CN111321162B - 一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法。根据终止子终止转录和保护上游基因mRNA的功能，设置了特征参数转录终止程度(α)、上游基因mRNA保护能力(β)和表观终止效率(η)。本发明还公开了表征上述终止子特征参数所用的探针质粒的构建方法及其应用。本发明中构建的终止子探针质粒为pTK、pTK‑dR和pTK‑sR，分别对应特征参数为α、β和η，为全面表征大肠杆菌终止子强度提供了有效工具，进而为合成生物学提供了精准的元件模块。

Description

一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法

技术领域

本发明涉及一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法，属于合成生物学技术领域。

背景技术

基因转录是指将RNA聚合酶(RNAP)招募至启动子后开始mRNA合成，当遇到终止子时解离并重复循环的一个过程。终止子是优化代谢途径和基因工程中的重要调控元件，不仅可以调节基因转录速率，还可以调节mRNA降解速率，从而调控蛋白的初始表达量。

终止子可以分为内源性终止子和ρ因子依赖型终止子。大肠杆菌中有大约80％的转录终止是由于内源性终止子的作用，并且相比较于ρ因子依赖型终止子，内源性终止子的结构和作用机制都更加的简单明确。内源性终止子位于基因的3＇-UTR区，表现为一个带有U-tract的发夹结构。终止子最短约20nts，最长为30多nts，其中发夹结构的茎长为5～9bp，环为3～5nts，U-tract为7～9nts。在转录过程中，当RNAP转录至终止子的U-tract时，转录速率会下降甚至出现暂停，此时终止子的发夹结构形成，从而使得RNAP解离并终止基因转录。在构建完整的基因回路时，终止子能及时有效地终止基因转录从而保证转录单元之间互不干扰，因此是一种必不可少的元件。另外，根据终止子终止转录程度的差异，可以将其用于重要中间代谢物的表达调控。例如在L-鸟氨酸的生产中通常采用敲除arg F基因的方法来提高产量，但却会导致生产成本的增加，并且影响菌体生长。Zhang等通过在arg F基因前插入终止子，在不影响菌体生长的前提下提高了鸟氨酸的产量。终止子除了能够单独用于基因调控，还可以和其它元件组合成用途多样的智能开关。比如将重组酶识别位点与终止子组合成逻辑门用来调控细胞的状态；将可以根据温度变化改变结构的RNA改造成终止子，成为温敏型的智能开关；还可以将终止子和适配体组合成核糖开关等。

为了能在构建基因回路时准确使用终止子，以及理性设计与终止子相关的智能开关，构建终止子文库并对终止子进行精确表征十分重要。Kingsford等用一种快速准确的计算机程序预测了343种原核生物基因组中的内源性终止子。Chen等构建了一个含有582个大肠杆菌终止子的基因文库并对其中的终止子强度进行了表征。Cambray等利用RNA水解酶位点构建了终止子表征模型，消除了在表征过程中由终止子本身所引起的误差。但是，已有的研究对终止子的表征都不够全面，影响终止子调控基因表达的使用。H Abe和H Aiba认为终止子除了能够终止基因转录这一基本作用外，其发夹结构和U-tract还可以保护上游基因转录物的稳定性。因此，在对终止子进行表征时，应考虑终止基因转录和对上游基因mRNA保护性两方面的因素。对终止子强度进行全面且精确的表征能让终止子在基因工程中发挥更大的作用。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一个全面表征终止子强度的方法。

本发明所要解决的另一个技术问题在于，提供了上述表征方法所使用的终止子探针质粒的构建方法。

本发明所要解决的最后一个技术问题在于，提供了上述终止子探针质粒的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统，由三个探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR组成；

其中，所述的探针质粒pTK以SEQ ID NO.4所示的质粒pK为骨架质粒，将探针单元1克隆到骨架质粒中，所述的探针单元1在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS1，并用诱导型启动子诱导基因表达；

所述的探针质粒pTK-dR以所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元2克隆到骨架质粒中，所述的探针单元2在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS2，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS2是在所述的待测终止子位点TTS1两侧各加一段SEQ ID NO.5所示的RNA水解酶识别位点序列；

所述的探针质粒pTK-sR以所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元3克隆到骨架质粒中，所述的探针单元3在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS3，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS3，是去除所述的待测终止子位点TTS2上游5＇端的RNA水解酶识别位点的序列。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的双荧光报告基因选自绿色荧光基因egfp和红色荧光基因mrfp；进一步优选绿色荧光基因egfp作为上游荧光基因，红色荧光基因mrfp作为下游荧光基因。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的待测终止子位点TTS1，由两个不同的酶切位点组成，且上游酶切位点为NheⅠ，下游酶切位点为SalⅠ。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的诱导型启动子为强诱导启动子tac。

作为本发明的进一步优选实施方式，所述的探针质粒pTK的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述的探针质粒pTK-dR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的探针质粒pTK-sR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种用于表征终止子表观终止效率的探针质粒pTK，所述的探针质粒pTK以SEQ IDNO.4所示的质粒pK为骨架质粒，将探针单元1克隆到骨架质粒中，所述的探针单元1在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS1，并用诱导型启动子诱导基因表达。

所述的探针质粒pTK的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。

一种用于表征终止子转录终止程度的探针质粒pTK-dR，其特征在于所述的探针质粒pTK-dR以权利要求1中所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元2克隆到骨架质粒中，所述的探针单元2在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS2，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS2是在权利要求6中所述的待测终止子位点TTS1两侧各加一段SEQ ID NO.5所示的RNA水解酶识别位点序列。

所述的探针质粒pTK-dR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

一种用于表征终止子对上游基因mRNA保护能力的探针质粒pTK-sR，所述的探针质粒pTK-sR以权利要求1中所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元3克隆到骨架质粒中，所述的探针单元3在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS3，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS3，是去除所述的待测终止子位点TTS2上游5＇端的RNA水解酶识别位点的序列。

所述的探针质粒pTK-sR的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。

所述的探针质粒pTK的构建方法，包括利用重叠PCR和一步克隆法将启动子tac、egfp基因、待测终止子位点TTS1和mrfp基因连接到线性化载体质粒pK两端。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的构建方法包括以下步骤：

(1)直接化学合成基因片段tac、gfp1和rfp1；tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，rfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(2)以片段tac和gfp1为模板，用引物tac-F/gfp-R1进行重叠PCR，得到片段tac-gfp1，再以片段tac-gfp1和rfp1为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp-TTS1-rfp；其中所述的tac-F序列如SEQ ID NO.6所示，gfp-R1序列如SEQ ID NO.7所示，rfp-R序列如SEQ ID NO.8所示；

(3)用引物K-F/K-R将骨架质粒pK线性化，再将片段tac-gfp1-TTS1-rfp1通过一步克隆法插入线性载体中，得到终止子探针质粒pTK；K-F序列如SEQ ID NO.9所示，K-R序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明所述的探针质粒pTK-dR的构建方法，其特征在于利用重叠PCR和一步克隆法将启动子、egfp基因、终止子待测位点TTS2和mrfp基因插入骨架载体质粒pK。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的构建方法包括以下步骤：

(1)直接化学合成得到片段tac、gfp2和rfp2；合成待测终止子位点TTS2的两条互补单链DNA序列，分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，退火后用引物DR-F/DR-R扩增片段TTS2；gfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，rfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，引物DR-F序列如SEQ ID NO.13所示，DR-R序列如SEQ ID NO.14所示；

(2)以片段tac和gfp2为模板，用引物tac-F/gfp-R2进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2；以片段TTS2和rfp2为模板，用引物DR-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段TTS2-rfp2；以片段tac-gfp2和TTS2-rfp2为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2-TTS2-rfp2；gfp-R2序列如SEQ ID NO.15所示；

(3)用引物K-F/K-R将骨架质粒pK线性化，再将片段tac-gfp2-TTS2-rfp2通过一步克隆法插入线性载体中，得到终止子探针质粒pTK-dR。

本发明所述的探针质粒pTK-sR的构建方法，，以所述的质粒pTK-dR为模板，用引物sR-F/sR-R扩增得到的片段经Dpn I酶消化后直接转化E.coliJM109感受态细胞中，得到终止子探针质粒pTK-sR；所述的引物sR-F序列如SEQ ID NO.16所示，sR-R序列如SEQ IDNO.17所示。

本发明所述的全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统在表征大肠杆菌终止子强度中的应用。

一种终止子质粒系统，在所述的三个探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR的待测终止子位点TTS1、TTS2、TTS3处分别插入待测终止子序列得到的终止子质粒。

本发明所述的终止子质粒系统在表征大肠杆菌终止子强度中的应用。

一种表征终止子强度的方法，定量检测所述的终止子质粒系统中三种终止子质粒的上游荧光蛋白和下游红色蛋白的表达强度，按照以下公式计算3个特征参数：表观终止效率η、转录终止程度α和上游基因mRNA保护能力β，

其中，p1、p2和p3分别代表所述的含有待测终止子的终止子质粒，c1、c2和c3分别代表对照组：所述的不含有待测终止子的探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR。

作为本发明的一种优选，η＝0.538*α+0.484*β。

有益效果：

本发明根据终止子的3个特征参数表观终止效率η、转录终止程度α和上游基因mRNA保护能力β，分别构建了探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR，其上下游报告基因的表达量之间有明显差异，通过定量检测上下游报告基因的表达差异，结合公式计算，能够获得表征终止子强度3个特征参数：表观终止效率η、转录终止程度α和上游基因mRNA保护能力β；通过这三个参数能够全面表征终止子强度。然后，经多元回归分析证明了转录终止程度和上游基因mRNA保护能力对表观效率具有相似的贡献度。最后，通过对终止子序列的分析发现终止子主要由GC碱基组成，并且茎结构中的GC碱基比例与转录终止程度α有关。对终止子进行全面表征，不仅可以帮助了解终止子在基因表达中的作用，还为终止子的合理改造提供了方向。

附图说明：

图1为终止子的3个探针质粒构建策略示意图。

图2为终止子探针质粒间上下游基因表达差异。(A)终止子探针质粒间上游绿色荧光基因的表达强度差异；(B)终止子探针质粒间下游红色荧光基因的表达强度差异。

图3为终止子特征参数的表征。

图4为终止子特征参数间的关系分析。(A)为终止子转录终止程度和上游基因mRNA保护能力对表观终止效率的贡献度；(B)为终止子转录终止程度和上游基因mRNA保护能力间的关系分析。

图5为终止子序列结构和特征参数间的关系。(A)为终止子序列中的碱基分析；(B)为终止子茎结构中的GC碱基比例和转录终止程度的关系；(C)为终止子茎结构中的GC碱基比例和上游基因mRNA保护能力的关系。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，以使本领域的技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但所举实例不作为对本发明的限定。

以下所述的实施例中所用的方法若无特别阐述则均为本领域技术人员所熟知的手段。实施过程中除了一步克隆试剂盒是由Vazyme公司提供，其余所用的酶均为TaKaRa公司产品。

实施例1：终止子表征的理性策略的建立

终止子探针质粒构建策略如图1。

1、终止子探针质粒pTK的构建方法。

直接合成得到片段tac、gfp1和rfp1，tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，rfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。先用引物tac-F/gfp-R1进行重叠PCR，得到片段tac-gfp1，再用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp-TTS1-rfp。

tac-F：5’-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACACCATCGAATGGTGCAA(SEQ ID NO.6)

gfp-R1：5’-TTTCGCTAGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA(SEQ ID NO.7)

rfp-R：5’-ACTCTTTTGTTTATTTTTCTTTAGGCGCCGGTGGAGTGG(SEQ ID NO.8)

用下述引物扩增质粒pK(SEQ ID NO.4)，再将片段tac-gfp1-TTS1-rfp1通过一步克隆法插入线性载体中，按照钙转法转化入E.coliJM109感受态细胞中，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板。转化子送测，经测序验证得到终止子探针质粒pTK。

K-F：5’-AGAAAAATAAACAAAAGAGTTTGTAG(SEQ ID NO.9)

K-R：5’-CACCACCACCACCAC(SEQ ID NO.10)

2、终止子探针质粒pTK-dR的构建方法。

直接合成得到片段tac、gfp2、rfp2，和待测终止子位点TTS2的两条互补单链DNA序列，退火后用下述引物扩增片段TTS2。tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，rfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示

待测终止子位点TTS2的两条互补单链DNA序列如下：

TTS2-U CCGCTTCTAGATATTATTTGTATTGATCTGGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGGCTAGCGAAAGGAGGAGTCGACTATTATTTGTATTGATCTCCTAGA(SEQ ID NO.11)

TTS2-L TCTAGGAGATCAATACAAATAATAGTCGACTCCTCCTTTCGCTAGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTACCAGATCAATACAAATAATATCTAGAAGCGG(SEQ ID NO.12)

DR-F：5’-GTACAAGTAAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGATATTATTTGTATTGATCTGGTAC(SEQ IDNO.13)

DR-R：5’-CTTTCTTAGTTAGTTAGATCTAGGAGATCAATACAAATAATAGTCGAC(SEQ IDNO.14)

以片段tac和gfp2为模板，用引物tac-F/gfp-R2进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2；以片段TTS2和rfp2为模板，用引物DR-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段TTS2-rfp2；以片段tac-gfp2和TTS2-rfp2为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2-TTS2-rfp2。

tac-F：5’-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACACCATCGAATGGTGCAA(SEQ ID NO.6)

gfp-R2：5’-CCGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCA(SEQ ID NO.15)

rfp-R：5’-ACTCTTTTGTTTATTTTTCTTTAGGCGCCGGTGGAGTGG(SEQ ID NO.8)

用引物K-F/K-R扩增质粒pK，再将片段tac-gfp2-TTS2-rfp2通过一步克隆法插入线性载体中，按照钙转法转化入E.coliJM109感受态细胞中，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板。转化子送测，经测序验证得到终止子探针质粒pTK-dR。

3、终止子探针质粒pTK-sR的构建方法。

以质粒pTK-dR为模板，用下述引物扩增得到的片段经Dpn I酶消化后，按照钙转法转化入E.coliJM109感受态细胞中，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板。转化子送测，经测序验证得到终止子探针质粒pTK-sR。

sR-F：5’-GCAAAAATCGTCCCCTGATCGCCCTTGCGACGTCTGCAGGCTAGCGAAAGGAG(SEQ IDNO.16)

sR-R：5’-CGATCAGGGGACGATTTTTGCGAAGAATTTCCAGCCGCGAATTCTTACTTGTAC(SEQ IDNO.17)

4、终止子探针质粒间上下游基因的表达差异。

从前期研究文献中获得12个不同强度的终止子，其序列如表1所示。

在上述终止子序列5＇端和3＇端分别加上NheⅠ和SalⅠ的酶切后碱基，并合成反向互补链(见表1)，用寡核苷酸退火法得到终止子双链并用T4多聚磷酸化酶磷酸化，然后分别将其与经NheⅠ和SalⅠ双酶切后的3种探针质粒连接，并将连接产物转化导入大肠杆菌，得到的转化子经进一步测序，得到一系列终止子重组探针质粒。将测序结果正确的重组大肠杆菌在IPTG的诱导下培养3h后，通过定量检测上游绿色荧光蛋白和下游红色荧光蛋白的表达强度，结果如图2所示，不同终止子探针质粒的上下游荧光基因的表达强度存在较大差异。

实施例2：终止子特征参数的表征及分析。

1、用3个特征参数表观终止效率η、转录终止程度α和上游基因mRNA保护能力β全面表征终止子强度，并通过构建对应的探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR计算终止子的特征参数，其公式如下：

其中，公式中的RFP和GFP分别代表红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的表达强度，p1、p2和p3分别代表含有待测终止子的探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR，c1、c2和c3分别代表对照组(不含有待测终止子)探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR。结果如图3所示，大多数终止子的上游基因mRNA保护能力β都大于1，说明终止子对上游基因mRNA的稳定性起到一定的不可忽视的积极作用。终止子间的转录终止程度α差异较大，并且表观终止效率η均高于对应的转录终止程度α，说明终止子的表观终止效率可能综合体现了其转录终止程度和上游基因mRNA保护能力两方面的因素。

2、通过多元回归分析，发现终止子的转录终止程度α、上游基因mRNA保护能力β和表观终止效率η之间存在一定的数量关系：η＝0.538*α+0.484*β(图4A)。从拟合公式的两个系数可以发现，转录终止程度和上游基因mRNA保护能力对终止子的表观终止效率的贡献度相似，但是转录终止程度对表观效率的影响要更高一些。同时也说明终止子对上游基因转录物的保护作用不可忽视。另外，从图4B可以看到，终止子的转录终止程度和上游基因mRNA保护能力之间未发现明显关联。

实施例3：终止子序列中GC碱基比例对其特征参数的影响。

终止子的序列的碱基组成会影响终止子强度，因此对终止子的序列中的AU碱基和GC碱基进行差异性分析。从图5A中可以看到，GC碱基比列高于AU碱基，并且其P值在0.0001～0.0002之间，具有明显差异。说明GC碱基间强作用力更有利于终止子结构的形成和稳定。另外，终止子序列中GC碱基主要集中在茎结构，因此进一步分析茎结构中GC碱基比例和终止子特征参数之间的关系。从图5B和5C中可以看到，茎中的GC碱基比例对终止子的转录终止程度有一定的积极作用(R²＝0.3424)，但是和上游基因mRNA保护能力没有关系。

表1

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统及方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5043

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaaaaataa acaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc 60

tgcttaattt gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt 120

tgcttcgcaa cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc 180

gacaaacaac agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatttga 240

tgcctggcag ttccctactc tcgcattgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 300

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaat taattcttag aaaaactcat cgagcatcaa 360

atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt 420

ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg 480

gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat 540

aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag 600

tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc 660

actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg 720

atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc 780

cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt 840

tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt 900

gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac 960

atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc 1020

atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc 1080

atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggccta gagcaagacg tttcccgttg 1140

aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca 1200

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 1260

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 1320

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 1380

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 1440

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 1500

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 1560

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 1620

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 1680

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 1740

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 1800

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 1860

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 1920

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 1980

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagccc 2040

tagccggata tagttcctcc tttcagcaaa aaacccctca agacccgttt agaggcccca 2100

aggggttatg ctagttattg ctcagcggtg gcagcagcca actcagcttc ctttcgggct 2160

ttgttagcag ccggatctca gtggtggtgg tggtggtgga caccatcgaa tggtgcaaaa 2220

cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga 2280

aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc 2340

gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga 2400

tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt 2460

tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg 2520

cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa 2580

gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc 2640

tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta 2700

atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct 2760

cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa 2820

tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc 2880

ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg 2940

ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt cccactgcga 3000

tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc 3060

tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt 3120

atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg 3180

accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct 3240

cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt 3300

tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgac 3360

tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 3420

aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg aattggtttt 3480

cccagtcacg accctaggga gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa 3540

ttgtgagcgg ataacaatta actaactaag aaaggacatg aacgatggtg agcaagggcg 3600

aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 3660

acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 3720

agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 3780

cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 3840

agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 3900

actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 3960

tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact 4020

acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 4080

tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 4140

acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt 4200

ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga 4260

ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaagctagc gaaaggagga 4320

gtcgacggaa ctcaagcttt aactaactaa gaaaggacat gaacgatggc ctcctccgag 4380

gacgtcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcgcatgg agggctccgt gaacggccac 4440

gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 4500

ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc 4560

cagtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg 4620

tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg 4680

accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 4740

ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 4800

tccaccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gatgaggctg 4860

aagctgaagg acggcggcca ctacgacgcc gaggtcaaga ccacctacat ggccaagaag 4920

cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaagacc gacatcaagc tggacatcac ctcccacaac 4980

gaggactaca ccatcgtgga acagtacgag cgcgccgagg gccgccactc caccggcgcc 5040

taa 5043

<210> 2

<211> 5118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatccgctc ccggcggatt tgtcctactc aggagagcgt tcaccgacaa acaacagata 60

aaacgaaagg cccagtcttt cgactgagcc tttcgtttta tttgatgcct ggcagttccc 120

tactctcgca ttgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 180

tatccgctca tgaattaatt cttagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 240

attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 300

aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 360

tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 420

gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt 480

ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 540

accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 600

acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 660

attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 720

agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 780

cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 840

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 900

tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 960

catgttggaa tttaatcgcg gcctagagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac 1020

accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgacc aaaatccctt 1080

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 1140

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 1200

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 1260

gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 1320

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 1380

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 1440

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 1500

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 1560

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 1620

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 1680

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 1740

cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 1800

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 1860

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agccctagcc ggatatagtt 1920

cctcctttca gcaaaaaacc cctcaagacc cgtttagagg ccccaagggg ttatgctagt 1980

tattgctcag cggtggcagc agccaactca gcttcctttc gggctttgtt agcagccgga 2040

tctcagtggt ggtggtggtg gtggacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg 2100

catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat 2160

acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg 2220

ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt 2280

acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg 2340

ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg 2400

ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct 2460

gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc 2520

cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat 2580

ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta 2640

cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg 2700

gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc 2760

gcaatcaaat tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc 2820

aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg 2880

atcagatggc gctgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg 2940

atatctcggt agtgggatac gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa 3000

ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac 3060

tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa 3120

aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 3180

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgactgtgc aggtcgtaaa 3240

tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc 3300

gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgaattg gttttcccag tcacgaccct 3360

agggagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac 3420

aattaactaa ctaagaaagg acatgaacga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 3480

gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 3540

ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 3600

ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 3660

gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 3720

aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 3780

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 3840

tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 3900

tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 3960

acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 4020

acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 4080

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 4140

ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaag aattcgcggc cgcttctaga tattatttgt 4200

attgatctgg tactagtagc ggccgctgca ggctagcgaa aggaggagtc gactattatt 4260

tgtattgatc tcctagatct aactaactaa gaaaggacat gaacgatggc ctcctccgag 4320

gacgtcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcgcatgg agggctccgt gaacggccac 4380

gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 4440

ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc 4500

cagtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg 4560

tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg 4620

accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 4680

ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 4740

tccaccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gatgaggctg 4800

aagctgaagg acggcggcca ctacgacgcc gaggtcaaga ccacctacat ggccaagaag 4860

cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaagacc gacatcaagc tggacatcac ctcccacaac 4920

gaggactaca ccatcgtgga acagtacgag cgcgccgagg gccgccactc caccggcgcc 4980

taaagaaaaa taaacaaaag agtttgtaga aacgcaaaaa ggccatccgt caggatggcc 5040

ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc ctgcccgcca ccctccgggc 5100

cgttgcttcg caacgttc 5118

<210> 3

<211> 5118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaatccgctc ccggcggatt tgtcctactc aggagagcgt tcaccgacaa acaacagata 60

aaacgaaagg cccagtcttt cgactgagcc tttcgtttta tttgatgcct ggcagttccc 120

tactctcgca ttgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 180

tatccgctca tgaattaatt cttagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 240

attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 300

aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 360

tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 420

gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt 480

ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 540

accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 600

acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 660

attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 720

agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 780

cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 840

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 900

tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 960

catgttggaa tttaatcgcg gcctagagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac 1020

accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgacc aaaatccctt 1080

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 1140

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 1200

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 1260

gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 1320

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 1380

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 1440

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 1500

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 1560

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 1620

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 1680

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 1740

cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 1800

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 1860

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agccctagcc ggatatagtt 1920

cctcctttca gcaaaaaacc cctcaagacc cgtttagagg ccccaagggg ttatgctagt 1980

tattgctcag cggtggcagc agccaactca gcttcctttc gggctttgtt agcagccgga 2040

tctcagtggt ggtggtggtg gtggacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg 2100

catgatagcg cccggaagag agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat 2160

acgatgtcgc agagtatgcc ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg 2220

ccagccacgt ttctgcgaaa acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt 2280

acattcccaa ccgcgtggca caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg 2340

ccacctccag tctggccctg cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg 2400

ccgatcaact gggtgccagc gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct 2460

gtaaagcggc ggtgcacaat cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc 2520

cgctggatga ccaggatgcc attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat 2580

ttcttgatgt ctctgaccag acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta 2640

cgcgactggg cgtggagcat ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg 2700

gcccattaag ttctgtctcg gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc 2760

gcaatcaaat tcagccgata gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc 2820

aacaaaccat gcaaatgctg aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg 2880

atcagatggc gctgggcgca atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg 2940

atatctcggt agtgggatac gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa 3000

ccaccatcaa acaggatttt cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac 3060

tctctcaggg ccaggcggtg aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa 3120

aaaccaccct ggcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 3180

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgactgtgc aggtcgtaaa 3240

tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc 3300

gacatcataa cggttctggc aaatattctg aaatgaattg gttttcccag tcacgaccct 3360

agggagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac 3420

aattaactaa ctaagaaagg acatgaacga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 3480

gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 3540

ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 3600

ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 3660

gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 3720

aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 3780

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 3840

tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 3900

tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 3960

acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 4020

acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 4080

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 4140

ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaag aattcgcggc tggaaattct tcgcaaaaat 4200

cgtcccctga tcgcccttgc gacgtctgca ggctagcgaa aggaggagtc gactattatt 4260

tgtattgatc tcctagatct aactaactaa gaaaggacat gaacgatggc ctcctccgag 4320

gacgtcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcgcatgg agggctccgt gaacggccac 4380

gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 4440

ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc 4500

cagtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg 4560

tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg 4620

accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 4680

ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 4740

tccaccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gatgaggctg 4800

aagctgaagg acggcggcca ctacgacgcc gaggtcaaga ccacctacat ggccaagaag 4860

cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaagacc gacatcaagc tggacatcac ctcccacaac 4920

gaggactaca ccatcgtgga acagtacgag cgcgccgagg gccgccactc caccggcgcc 4980

taaagaaaaa taaacaaaag agtttgtaga aacgcaaaaa ggccatccgt caggatggcc 5040

ttctgcttaa tttgatgcct ggcagtttat ggcgggcgtc ctgcccgcca ccctccgggc 5100

cgttgcttcg caacgttc 5118

<210> 4

<211> 2198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaaaataa acaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc 60

tgcttaattt gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt 120

tgcttcgcaa cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc 180

gacaaacaac agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatttga 240

tgcctggcag ttccctactc tcgcattgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 300

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaat taattcttag aaaaactcat cgagcatcaa 360

atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt 420

ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg 480

gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat 540

aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag 600

tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc 660

actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg 720

atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc 780

cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt 840

tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt 900

gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac 960

atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc 1020

atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc 1080

atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggccta gagcaagacg tttcccgttg 1140

aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca 1200

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 1260

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 1320

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 1380

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 1440

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 1500

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 1560

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 1620

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 1680

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 1740

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 1800

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 1860

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 1920

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 1980

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagccc 2040

tagccggata tagttcctcc tttcagcaaa aaacccctca agacccgttt agaggcccca 2100

aggggttatg ctagttattg ctcagcggtg gcagcagcca actcagcttc ctttcgggct 2160

ttgttagcag ccggatctca gtggtggtgg tggtggtg 2198

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tattatttgt attgatctgg t 21

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtggtggt ggtggtggtg gacaccatcg aatggtgcaa 40

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttgagttc cgtcgactcc tcctttcgct agcttacttg tacagctcgt cca 53

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actcttttgt ttatttttct ttaggcgccg gtggagtgg 39

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaaaataa acaaaagagt ttgtag 26

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccaccacc accac 15

<210> 11

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgcttctag atattatttg tattgatctg gtactagtag cggccgctgc aggctagcga 60

aaggaggagt cgactattat ttgtattgat ctcctaga 98

<210> 12

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctaggagat caatacaaat aatagtcgac tcctcctttc gctagcctgc agcggccgct 60

actagtacca gatcaataca aataatatct agaagcgg 98

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtacaagtaa gaattcgcgg ccgcttctag atattatttg tattgatctg gtac 54

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctttcttagt tagttagatc taggagatca atacaaataa tagtcgac 48

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgcgaattc ttacttgtac agctcgtcca 30

<210> 16

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcaaaaatcg tcccctgatc gcccttgcga cgtctgcagg ctagcgaaag gag 53

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgatcagggg acgatttttg cgaagaattt ccagccgcga attcttactt gtac 54

<210> 18

<211> 1391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagtggtggt ggtggtggtg gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 60

gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 120

atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 180

gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 240

ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 300

cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 360

atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 420

aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 480

tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 540

ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 600

gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 660

cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 720

atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 780

aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 840

agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 900

tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 960

ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 1020

ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 1080

ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 1140

agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg actgtgcagg tcgtaaatca 1200

ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac 1260

atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgaattggtt ttcccagtca cgaccctagg 1320

gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 1380

taactaacta a 1391

<210> 19

<211> 788

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gataacaatt aactaactaa gaaaggacat gaacgatggt gagcaagggc gaggagctgt 60

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 120

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 180

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 240

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 300

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 360

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 420

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 480

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 540

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 600

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 660

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 720

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaagctag cgaaaggagg agtcgacgga 780

actcaagc 788

<210> 20

<211> 749

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggaggagtcg acggaactca agctttaact aactaagaaa ggacatgaac gatggcctcc 60

tccgaggacg tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg ctccgtgaac 120

ggccacgagt tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc 180

gccaagctga aggtgaccaa gggcggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtcccct 240

cagttccagt acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacttg 300

aagctgtcct tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc 360

gtggtgaccg tgacccagga ctcctccctg caggacggcg agttcatcta caaggtgaag 420

ctgcgcggca ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg 480

gaggcctcca ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga gatcaagatg 540

aggctgaagc tgaaggacgg cggccactac gacgccgagg tcaagaccac ctacatggcc 600

aagaagcccg tgcagctgcc cggcgcctac aagaccgaca tcaagctgga catcacctcc 660

cacaacgagg actacaccat cgtggaacag tacgagcgcg ccgagggccg ccactccacc 720

ggcgcctaaa gaaaaataaa caaaagagt 749

<210> 21

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gataacaatt aactaactaa gaaaggacat gaacgatggt gagcaagggc gaggagctgt 60

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 120

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 180

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 240

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 300

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 360

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 420

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 480

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 540

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 600

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 660

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 720

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaagaatt cgcgg 765

<210> 22

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctaactaac taagaaagga catgaacgat ggcctcctcc gaggacgtca tcaaggagtt 60

catgcgcttc aaggtgcgca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg 120

cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg 180

cggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttccagtacg gctccaaggc 240

ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt 300

caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc 360

ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc 420

cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcggatgta 480

ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagatgagg ctgaagctga aggacggcgg 540

ccactacgac gccgaggtca agaccaccta catggccaag aagcccgtgc agctgcccgg 600

cgcctacaag accgacatca agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt 660

ggaacagtac gagcgcgccg agggccgcca ctccaccggc gcctaaagaa aaataaacaa 720

aagagt 726

Claims (7)

1.一种全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统，其特征在于由三个探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR组成；

其中，所述的探针质粒pTK以SEQ ID NO.4所示的质粒pK为骨架质粒，将探针单元1克隆到骨架质粒中，所述的探针单元1在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS1，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的探针质粒pTK的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的探针质粒pTK-dR以所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元2克隆到骨架质粒中，所述的探针单元2在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS2，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS2是在所述的待测终止子位点TTS1两侧各加一段SEQID NO.5所示的RNA水解酶识别位点序列；所述的探针质粒pTK-dR的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

所述的探针质粒pTK-sR以所述的质粒pK为骨架质粒，将探针单元3克隆到骨架质粒中，所述的探针单元3在双荧光报告基因间插入待测终止子位点TTS3，并用诱导型启动子诱导基因表达；所述的待测终止子位点TTS3，是去除所述的待测终止子位点TTS2上游5＇端的RNA水解酶识别位点的序列；所述的探针质粒pTK-sR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统中各质粒的构建方法，其特征在于：

所述的探针质粒pTK的构建方法包括以下步骤：

(1)直接化学合成基因片段tac、gfp1和rfp1，其中tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，rfp1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(2)以片段tac和gfp1为模板，用引物tac-F/gfp-R1进行重叠PCR，得到片段tac-gfp1，再以片段tac-gfp1和rfp1为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp-TTS1-rfp；其中所述的tac-F序列如SEQ ID NO.6所示，gfp-R1序列如SEQ ID NO.7所示，rfp-R序列如SEQ ID NO.8所示；

(3)用引物K-F/K-R将骨架质粒pK线性化，再将片段tac-gfp1-TTS1-rfp1通过一步克隆法插入线性载体中，得到终止子探针质粒pTK；K-F序列如SEQ ID NO.9所示，K-R序列如SEQID NO.10所示；

所述的探针质粒pTK-dR的构建方法包括以下步骤：

(i)直接化学合成得到片段tac、gfp2和rfp2；合成待测终止子位点TTS2的两条互补单链DNA序列，分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，退火后用引物DR-F/DR-R扩增片段TTS2；其中，tac的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，gfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，rfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，引物DR-F序列如SEQ ID NO.13所示，DR-R序列如SEQ ID NO.14所示；

(ii)以片段tac和gfp2为模板，用引物tac-F/gfp-R2进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2；以片段TTS2和rfp2为模板，用引物DR-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段TTS2-rfp2；以片段tac-gfp2和TTS2-rfp2为模板，用引物tac-F/rfp-R进行重叠PCR，得到片段tac-gfp2-TTS2-rfp2；gfp-R2序列如SEQ ID NO.15所示；

(iii)用引物K-F/K-R将骨架质粒pK线性化，再将片段tac-gfp2-TTS2-rfp2通过一步克隆法插入线性载体中，得到终止子探针质粒pTK-dR；

所述的探针质粒pTK-sR的构建方法，是以所述的质粒pTK-dR为模板，用引物sR-F/sR-R扩增得到的片段经Dpn I酶消化后直接转化E.coliJM109感受态细胞中，得到终止子探针质粒pTK-sR；所述的引物sR-F序列如SEQ ID NO.16所示，sR-R序列如SEQ ID NO.17所示。

3.权利要求1所述的全面表征大肠杆菌终止子强度的质粒系统在表征大肠杆菌终止子强度中的应用。

4.一种终止子质粒系统，其特征在于在权利要求1所述的三个探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR的待测终止子位点TTS1、TTS2、TTS3处分别插入待测终止子序列得到的终止子质粒。

5.权利要求4所述的终止子质粒系统在表征大肠杆菌终止子强度中的应用。

6.一种表征终止子强度的方法，其特征在于定量检测权利要求4所述的终止子质粒系统中三种终止子质粒的上游荧光蛋白和下游红色蛋白的表达强度，按照以下公式计算3个特征参数：表观终止效率η、转录终止程度α和上游基因mRNA保护能力β，

其中，p1、p2和p3分别代表权利要求4中所述的含有待测终止子的终止子质粒，c1、c2和c3分别代表对照组：权利要求1中的不含有待测终止子的探针质粒pTK、pTK-dR和pTK-sR。

7.根据权利要求6所述的一种表征终止子强度的方法，其特征在于η＝0.538×α+0.484×β。

Images