작

상기 2-1-3의 과정을 통해 수득된 pKBRilvBNCED vector의 피드백 저해가 해제되지 않은 ilvN(acetohydroxy acid synthase I small subunit을 암호화하는 유전자)유전자를 피드백 저해가 해제된 돌연변이 ilvN 유전자로 치환하여, 피드백 저해가 해제된 acetohydroxy acid synthase (AHAS) I 을 함유하는 pKBRilvBN^mutCED vector를 제작하였다 (도 5). L-발린에 의한 피드백 저해가 제거된 돌연변이 ilvN 유전자의 서열이 Corynebacterium glutamicum(Elisakova et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:207-213, 2005) 과 Streptomyces cinnamonensis(Kopecky et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:162-166, 1999)에서 보고된 바 있으며, 이를 참고하여 pKBRilvBNCED vector에 클로닝 되어있는 ilvN의 염기 6개를 치환하였다. 즉, Corynebacterium glutamicum에서는 ilvN에 의해 코딩되는 AHAS small subunit의 20번째 아미노산(Gly)이 Asp로, 21번째 아미노산(Ile)이 Asp로, 22번째 아미노산(Ile)이 Phe로 치환될 경우 AHAS에 존재하는 피드백 저해가 제거된다고 알려져 있다. 또한, Streptomyces cinnamonensis에서는 ilvN에 의해 코딩되는 AHAS small subunit의 16번째 아미노산(Gly)이 Asp로, 17번째 아미노산(Val)이 Asp로, 18번째 아미노산(Leu)이 Phe로 치환될 경우 AHAS에 존재하는 피드백 저해가 제거된다고 알려져 있다. 상기 두 균주의 AHAS small subunit(encoded by ilvN)과 대장균 K-12 W3110의 AHAS I small subunit(encoded by ilvN)의 N-terminal 아미노산을 align한 결과, 도 6에서 보듯이, 대장균 K-12 W3110의 AHAS I small subunit의 20번째 아미노산(Gly)이 Asp로, 21번째 아미노산(Val)이 Asp로, 22번째 아미노산(Met)이 Phe로 치환될 경우 AHAS I에 존재하는 피드백 저해가 제거될 것이라고 예상되었다. 상기 목적을 위해, ilvN의 59번째 염기(G)를 A로, 60번째 염기(C)를 T로, 62번째 염기(T)를 A로, 63번째 염기(A)를 C로, 64번째 염기(A)를 T로, 66번째 염기(G)를 C로 각각 치환하였다. 즉, 서열번호 13 및 14과 15 및 16의 프라이머와, 대장균 K-12 W3110 genomic DNA 주형을 이용하여 각각 PCR을 수행한 다음, 수득된 1.7-kb와 1.0-kb 등 두개의 PCR 절편을 동일 농도로 섞어 주형으로 하고, 서열번호 13 및 16를 프라이머로 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 상기와 같은 방법으로 얻은 2.7-kb의 PCR 절편을 MluI 및 KpnI 효소로 절단하고, 역시 MluI 및 KpnI 효소로 절단한 pKBRilvBNCED vector에 삽입한 다음, sequencing 하여, ilvN의 59, 60, 62, 63, 64, 66번째 염기가 각각 A, T, A, C, T, C로 치환되었음을 확인하였다.

[서열번호 13] ilvN1: 5'-acatcgacgcgtaagcgctttaccg-3'

[서열번호 14] ilvN2: 5'-acaaacgtgggtgaagtcatccggatggtt-3'

[서열번호 15] ilvN3: 5'-aaccatccggatgacttcacccacgtttgt-3'

[서열번호 16] ilvN4: 5'-ggatcggtaccttcttccaccagcttgt-3'

2-1-5: 대장균의 ygaZH operon과 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터(pTrc184ygaZHlrp)의 제작

대장균 W3110(ATCC 39936)의 염색체 DNA를 공지된 방법으로 분리 및 정제하였다 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 상기 정제된 유전체 서열을 주형으로 하고, 서열번호 17 및 18을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(ygaZH 유전자)을 NcoI 및 KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pTrc99AygaZH를 제작하고, 상기 pTrc99AygaZH 벡터를 BspHI 및 EcoRV로 절단하여 수득한 유전자 조각을, 동일 효소(BspHI 및 EcoRV)로 절단한 pACYC184(New England Biolabs)에 삽입하여 ygaZH 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184ygaZH를 제작하였다.

대장균 W3110(ATCC 39936)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 20을 프라이머로 사용하여, 95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 20초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복하면서, PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(lrp 유전자)을 BamHI 및 PstI로 절단한 후, 상기 제작된 벡터 pTrc184ygaZH를 동일 효소(BamHI 및 PstI)로 절단하여 수득한 pTrc184ygaZH의 유전자 절편에 삽입하여 ygaZH operon과 lrp 유전자를 동시에 포함하는 재조합 벡터 pTrc184ygaZHlrp를 제작하였다 (도 7). 참고로, 상기 pTrc184ygaZHlrp 벡터는 본연구진이 이전에 출원한 특허(등록번호: 10-0832740)에 보고한 바 있다.

[서열번호 17] ygaZHf: 5'-actaccatggaaagccctactccaca-3'

[서열번호 18] ygaZHr: 5'-gctcggtaccttatataatcgccatcactt-3'

[서열번호 19] lrpacfb: 5'-atgcggatccgaacagtgatgtttcagggt-3'

[서열번호 20] lrpacrp: 5'-atctctgcaggttccgtgttagcgcgtctt-3'

2-1-6: L-발린 생성 미생물의 제작

상기 2-1-1 내지 2-1-2의 과정을 통해 lacI, ilvA 유전자가 결실된 대장균 W 균주에 상기 2-1-3 내지 2-1-4에서 제작된 pKBRilvBNCED 벡터와 feedback inhibition이 제거된 ilvN을 포함하는 pKBRilvBN^mutCED 벡터 및 상기 2-1-5에서 제작된 pTrc184ygaZHlrp 벡터를 도입하여, 재조합 대장균 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)와 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp)을 제작하였다.

2-2: ilvN 의 피드백 저해 제거 효과 확인

ilvN에 도입된 돌연변이로 인해 피드백 저해가 제거되어 L-발린 생성능이 향상되는 지를 확인하기 위해 ilvN에 돌연변이가 도입되지 않은 균주와 ilvN에 돌연변이가 도입된 균주의 발효를 수행하였다. 또한, 대장균 K-12 W3110 기반 L-발린 생산균주와의 비교를 위해 기 등록특허(등록번호: 10-0832740)에서 언급한 Val (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp) 균주의 발효를 수행하였다.

이를 위해, 상기 2-1-6에서 제작된 L-발린 생성 미생물 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp), E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp) 및 Val (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)를 엠피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이 형질전환 균주를 5g/ℓ glucose를 포함하는 200㎖ LB 배지에 접종하여 31℃에서 24시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 2g KH₂PO₄, 15g (NH₄)₂SO₄ㆍ7H₂O, 2g MgSO₄ㆍ7H₂O, 3g yeast extract, 262mg L-isoleucine, 1g betaine hydrochloride, 0.1g thiamine hydrochloride, 0.1g nicotinic acid, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO₄ㆍ7H₂O, 1.35g CaCl₂, 2.25g ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.5g MnSO₄ㆍ4H₂O, 1g CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.106g (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O, 0.23g Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O, 35% HCl 10㎖ 포함)의 성분으로 구성된 배지 1.8 리터를 함유한 6.6 리터 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA)에 전배양액을 접종하여, 31℃에서 배양하였다. pH는 25%(v/v) NH₄OH의 automatic feeding에 의해 6.0으로 유지되었고, 용존 산소 농도(dissolved oxygen concentration)는 공기를 1vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하면서 교반속도를 1000rpm 까지 자동 조절함으로써 포화 공기(air saturation)의 40% 이상으로 유지했다. E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp)의 회분식 발효를 위해, 상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 100 ml의 feeding solution (40g glucose, 2g KH₂PO₄, 0.42g L-isoleucine을 포함)을 총 18회 feeding하여 총 760g의 glucose를 소모하였다.

Val (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp) 균주에는 L-루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 leuA(2-isopropylmalate synthase를 암호화하는 유전자)와 D-판토텐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 panB(3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase를 암호화하는 유전자)가 추가로 결실되어있기 때문에, 초기 배지에 1리터당 262mg L-leucine과 425㎍ sodium D-pantothenic acid를 추가하였으며, 100ml의 feeding solution에 0.42g L-leucine과 7.24mg sodium D-pantothenic acid를 추가하였다. 상기 추가 사항을 제외하고는 대장균 W 기반 L-발린 생산균주의 배양 조건과 동일한 방법으로 회분식 발효를 수행하였다. 그러나 아세트산(13.2 g/L), 피루빅산(5.3 g/L) 등의 부산물이 과량 축적됨으로 인해 세포 활성이 저해되었고, 그 결과 feeding solution의 feeding이 4회까지만 가능하였다.

일정 시간 간격으로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 L-발린의 농도를 HPLC로 측정하였다. 그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 대장균 W와 K-12 야생균주에서는 생성되지 않았던 L-발린이 대장균 K-12 기반의 Val (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp) 균주에서 15.1g/L의 농도와 0.26g/L/h의 생산성으로 생산되었으며, 본 발명의 L-발린 생성 미생물 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)와 E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp)에서는 각각 34.2g/L (도 8)와 60.7g/L (도 9)의 농도와, 1.16g/L/h와 2.06g/L/h의 생산성으로 생산되었다. 상기 결과로부터 대장균 W 기반 L-발린 생산균주가 K-12 기반 L-발린 생산균주에 비해 월등히 높은 L-발린 생성능을 보인다는 것을 알 수 있었으며, 특히 ilvN에 도입된 돌연변이가 L-발린에 대한 피드백 저해를 제거함으로써, 대장균 W 기반 L-발린 생산균주의 L-발린 생성능을 획기적으로 향상시켰음을 보여준다. 주목할 점은 대장균 W 기반 L-발린 생산균주에서는 아세트산과 피루빅산 등의 부산물이 1g/L 이하의 농도로 유지되었다는 것이다.

상기 결과는 대장균에서 보고된 L-발린 생산 결과 중 최고이며, L-발린 생산균주로 가장 많이 쓰이는 Corynebacterium glutamicum 균주에서 보고된 48 /L(Blombach et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 79:471-479, 2008)와 1.17 g/L/h(Blombach et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:2079-2084, 2007)보다 월등히 우수한 결과로서, 대장균 W 균주가 L-발린의 생산균주로서 가장 적합한 균주라는 것을 알 수 있었다.

Strain	E. coli K-12 & W	Val (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)	E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBNCED+pTrc184ygaZHlrp)	E. coli W (ΔlacI ΔilvA) (pKBRilvBN^mutCED+pTrc184ygaZHlrp)
L-발린 (g/ℓ)	ND¹	15.1	34.2	60.7
L-발린 (g/ℓ/h)	ND¹	0.26	1.16	2.06

¹ Not detected.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Mutant Escherichia coli W with Improved Productivity of L-valine and Method for Preparing It Using the Same <130> P10-B264 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctctttaggc attccttcga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggcaacggtc aattcgatat 20 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 4 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg cacttaacgg 60 ctgacatggg a 71 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt gattgcagca 60 ttacacgtct tg 72 <210> 6 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctaacccgcc aaaaagaacc tgaacgccgg gttattggtt tcgtcgtggc cacttaacgg 60 ctgacatggg a 71 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actcgaattc atggcaagtt cgggcacaac at 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 actcgaattc atggcaagtt cgggcacaac at 32 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agtgctgcag acgaggaatc accatggcta ac 32 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctcctgcag tctagagcta gcgagctctt aacccgc 37 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actcgagctc tttccacgtc tgctcaatga atat 34 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tacgtctaga ttaacccccc agtttcgatt tatc 34 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 acatcgacgc gtaagcgctt taccg 25 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acaaacgtgg gtgaagtcat ccggatggtt 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aaccatccgg atgacttcac ccacgtttgt 30 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ggatcggtac cttcttccac cagcttgt 28 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 actaccatgg aaagccctac tccaca 26 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctcggtacc ttatataatc gccatcactt 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atgcggatcc gaacagtgat gtttcagggt 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atctctgcag gttccgtgtt agcgcgtctt 30 <210> 21 <211> 245 <212> PRT <213> branched chain amino acid exporter gene of E. coli <400> 21 Met Glu Ser Pro Thr Pro Gln Pro Ala Pro Gly Ser Ala Thr Phe Met 1 5 10 15 Glu Gly Cys Lys Asp Ser Leu Pro Ile Val Ile Ser Tyr Ile Pro Val 20 25 30 Ala Phe Ala Phe Gly Leu Asn Ala Thr Arg Leu Gly Phe Ser Pro Leu 35 40 45 Glu Ser Val Phe Phe Ser Cys Ile Ile Tyr Ala Gly Ala Ser Gln Phe 50 55 60 Val Ile Thr Ala Met Leu Ala Ala Gly Ser Ser Leu Trp Ile Ala Ala 65 70 75 80 Leu Thr Val Met Ala Met Asp Val Arg His Val Leu Tyr Gly Pro Ser 85 90 95 Leu Arg Ser Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Lys Ser Lys Thr Ala Leu 100 105 110 Trp Ala Phe Gly Leu Thr Asp Glu Val Phe Ala Ala Ala Thr Ala Lys 115 120 125 Leu Val Arg Asn Asn Arg Arg Trp Ser Glu Asn Trp Met Ile Gly Ile 130 135 140 Ala Phe Ser Ser Trp Ser Ser Trp Val Phe Gly Thr Val Ile Gly Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Leu Leu Gln Gly Tyr Pro Ala Val Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Gly Phe Met Leu Pro Ala Leu Phe Met Ser Phe Leu Leu Ala Ser 180 185 190 Phe Gln Arg Lys Gln Ser Leu Cys Val Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala 195 200 205 Leu Ala Gly Val Thr Leu Phe Ser Ile Pro Val Ala Ile Leu Ala Gly 210 215 220 Ile Val Cys Gly Cys Leu Thr Ala Leu Ile Gln Ala Phe Trp Gln Gly 225 230 235 240 Ala Pro Asp Glu Leu 245 <210> 22 <211> 111 <212> PRT <213> branched chain amino acid exporter gene of E. coli <400> 22 Met Ser Tyr Glu Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Val Ala Asn 1 5 10 15 Tyr Cys Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Arg Leu Arg Val Gly Asn Ala Arg 20 25 30 Pro Thr Lys Arg Gly Ala Val Gly Ile Leu Leu Asp Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Cys Ala Leu Leu Val Val Ser Thr Ala Pro Glu Val Met 50 55 60 His Asp Thr Arg Arg Phe Val Pro Thr Leu Val Gly Phe Ala Val Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ser Phe Tyr Lys Thr Arg Ser Ile Ile Ile Pro Thr Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Ala Trp Lys Val Met Ala Ile Ile 100 105 110 <210> 23 <211> 1063 <212> DNA <213> branched chain amino acid exporter gene of E. coli <400> 23 atggaaagcc ctactccaca gcctgctcct ggttcggcga ccttcatgga aggatgcaaa 60 gacagtttac cgattgttat tagttatatt ccggtggcct ttgcgttcgg tctgaatgcg 120 acccgtctgg gattctctcc tctcgaaagc gtttttttct cctgcatcat ttatgcaggc 180 gcgagccagt tcgtcattac cgcgatgctg gcagccggga gtagtttgtg gattgctgca 240 ctgaccgtca tggcaatgga tgttcgccat gtgttgtatg gcccgtcact gcgtagccgt 300 attattcagc gtctgcaaaa atcgaaaacc gccctgtggg cgtttggcct gacggatgag 360 gtttttgccg ccgcaaccgc aaaactggta cgcaataatc gccgctggag cgagaactgg 420 atgatcggca ttgccttcag ttcatggtca tcgtgggtat ttggtacggt aataggggca 480 ttctccggca gcggcttgct gcaaggttat cccgccgttg aagctgcatt aggttttatg 540 cttccggcac tctttatgag tttcctgctc gcctctttcc agcgcaaaca atctctttgc 600 gttaccgcag cgttagttgg tgcccttgca ggcgtaacgc tattttctat tcccgtcgcc 660 attctggcag gcattgtctg tggctgcctc actgcgttaa tccaggcatt ctggcaagga 720 gcgcccgatg agctatgagg ttctgctgct tgggttacta gttggcgtgg cgaattattg 780 cttccgctat ttgccgctgc gcctgcgtgt gggtaatgcc cgcccaacca aacgtggcgc 840 ggtaggtatt ttgctcgaca ccattggcat cgcctcgata tgcgctctgc tggttgtctc 900 taccgcacca gaagtgatgc acgatacacg ccgtttcgtg cccacgctgg tcggcttcgc 960 ggtactgggt gccagtttct ataaaacacg cagcattatc atcccaacac tgcttagtgc 1020 gctggcctat gggctcgcct ggaaagtgat ggcgattata taa 1063 <210> 24 <211> 495 <212> DNA <213> lrp gene of E.coli <400> 24 atggtagata gcaagaagcg ccctggcaaa gatctcgacc gtatcgatcg taacattctt 60 aatgagttgc aaaaggatgg gcgtatttct aacgtcgagc tttctaaacg tgtgggactt 120 tccccaacgc cgtgccttga gcgtgtgcgt cggctggaaa gacaagggtt tattcagggc 180 tatacggcgc tgcttaaccc ccattatctg gatgcatcac ttctggtatt cgttgagatt 240 actctgaatc gtggcgcacc ggatgtgttt gaacaattca ataccgctgt acaaaaactt 300 gaagaaattc aggagtgtca tttagtatcc ggtgatttcg actacctgtt gaaaacacgc 360 gtgccggata tgtcagccta ccgtaagttg ctgggggaaa ccctgctgcg tctgcctggc 420 gtcaatgaca cacggacata cgttgttatg gaagaagtca agcagagtaa tcgtctggtt 480 attaagacgc gctaa 495

Claims

대장균 W에서, L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)를 약화 또는 결실시키고, ilvN 유전자 (acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자)를 피드백 저해가 해제된 돌연변이 유전자(ilvN^mut )로 치환시켜 ilvN 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)를 제거시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 피드백 저해가 해제된 돌연변이 유전자(ilvN^mut )는 strong promoter를 포함하는 발현벡터에 함유되어 치환되는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
제1항에 있어서, 서열번호 21 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 23의 염기서열을 가지는 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, global regulator인 lrp 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 lrp 유전자는 서열번호 24의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주의 제조방법.
L-이소루신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 ilvA(threonine dehydratase를 암호화하는 유전자)가 약화 또는 결실되어 있고, ilvN 유전자 (acetohydroxy acid synthase isozyme I을 암호화하는 유전자)가 피드백 저해가 해제된 돌연변이 유전자(ilvN^mut )로 치환되어 ilvN 유전자의 피드백 저해(feedback inhibition)가 제거되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
삭제
삭제
제12항에 있어서, (a) lacI(lac operon repressor를 암호화하는 유전자) 유전자의 결실; (b) trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 포함하는 발현벡터의 도입으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 추가 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
제12항에 있어서, 상기 피드백 저해가 해제된 돌연변이 유전자(ilvN^mut )는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 포함하는 발현벡터에 함유되어 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
삭제
제15항에 있어서, 상기 strong promoter를 포함하는 발현벡터는 ilvB, ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
제12항에 있어서, 서열번호 21 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상이거나, 서열번호 23의 염기서열을 가지는 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
삭제
제12항에 있어서, global regulator인 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
제21항에 있어서, 상기 lrp 유전자는 서열번호 24의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
(a) ilvA가 약화 또는 결실;
(b) lacI 유전자가 결실;
(c) ilvB, ilvN ^mut , ilvC, ilvE 및 ilvD 유전자와 strong promoter를 포함하는 발현 벡터가 도입; 및
(d) 서열번호 23의 분지쇄 아미노산 엑스포터(exporter) 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
제23항에 있어서, 상기 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주는 서열번호 24의 lrp 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 L-발린 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주.
제12항, 제15항, 제16항, 제18항, 제19항, 제21항 및 제22항중 어느 한 항의 L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 배양하여 L-발린을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-발린의 제조방법.
제23항 또는 제24항의 L-발린 생성 고생성능을 가지는 변이 대장균 W 균주를 배양하여 L-발린을 생성시킨 다음, 상기 미생물의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 것을 특징으로 하는 L-발린의 제조방법.