KR102242467B1 - 변형된 시아노박테리아 유전자 발현 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트; 이를 포함하는 재조합 발현 벡터; 상기 발현 벡터를 이용한 에탄올 생산 균주 및 스쿠알렌 생산 균주; 및 상기 균주를 이용한 에탄올 또는 스쿠알렌 생산 방법에 관한 것이다.

Description

변형된 시아노박테리아 유전자 발현 시스템{Modified cyanobacterial gene expression system}
본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
바이오 에너지는 동물, 식물 및 미생물 등 바이오매스(biomass)로부터 만들어지는 에너지원을 의미하며, 바이오매스 에너지라고도 한다. 상기 바이오매스를 에너지원으로 이용하는 방법에 있어서, 과거에는 직접 연소와 같은 방법을 주로 이용하였으나, 오늘날에는 유기물 또는 유기성 폐기물을 효소나 미생물을 이용한 생화학적 변환 공정; 광합성 미생물을 이용한 광생물학적 변환 공정; 및 열에너지와 화학적 촉매를 이용한 열화학적 변환 공정 등을 통하여 에탄올, 메탄올, 바이오 디젤, 피셔-트롭스크(Fischer-Tropsch) 디젤 등과 같은 액체 연료 및/또는 수소, 메탄 등과 같은 기체 연료를 생산하는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다. 최근 바이오매스로부터 얻어진 에너지원 즉, 바이오매스 에너지원은 저장 및 재생이 가능하고, 환경문제를 발생하지 않는다는 점에서 새로운 에너지원으로 그 연구의 필요성이 증대되고 있는 실정이다.
이와 관련하여 최근 관심이 집중되고 있는 분야 중에 하나가 에탄올 발효를 이용한 바이오 에탄올의 생성에 관한 연구이다. 에탄올 발효란 과당과 같은 당분이 효모와 같은 미생물에 의하여 이산화탄소와 에탄올로 분해하여 이루어지는 발효를 의미한다. 상기 에탄올 발효를 이용하여 전분질로부터 에탄올을 제조하기 위한 공정은 종래부터 산업적으로 이용되어 왔다. 특히, 바이오 에탄올은 연료용, 음료용으로 사용될 뿐만 아니라, 의약품, 화장품 및 공업용 원료 등의 많은 용도로 사용되고 있어, 해마다 그 제조량이 증가되고 있다. 이 때문에 보다 값싸고 생산성이 높은 에탄올 제조 기술의 개발이 요구되고 있다.
스쿠알렌은 탄소 30개 및 수소 50개가 여섯 개의 이중 결합으로 연결된 트리테르페노이드계의 불포화 탄화수소로서, 통상 인체와 동식물성 유지에 함유되어 있다. 스쿠알렌은 항산성 기능보조식품, 화장품원료, 백신보조원료, 사료연료로서 사용되는 등 산업 전반에 걸쳐 다양한 용도를 위하여 사용되고 있다. 최근 이스트 균주로부터 시작하여, 미세조류 등으로부터 스쿠알렌을 생산하기 위한 방법 등 다양한 시도가 계속되고 있는데, 이스트를 사용하는 방법의 경우 생산 공정 시 많은 당을 필요로 하여 비경제적이고, 미세조류를 사용하는 경우, 원하는 타겟물질인 스쿠알렌 외에도 다른 불순물질이 생성되기 되어 한계가 있다. 따라서, 경제적이고, 안정적으로 스쿠알렌을 대량생산할 수 있는 방법의 연구가 필요한 실정이다.
상기와 같이 바이오 에탄올 또는 스쿠알렌을 미생물을 통해 대량생산하기 위하여 프로모터들도 개발되었다. 대장균에서 고효율의 유전자 발현시스템으로 알려진 T7 프로모터 및 lac 프로모터 등이 있으며, 이와 같은 프로모터는 IPTG 유도성 프로모터로서 높은 유도 발현이 가능하다. 다만, IPTG의 높은 가격과 독성 때문에 대량배양 공정에서의 적용이 적합하지 않다는 문제가 있다. 이에 상대적으로 저렴하고 안전한 물질인 maltose 또는 mannitol을 유도인자로 사용하는 프로모터들이 개발되고 있지만, IPTG에 비해 유도 발현이 낮다. 따라서, 저비용 고효율의 생물공정 개발을 위한 무-유도인자 기반 발현 벡터를 개발이 필요하다.
한국등록특허 제10-1284558호
본 발명의 목적은 본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자가 포함된 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터의 목적 유전자에 pdc 유전자 및 adh 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터; 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 생산 방법 또는 이산화탄소의 제거 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자가 포함된 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터의 목적 유전자에 dxs 유전자, idi 유전자 및 ispA 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터; 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌의 생산 방법 또는 이산화탄소의 제거 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 5'-NSI(neutral site I), SpcR (spectinomycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSI(neutral site I)을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 벡터는 5'-NSII(neutral site II), kmR (kanamycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSII(neutral site II)을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 형질전환체는 기탁번호 KCTC 13870BP 인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자가 포함된 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터의 목적 유전자에 pdc 유전자 및 adh 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터; 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 생산 방법 또는 이산화탄소의 제거 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 pdc 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 adh 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSII (Neutral Site-II)에 삽입되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자가 포함된 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터의 목적 유전자에 dxs 유전자, idi 유전자 및 ispA 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터; 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체; 및 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌의 생산 방법 또는 이산화탄소의 제거 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 dxs 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 idi 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 ispA 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 cpcB1 유전자에 연결된 SQS 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터로 더 형질전환된 것일 수 있고, 상기 SQS 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 형질전환체는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSI (Neutral Site-I)에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSII (Neutral Site-II) 또는 NSIII (Neutral Site-III)에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명의 lacI 가 제거된 trc 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터는 IPTG와 같은 고가의 유도인자 없이 지속적으로 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있어, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 균주를 통해 이산화탄소로부터 에탄올 또는 스쿠알렌을 대량 생산에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 무-유도인자 기반 유전자 발현 시스템을 위한 lacI 제거된 시네코코커스 일롱게투스용 삽입 벡터의 모식도이다.
도 2는 에탄올 생산 유전자를 포함하는 pSe2Bb1k 벡터 (왼쪽 패널, 대조군) 또는 pSe2Bb1(const)k 벡터 (오른쪽 패널)로 형질전환된 균주의 세포성장 및 에탄올 생산량을 측정한 결과이다 (녹색 바(bar): 배양액 내의 에탈올 생산량; 및 회색 바(bar): 휘발된 에탈올 생산량).
도 3은 지속적으로 발현을 유도하는 프로모터(lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 cpcB1 프로모터)에 의한 유전자 발현 시스템으로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 스쿠알렌 생산 균주의 유전자 모식도이다.
도 4는 지속적으로 발현을 유도하는 프로모터(lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 cpcB1 프로모터)로 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스 스쿠알렌 생산 균주 (SeSC37S-MEP(const), SeSC35SII-MEP(const))의 생장곡선 및 스쿠알렌 생산량을 측정한 결과이다.
본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터을 제공한다.
본 발명에서 용어, "재조합 발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 5'-NSI(neutral site I), SpcR (spectinomycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSI(neutral site I)을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 5'-NSII(neutral site II), kmR (kanamycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSII(neutral site II)을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인 것일 수 있고, 기탁번호 KCTC 13870BP 인 것일 수 있다.
본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터의 목적 유전자에 pdc 유전자 및 adh 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 pdc 유전자는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 생산하는 효소인 pyruvate decarboxylase 를 코딩하는 유전자이며, adh 유전자는 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 효소인 alcohol dehydrogenase 를 코딩하는 유전자이다. 바람직하게는, 상기 두 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymonas mobilis) 유래인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 pdc 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 adh 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하며, 상기 형질전환체는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주인 것일 수 있고, 상기 두 유전자를 포함하고 있어 에탄올을 생산할 수 있는 균주이다.
시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus)는 시아노박테리아(cyanobacteeria)의 일종으로서, 원핵세포인 시아노박테리아는 유전자 조작이 용이하여, 대사경로를 바꾸거나 대사물질을 인위적으로 조절하는데 유리하여, 본 발명자들은 시아노박테리아의 특성과 합성생물학/대사공학적 기법을 이용하여 형질전환된 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주를 제조하였다.
상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSII (Neutral Site-II)로 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 형질전환체인 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올의 생산 방법을 제공한다. 상기 균주는 유도인자의 첨가없이 배양되고, 예를 들어, IPTG의 첨가없이 배양되는 것일 수 있고, 이산화탄소의 공급으로부터 에탄올을 생산하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체인 시네코코커스 일롱게투스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 이산화탄소의 제거 방법을 제공한다.
본 발명은 lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터의 목적 유전자에 dxs 유전자, idi 유전자 및 ispA 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터(제 1 벡터)를 제공한다. 상기 dxs 유전자는 피루베이트 및 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)로부터 1-데옥시-D-크실룰로오스 5-포스페이트(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate)를 생산하는 효소인 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 를 코딩하는 유전자이고, idi 유전자는 아이소펜테닐 디포스페이트(isophentenyl diphosphate)로부터 디메틸알릴 디포스페이트(dimethylallyl diphosphate)를 생산하는 효소인 isopentenyl diphosphate isomerase 를 코딩하는 유전자이며, ispA 유전자는 디메틸알릴 디포스페이트로부터 파네실 디포스페이트(farnesyl diphosphate)를 생산하는 효소인 farnesyl diphosphate synthase 를 코딩하는 유전자이다. 상기 유전자들은 lacI 가 제거된 trc 프로모터를 포함하는 벡터에 도입하여 MEP 대사경로를 최적화하였다. 바람직하게는 상기 dxs 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 idi 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 ispA 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하며, 상기 형질전환체는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주인 것일 수 있다.
또한, 상기 형질전환체는 cpcB1 유전자에 연결된 SQS 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터(제 2 벡터)로 더 형질전환된 것일 수 있고, 상기 SQS 유전자는 파네실 디포스페이트 (FPP)로부터 스쿠알렌(squalene)을 생산하는 효소인 squalene synthase 를 코딩하는 유전자이고, 바람직하게는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 SQS 유전자는 링커(linker)를 이용하여 cpcB 단백질의 코딩 유전자인 cpcB1 유전자(cpcB 프로모터 포함)와 퓨전되었고, 시네코코커스 일롱게투스 균주에 형질전환된 것일 수 있다.
시네코코커스 일롱게투스 지놈 상에 유전자를 삽입할 수 있는 자리 3 곳 중에서, 제 1 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSI (Neutral Site-I)에 삽입되는 것일 수 있고, 상기 제 2 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSII (Neutral Site-II) 또는 NSIII (Neutral Site-III) 에 삽입되는 것일 수 있다.
본 발명에서는 스쿠알렌의 생산량을 증가시키기 위하여 시네코코커스 일롱게투스 균주의 지놈(genome) 상에 스쿠알렌 생산 효소의 퓨전단백질 코딩 유전자의 개수를 증가시키는 동시에 유전자 단백질 발현률을 증가시키며 지속적으로 발현을 유도하는 무-유도제 프로모터(lacI 없는 Ptrc promter)도 방법을 도입하였다.
또한, 본 발명은 상기 제 1 벡터 및 제 2 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌의 생산 방법을 제공하고, 상기 형질전환체는 유도인자의 첨가없이 배양되는 것이고, 예를 들어, IPTG의 첨가없이 배양되는 것일 수 있고, 이산화탄소의 공급으로부터 스쿠알렌을 생산하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제 1 벡터 및 제 2 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 이산화탄소의 제거 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. lacI 가 제거된 trc 프로모터를 포함하는 발현 카세트 및 벡터 제조
본 발명자들은 목적 유전자의 단백질 발현률을 증가시키며, 지속적으로 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 포함하는 벡터를 개발하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, 기존 SyneBrick 벡터인 pSe1Bb1s-GFP 및 pSe2Bb1k-GFP (Kim UJ et al., Front Plant Sci 8:293, 2017)에서 AatII_xhoI 제한효소를 이용하여 lacI-trc 프로모터가 제거된 단편을 각각 얻었다. 이후, AatII 제한효소 사이트의 서열이 포함된 정방향 프라이머(forword primer)와 xhoI 제한효소 사이트의 서열이 포함된 역방향 프라이머(reverse primer)를 이용하여 trc 프로모터의 DNA 서열을 PCR로 증폭시킨 단편을 라이게이션하여 pSe1Bb1(const)s, pSe2Bb1(const)k 벡터를 제조하였다 (도 1).
pSe1Bb1(const)s (서열번호 1)의 경우 5'-NSI(neutral site I), SpcR (spectinomycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSI(neutral site I)을 포함하고 있고, pSe2Bb1(const)k (서열번호 2)의 경우 5'-NSII(neutral site II), kmR (kanamycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSII(neutral site II)를 포함하고 있다 (도 1).
실시예 2. lacI 가 제거된 벡터를 이용하여 에탄올 생산 균주 제작
본 발명자들은 실시예 1에서 제조된 lacI 가 제거된 벡터를 이용하여 에탄올 생산 균주를 제작하였다. 에탄올 생산 균주는 피루베이트(pyruvate)를 거쳐 에탄올을 생산할 수 있도록 제조하기 위하여 pdc 유전자 (서열번호 3) 및 adh 유전자 (서열번호 4)를 선정하여 삽입하였다. 상기 두 유전자는 자이모모나스 모빌리스(Zymonas mobilis) 유래이며, pdc 유전자는 피루베이트(pyruvate)로부터 아세트알데히드(acetaldehyde)를 생산하는 효소인 pyruvate decarboxylase 를 코딩하는 유전자이며, adh 유전자는 아세트알데히드로부터 에탄올을 생산하는 효소인 alcohol dehydrogenase 를 코딩하는 유전자이다.
우선, lacI 가 제거된 Synebrick 벡터인 pSe2Bb1(const)k-GFP 의 GFP 부분은 EcoRI-BamHI 제한효소를 이용하여 제거하였고, 제거된 자리에 합성 주문한 pdc 또는 adh 유전자의 DNA 서열을 삽입하였다. pdc 유전자가 삽입된 pSe2Bb1k-pdc 벡터는 BamHI-XhoI 제한효소를 처리한 후, 동일한 BglII-XhoI 제한효소로 처리된 adh 유전자의 DNA 서열을 삽입하여 pSe2Bb1k-pdc,adh 벡터가 완성되었다. 완성된 pSe2Bb1k-pdc,adh 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 야생형 균주의 NSII (Neutral Site-II)에 삽입되었다. 형질전환 방법은 Natural transformation을 이용하여 수행하였고, 형질전환 여부는 PCR 를 통해 확인하였으며, 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: NSII-forward primer: 5'-GGC TAC GGT TCG TAA TGC CA-3' (서열번호 11); 및 NSII-reverse primer: 5'-GAG ATC AGG GCT GTA CTT AC-3' (서열번호 12).
실시예 3. 에탄올 생산 균주를 이용하여 이산화탄소로부터 에탄올 생산 확인
본 발명자들은 실시예 2에서 제조된 에탄올 생산 균주를 통해 에탄올이 생산 되는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 100 mL 병에 10 mM MOPS 버퍼가 포함된 BG-11 배지를 100 mL 넣고, 제조된 에탄올 생산 균주를 처음 배양 시 OD 0.6 으로 희석하여 배양하였다. 배지에는 10 μg/mL의 카나마이신(kanamycin)를 넣은 후, 정치배양기에서 30 ℃, 100 μE·m-2·s-1 및 5 % CO2를 연속하여 공급하는 조건에서 배양하였다. 휘발되는 에탄올은 100 mL 병에 100 mL 물을 채운 후, 배양병과 연결하여 물에 녹게 하였다. 대조군 균주(Se2Et)에는 24 시간 배양 후, 1 mM의 IPTG 를 넣었고, 본 발명의 에탄올 생산 균주(Se2Et(const))에는 IPTG 를 넣지 않았다. 배양 후 8 일 동안 730 nm 파장에서 세포의 OD (optical density)를 확인하였고, 에탄올의 생산량은 HPLC 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, lacI 가 제거된 벡터를 이용하여 제조된 에탄올 생산 균주(Se2Et(const))는 대조군 균주(Se2Et)와 비교하여 약간 낮은 세포생장률을 보였으며, IPTG 와 같은 유도물질의 첨가없이도 삽입된 pdc 유전자 및 adh 유전자의 발현 증가 및 지속적인 발현 유도를 통해 에탄올 생산이 가능함을 확인하였다 (도 2).
실시예 4. lacI 가 제거된 벡터를 이용하여 스쿠알렌 생산 균주 제작
본 발명자들은 실시예 1에서 제조된 lacI 가 제거된 벡터를 이용하여 스쿠알렌 생산 균주를 제작하였다. 스쿠알렌 생산 균주는 MEP 대사 경로에 사용된 dxs 유전자 (서열번호 5), idi 유전자 (서열번호 6) 및 ispA 유전자 (서열번호 7)를 이용하여 스쿠알렌에 이르는 대사경로를 만들었다. 상기 유전자들은 대장균 (E.coli) 유래이며, dxs 유전자는 피루베이트 및 D-글리세르알데하이드 3-포스페이트(D-glyceraldehyde 3-phosphate)로부터 1-데옥시-D-크실룰로오스 5-포스페이트(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate)를 생산하는 효소인 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 를 코딩하는 유전자이고, idi 유전자는 아이소펜테닐 디포스페이트(isophentenyl diphosphate)로부터 디메틸알릴 디포스페이트(dimethylallyl diphosphate)를 생산하는 효소인 isopentenyl diphosphate isomerase 를 코딩하는 유전자이며, ispA 유전자는 디메틸알릴 디포스페이트로부터 파네실 디포스페이트(farnesyl diphosphate)를 생산하는 효소인 farnesyl diphosphate synthase 를 코딩하는 유전자이다. 상기 유전자들은 lacI 가 제거된 trc 프로모터를 포함하는 벡터에 도입하여 MEP 대사경로를 최적화하였다.
우선, lacI 가 제거된 Synebrick 벡터인 pSe1Bb1(const)s-RFP 의 RFP 부분은 EcoRI-XhoHI 제한효소를 이용하여 제거하였고, 그 자리에 dxs 유전자, idi 유전자 및 ispA 유전자의 DNA 서열을 삽입하였다. 또한, 스쿠알렌을 생산이 가능한 pSe2-cpcB-SF-SQS 벡터는 Synebrick 벡터로부터 Gibson assembly 방법으로 SQS 유전자의 DNA 서열을 삽입하였다.
파네실 디포스페이트 (FPP)로부터 스쿠알렌(squalene)을 생산하는 효소인 squalene synthase 를 코딩하는 유전자인 SQS 유전자 (서열번호 8)는 링커(linker)를 이용하여 cpcB 단백질의 코딩 유전자인 cpcB1 유전자(cpcB 프로모터 포함)와 퓨전하였다. 링커(linker, SF (short flexible linker))의 서열 정보는 다음과 같다: 아미노산 서열, GGGS; 및 DNA 서열, GGGGGGGGGTCT. 피코시아닌 베타 서브유닛(phycocyanin beta-subunit)을 코딩하는 유전자인 cpcB1 유전자는 시네코코커스 일롱게투스로부터 유래한 것이다.
완성된 pSe1Bb1(const)s-dxs, idi, ispA 벡터 또는 pSe2-cpcB-SF-SQS 벡터는 시네코코커스 일롱게투스 야생형 균주의 NSI 또는 NSII에 삽입되었고, 2종(SeSC37S-MEP(const), SeSC35SII-MEP(const))의 스쿠알렌 생산 균주를 얻었다 (도 3).
형질전환 방법은 Natural transformation을 이용하여 수행하였고, 형질전환 여부는 PCR 를 통해 확인하였으며, 사용된 프라이머 서열을 다음과 같다: NSI-forward primer: 5'-ACA TCT TCC TGC TCC AGA AG-3' (서열번호 9); NSI-reverse primer: 5'-GAA AGC GTG ACG AGC AGG GA-3' (서열번호 10); NSII-forward primer: 5'-GGC TAC GGT TCG TAA TGC CA-3' (서열번호 11); 및 NSII-reverse primer: 5'-GAG ATC AGG GCT GTA CTT AC-3' (서열번호 12).
실시예 5. 스쿠알렌 생산 균주를 이용하여 이산화탄소로부터 스쿠알렌 생산 확인
본 발명자들은 실시예 4에서 제조된 두 가지 스쿠알렌 생산 균주를 통해 스쿠알렌이 생산되는지 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, 100 mL 병에 10 mM MOPS 버퍼가 포함된 BG-11 배지를 100 mL 넣고, 제작된 스쿠알렌 생산 균주를 처음 배양 시 OD (optical density)를 1 로 희석하여 배양하였다. 균주는 정치배양기에서 30 ℃, 100 μE·m-2·s-1 및 5 % CO2 를 연속하여 공급하는 조건에서 배양하였다. 배양 후 8 일 동안 730 nm 파장에서 세포의 OD (optical density)를 확인하여 균주의 생장률을 측정하였고, 스쿠알렌 생산량은 세포 내부에 침착되어 있는 스쿠알렌을 유기용매 추출법(메탄올: 클로로폼=1:2)으로 추출하여 GC-MS 분석을 통해 측정하였다.
그 결과, 제작된 스쿠알렌 생산 균주인 SeSC37S-MEP(const) 및 SeSC35SII-MEP(const)는 균주의 생장률이 지속적으로 증가되었고, 상기 균주를 통해 스쿠알렌이 생산될 수 있음을 확인하였다 (도 4).
한국생명공학연구원 KCTC13870BP 20190621
<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Modified cyanobacterial gene expression system <130> R-2019-0349-KR-1 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4652 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSe1Bb1(const)s vector <400> 1 gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 60 gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 120 caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 180 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 240 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 300 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 360 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 420 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 480 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 540 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 600 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 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cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 1860 aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 1920 acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 1980 gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 2040 gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 2100 agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 2160 tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 2220 tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 2280 cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 2340 accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 2400 tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 2460 ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcatgatccc 2520 ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca 2580 accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccgacgtcc gactgcacgg tgcaccaatg 2640 cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg 2700 cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc 2760 ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat 2820 aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcagaattca aaagatccaa actcgagtaa 2880 ggatctccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta 2940 tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc 3000 ctttctgcgt ttatacctag ggcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 3060 cggtaatacg ggcaattcaa gagcatccaa agcctcttca accccaggaa cggcttgtag 3120 atgcgtttct aacgcgatac gggtacggcg ttgatagtgc tgaacaaagt cagggggtgg 3180 aggattgcct aaccgtcgct caattagttt gagacagtca gccatggaat gacccacaaa 3240 ctgctcaaac atgtcatcca aagtcaccaa cagacccagt tcattgagca tgtctgcaaa 3300 gacgcgatta gtgatgcgtt cgctatcaac aagcacacca tcacagtcga aaatcaccag 3360 ctgaaacggt gaagtttgca ttgtttttaa gcacgagcca tcaacagtaa gagcgatcgc 3420 gctgggacga tgtaatcgcg ccgtaggcag ggttttgcct catccggcag atgacaagct 3480 tcaagattcg gcagtgaagt atcgagcaag cgataccaaa cgcggccgcg aggaggcctc 3540 ggcaactgga agcgcaggtc ttcccagtaa gcattaaagg ctaggtaaag ccattcctgc 3600 tggcgaggat ggcagagact gacggccaga ctgtgggacc acagcgccca atcgggttgt 3660 ttgagtttga cgccatgcca gatggcatag ggacgacgcg gatggggttc gttctgcagc 3720 agttcgttct gttggaacat caccagcgac tgggaaagtt caatcaggcg gcgactgaac 3780 accaagaaat cggcatggcg atcgcacagc gaccaatcaa accagctgat ctcattgtct 3840 tggcagtagg cgttattgtt accctgctga ctgcgtttga cctcatcgcc catcgtcagc 3900 atcggtgtgc cctgggcgag gaataacgtg gcgagcaaat tgcgctgctg ccgttcccgt 3960 aagctcagaa tcgtggggtc atcggtctcg 3990 <210> 3 <211> 1707 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zymonas mobilis_pdc gene <400> 3 atgagctaca ccgtgggcac ctacctggcc gaacgcctgg tgcagatcgg cctgaaacac 60 cactttgccg tggccggcga ttacaacctg gtgctgctgg ataacctgct gctgaacaaa 120 aacatggaac aggtgtactg ctgcaacgaa ctgaactgcg gctttagcgc cgaaggctac 180 gcccgcgcca aaggcgccgc cgccgccgtg gtgacctaca gcgtgggcgc cctgagcgcc 240 tttgatgcca tcggcggcgc ctacgccgaa aacctgcccg tgatcctgat cagcggcgcc 300 cccaacaaca acgatcacgc cgccggccac gtgctgcacc acgccctggg caaaaccgat 360 taccactacc agctggaaat ggccaaaaac atcaccgccg ccgccgaagc catctacacc 420 cccgaagaag cccccgccaa aatcgatcac gtgatcaaaa ccgccctgcg cgaaaaaaaa 480 cccgtgtacc tggaaatcgc ctgcaacatc gccagcatgc cctgcgccgc ccccggcccc 540 gccagcgccc tgtttaacga tgaagccagc gatgaagcca gcctgaacgc cgccgtggaa 600 gaaaccctga aatttatcgc caaccgcgat aaagtggccg tgctggtggg cagcaaactg 660 cgcgccgccg gcgccgaaga agccgccgtg aaatttgccg atgccctggg cggcgccgtg 720 gccaccatgg ccgccgccaa aagctttttt cccgaagaaa acccccacta catcggcacc 780 agctggggcg aagtgagcta ccccggcgtg gaaaaaacca tgaaagaagc cgatgccgtg 840 atcgccctgg cccccgtgtt taacgattac agcaccaccg gctggaccga tatccccgat 900 cccaaaaaac tggtgctggc cgaaccccgc agcgtggtgg tgaacggcat ccgctttccc 960 agcgtgcacc tgaaagatta cctgacccgc ctggcccaga aagtgagcaa aaaaaccggc 1020 gccctggatt tttttaaaag cctgaacgcc ggcgaactga aaaaagccgc ccccgccgat 1080 cccagcgccc ccctggtgaa cgccgaaatc gcccgccagg tggaagccct gctgaccccc 1140 aacaccaccg tgatcgccga aaccggcgat agctggttta acgcccagcg catgaaactg 1200 cccaacggcg cccgcgtgga atacgaaatg cagtggggcc acatcggctg gagcgtgccc 1260 gccgcctttg gctacgccgt gggcgccccc gaacgccgca acatcctgat ggtgggcgat 1320 ggcagctttc agctgaccgc ccaggaagtg gcccagatgg tgcgcctgaa actgcccgtg 1380 atcatctttc tgatcaacaa ctacggctac accatcgaag tgatgatcca cgatggcccc 1440 tacaacaaca tcaaaaactg ggattacgcc ggcctgatgg aagtgtttaa cggcaacggc 1500 ggctacgata gcggcgccgg caaaggcctg aaagccaaaa ccggcggcga actggccgaa 1560 gccatcaaag tggccctggc caacaccgat ggccccaccc tgatcgaatg ctttatcggc 1620 cgcgaagatt gcaccgaaga actggtgaaa tggggcaaac gcgtggccgc cgccaacagc 1680 cgcaaacccg tgaacaaact gctgtag 1707 <210> 4 <211> 1152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zymonas mobilis_adh gene <400> 4 atggccagca gcacctttta catccccttt gtgaacgaaa tgggcgaagg cagcctggaa 60 aaagccatca aagacctgaa cggcagcggc tttaaaaacg ccctgatcgt gagcgatgcc 120 tttatgaaca aaagcggcgt ggtgaaacag gtggccgatc tgctgaaagc ccagggcatc 180 aacagcgccg tgtacgatgg cgtgatgccc aaccccaccg tgaccgccgt gctggaaggc 240 ctgaaaatcc tgaaagataa caacagcgat tttgtgatca gcctgggcgg cggcagcccc 300 cacgattgcg ccaaagccat cgccctggtg gccaccaacg gcggcgaagt gaaagattac 360 gaaggcatcg ataaaagcaa aaaacccgcc ctgcccctga tgagcatcaa caccaccgcc 420 ggcaccgcca gcgaaatgac ccgcttttgc atcatcaccg atgaagtgcg ccacgtgaaa 480 atggccatcg tggatcgcca cgtgaccccc atggtgagcg tgaacgatcc cctgctgatg 540 gtgggcatgc ccaaaggcct gaccgccgcc accggcatgg atgccctgac ccacgccttt 600 gaagcctaca gcagcaccgc cgccaccccc atcaccgatg cctgcgccct gaaagccgcc 660 agcatgatcg ccaaaaacct gaaaaccgcc tgcgataacg gcaaagatat gcccgcccgc 720 gaagccatgg cctacgccca gtttctggcc ggcatggcct ttaacaacgc cagcctgggc 780 tacgtgcacg ccatggccca ccagctgggc ggctactaca acctgcccca cggcgtgtgc 840 aacgccgtgc tgctgcccca cgtgctggcc tacaacgcca gcgtggtggc cggccgcctg 900 aaagatgtgg gcgtggccat gggcctggat atcgccaacc tgggcgataa agaaggcgcc 960 gaagccacca tccaggccgt gcgcgatctg gccgccagca tcggcatccc cgccaacctg 1020 accgaactgg gcgccaaaaa agaagatgtg cccctgctgg ccgatcacgc cctgaaagat 1080 gcctgcgccc tgaccaaccc ccgccagggc gatcagaaag aagtggaaga actgtttctg 1140 agcgcctttt ag 1152 <210> 5 <211> 2103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli_dxs gene <400> 5 atgagctttg atatcgccaa ataccccacc ctggccctgg tggatagcac ccaggaactg 60 cgcctgctgc ccaaagaaag cctgcccaaa ctgtgcgatg aactgcgccg ctacctgctg 120 gatagcgtga gccgcagcag cggccacttt gccagcggcc tgggcaccgt ggaactgacc 180 gtggccctgc actacgtgta caacaccccc tttgatcagc tgatctggga tgtgggccac 240 caggcctacc cccacaaaat cctgaccggc cgccgcgata aaatcggcac catccgccag 300 aaaggcggcc tgcacccctt tccctggcgc ggcgaaagcg aatacgatgt gctgagcgtg 360 ggccacagca gcaccagcat cagcgccggc atcggcatcg ccgtggccgc cgaaaaagaa 420 ggcaaaaacc gccgcaccgt gtgcgtgatc ggcgatggcg ccatcaccgc cggcatggcc 480 tttgaagcca tgaaccacgc cggcgatatc cgccccgata tgctggtgat cctgaacgat 540 aacgaaatga gcatcagcga aaacgtgggc gccctgaaca accacctggc ccagctgctg 600 agcggcaaac tgtacagcag cctgcgcgaa ggcggcaaaa aagtgtttag cggcgtgccc 660 cccatcaaag aactgctgaa acgcaccgaa gaacacatca aaggcatggt ggtgcccggc 720 accctgtttg aagaactggg ctttaactac atcggccccg tggatggcca cgatgtgctg 780 ggcctgatca ccaccctgaa aaacatgcgc gatctgaaag gcccccagtt cctgcatatc 840 atgaccaaaa aaggccgcgg ctacgaaccc gccgaaaaag atcccatcac ctttcacgcc 900 gtgcccaaat ttgatcccag cagcggctgc ctgcccaaaa gcagcggcgg cctgcccagc 960 tacagcaaaa tctttggcga ttggctgtgc gaaaccgccg ccaaagataa caaactgatg 1020 gccatcaccc ccgccatgcg cgaaggcagc ggcatggtgg aatttagccg caaatttccc 1080 gatcgctact ttgatgtggc catcgccgaa cagcacgccg tgacctttgc cgccggcctg 1140 gccatcggcg gctacaaacc catcgtggcc atctacagca cctttctgca gcgcgcctac 1200 gatcaggtgc tgcacgatgt ggccatccag aaactgcccg tgctgtttgc catcgatcgc 1260 gccggcatcg tgggcgccga tggccagacc caccagggcg cctttgatct gagctacctg 1320 cgctgcatcc ccgaaatggt gatcatgacc cccagcgatg aaaacgaatg ccgccagatg 1380 ctgtacaccg gctaccacta caacgatggc cccagcgccg tgcgctaccc ccgcggcaac 1440 gccgtgggcg tggaactgac ccccgtgaac ttcccgatcg cagctgagtc gtccctcccc 1500 caacggaaag ctgaacatct ccaactctgt cttgaggctg gagtcgaaag ccccgaggtg 1560 acgaccgggt tggagcgcta tcgtttccag cattgtgcgc tgccaaattt gagtctgcag 1620 gcgctggacc tagggacgca gttcttgggg cgatcgctgg gggcaccgct gctgatctcg 1680 tcgatgaccg gcggaaccga aaccctggaa aaactgccca tcggcaaagg catcgtgaaa 1740 cgccgcggcg aaaaactggc catcctgaac tttggcaccc tgatgcccga agccgccaaa 1800 gtggccgaaa gcctgaacgc caccctggtg gatatgcgct ttgtgaaacc cctggatgaa 1860 gccctgatcc tggaaatggc cgccagccac gaagccctgg tgaccgtgga agaaaacgcc 1920 atcatgggcg gcgccggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccaccg caaacccgtg 1980 cccgtgctga acatcggcct gcccgatttt tttatccccc agggcaccca ggaagaaatg 2040 cgcgccgaac tgggcctgga tgccgccggc atggaagcca aaatcaaagc ctggctggcc 2100 tag 2103 <210> 6 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli_idi gene <400> 6 atgcagaccg aacacgtgat cctgctgaac gcccagggcg tgcccaccgg caccctggaa 60 aaatacgccg cccacaccgc cgatacccgc ctgcacctgg cctttagcag ctggctgttt 120 aacgccaaag gccagctgct ggtgacccgc cgcgccctga gcaaaaaagc ctggcccggc 180 gtgtggacca acagcgtgtg cggccacccc cagctgggcg aaagcaacga agatgccgtg 240 atccgccgct gccgctacga actgggcgtg gaaatcaccc cccccgaaag catctacccc 300 gattttcgct accgcgccac cgatcccagc ggcatcgtgg aaaacgaagt gtgccccgtg 360 tttgccgccc gcaccaccag cgccctgcag atcaacgatg atgaagtgat ggattaccag 420 tggtgcgatc tggccgatgt gctgcacggc atcgatgcca ccccctgggc ctttagcccc 480 tggatggtga tgcaggccac caaccgcgaa gcccgcaaac gcctgagcgc ctttacccag 540 ctgaaatag 549 <210> 7 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli_ispA gene <400> 7 atggattttc cccagcagct ggaagcctgc gtgaaacagg ccaaccaggc cctgagccgc 60 tttatcgccc ccctgccctt tcagaacacc cccgtggtgg aaaccatgca gtacggcgcc 120 ctgctgggcg gcaaacgcct gcgccccttt ctggtgtacg ccaccggcca catgtttggc 180 gtgagcacca acaccctgga tgcccccgcc gccgccgtgg aatgcatcca cgcctacagc 240 ctgatccacg atgatctgcc cgccatggat gatgatgatc tgcgccgcgg cctgcccacc 300 tgccacgtga aatttggcga agccaacgcc atcctggccg gcgatgccct gcagaccctg 360 gcctttagca tcctgagcga tgccgatatg cccgaagtga gcgatcgcga tcgcatcagc 420 atgatcagcg aactggccag cgccagcggc atcgccggca tgtgcggcgg ccaggccctg 480 gatctggatg ccgaaggcaa acacgtgccc ctggatgccc tggaacgcat ccaccgccac 540 aaaaccggcg ccctgatccg cgccgccgtg cgcctgggcg ccctgagcgc cggcgataaa 600 ggccgccgcg ccctgcccgt gctggataaa tacgccgaaa gcatcggcct ggcctttcag 660 gtgcaggatg atatcctgga tgtggtgggc gataccgcca ccctgggcaa acgccagggc 720 gccgatcagc agctgggcaa aagcacctac cccgccctgc tgggcctgga acaggcccgc 780 aaaaaagccc gcgatctgat cgatgatgcc cgccagagcc tgaaacagct ggccgaacag 840 agcctggata ccagcgccct ggaagccctg gccgattaca tcatccagcg caacaaatag 900 900 <210> 8 <211> 2291 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sqs gene <400> 8 acgatttcag atccaaaaga tgtagctgtt gggtcagcca taagtttttc ttcaacttct 60 caagcgatcg tcgaccatca acttaaagca tctttacaaa gctagagatt gaccctagtc 120 gtggacgact tacagattca ggattgatac ggccaatccc gatcgcgatc gctctaaatc 180 cccgtcagtc agagcttcac aatttttagc gaatcttgtg gccgcgatcg ttgtataaga 240 atgccaaggc aactggataa ggttcactaa tcgttgctaa gcgacagtga actgcgccaa 300 ttgcctgaca ggcccctctc gtttaacaaa cgatttaatg taaatcattg ttaagagtct 360 ctcacaatcg agagttttct tgaagaatga tggggacggt tcaggtgcag ggtttccctg 420 ctagagaatg cgaaaaaacc gcgttctcgt tttaggaatc gagagtcaat aaaagtcgag 480 aacaggagac tggttgaatg acttttgatg ctttcaccaa ggtggtggca caagccgatg 540 cccgtggcga atttttgagc gacgcccaac tggacgcgct gagccgcttg gttgcagaag 600 gcaacaaacg gattgatacg gtcaaccgca tcaccggtaa tgcttcgtcg atcgtcgcta 660 acgcagcgcg tgcattgttt gcagagcaac cttctctgat tgctcctggc ggcaacgcat 720 acacgaaccg tcggatggcg gcttgtctgc gcgacatgga aatcattctc cgctacgtga 780 cctacgcggt cttcaccggc gatgcttcca ttctcgacga ccgctgtttg aacggtctgc 840 gtgagaccta cttggctctg ggcgtgcccg gtgcatcggt ggcagaaggc gttcgcaaga 900 tgaaagacgc agctgtggcg attgtgagcg accgcaacgg catcacccaa ggtgactgtt 960 cagcgatcat ttccgagctg ggcagctact tcgacaaagc tgctgctgca gttgccgggg 1020 gggggtctat gggcaaactg ctgcagctgg ccctgcaccc cgtggaaatg aaagccgccc 1080 tgaaactgaa attttgccgc acccccctgt ttagcatcta cgatcagagc accagcccct 1140 acctgctgca ctgctttgaa ctgctgaacc tgaccagccg cagctttgcc gccgtgatcc 1200 gcgaactgca ccccgaactg cgcaactgcg tgaccctgtt ttacctgatc ctgcgcgccc 1260 tggataccat cgaagatgat atgagcatcg aacacgatct gaaaatcgat ctgctgcgcc 1320 actttcacga aaaactgctg ctgaccaaat ggagctttga tggcaacgcc cccgatgtga 1380 aagatcgcgc cgtgctgacc gattttgaaa gcatcctgat cgaatttcac aaactgaaac 1440 ccgaatacca ggaagtgatc aaagaaatca ccgaaaaaat gggcaacggc atggccgatt 1500 acatcctgga tgaaaactac aacctgaacg gcctgcagac cgtgcacgat tacgatgtgt 1560 actgccacta cgtggccggc ctggtgggcg atggcctgac ccgcctgatc gtgatcgcca 1620 aatttgccaa cgaaagcctg tacagcaacg aacagctgta cgaaagcatg ggcctgtttc 1680 tgcagaaaac caacatcatc cgcgattaca acgaggatct ggtggatggc cgcagctttt 1740 ggcccaaaga aatctggagc cagtacgccc cccagctgaa agattttatg aaacccgaaa 1800 acgaacagct gggcctggat tgcatcaacc acctggtgct gaacgccctg agccacgtga 1860 tcgatgtgct gacctacctg gccggcatcc acgaacagag cacctttcag ttttgcgcca 1920 tcccccaggt gatggccatc gccaccctgg ccctggtgtt taacaaccgc gaagtgctgc 1980 acggcaacgt gaaaatccgc aaaggcacca cctgctacct gatcctgaaa agccgcaccc 2040 tgcgcggctg cgtggaaatc tttgattact acctgcgcga tatcaaaagc aaactggccg 2100 tgcaagatcc caactttctg aaactgaaca tccagatcag caaaatcgaa cagtttatgg 2160 aagaaatgta ccaggataaa ctgcccccca acgtgaaacc caacgaaacc cccatctttc 2220 tgaaagtgaa agaacgcagc cgctacgatg atgaactggt gcccacccag caggaagaag 2280 aatacaaata g 2291 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSI-forward primer <400> 9 acatcttcct gctccagaag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSI-reverse primer <400> 10 gaaagcgtga cgagcaggga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSII-forward primer <400> 11 ggctacggtt cgtaatgcca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NSII-reverse primer <400> 12 gagatcaggg ctgtacttac 20

Claims (23)

  1. lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 제 1 재조합 발현 벡터; 또는
    lacI 가 제거된 trc 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 목적 유전자의 지속적 발현 유도용 발현 카세트를 포함하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 제 2 재조합 발현 벡터.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 재조합 발현 벡터는 5'-NSI(neutral site I), SpcR (spectinomycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSI(neutral site I)을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 재조합 발현 벡터는 5'-NSII(neutral site II), kmR (kanamycin resistance), trc 프로모터, 목적 유전자 및 3'-NSII(neutral site II)을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 삭제
  7. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 형질전환체는 기탁번호 KCTC 13870BP 인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  10. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 벡터의 목적 유전자에 pdc 유전자 및 adh 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 pdc 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벡터.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 adh 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벡터.
  13. 제 10 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 형질전환체는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSII (Neutral Site-II)에 삽입되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  16. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 벡터의 목적 유전자에 dxs 유전자, idi 유전자 및 ispA 유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 dxs 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 idi 유전자는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 ispA 유전자는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벡터.
  18. 제 16 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 형질전환체는 cpcB1 유전자에 연결된 SQS 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터로 더 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 SQS 유전자는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  21. 제 18 항에 있어서,
    상기 형질전환체는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  22. 제 18 항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSI (Neutral Site-I)에 삽입되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  23. 제 18 항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus) 균주의 NSII (Neutral Site-II) 또는 NSIII (Neutral Site-III)에 삽입되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
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