CN112501101B - 天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途。该菌株来源于小白链霉菌J1074，neo基因替换cebR基因，同时含有thaxtomin生物合成基因簇：txtC和txtH基因，txtB基因，txtA基因，PrpoD启动子，txtR基因，txtE基因，txtD基因。本发明敲除了S.albus J1074菌株中的负调控因子cebR基因；另一方面改良了thaxtomin基因簇中的正向调控因子txtR基因的启动子。使得获得的重组菌株可以在没有诱导剂“纤维二糖”的情况下，大量产生thaxtomins，该菌株还可以稳定的复制和遗传，为工业生产奠定了基础，提高了产量。

Description

天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途。
背景技术
天然除草剂thaxtomin A(结构式见图1)发现于可以导致马铃薯疮痂病的几种链霉菌中，包括“Streptomyces scabiei，Streptomyces acidiscabies，Streptomycesturgidiscabies，Streptomyces europaeiscabiei，Streptomyces stelliscabiei”(Loria,R.,Kers,J.,&Joshi,M.(2006).Evolution of plant pathogenicity in Streptomyces.Annu.Rev.Phytopathol.,44,469-487)。Thaxtomins系列产物能够抑制植物纤维素合成，导致植物块根或者块茎木栓质化，因而呈现出疮痂癍症状(Lawrence,C.H.,Clark,M.C.,&King,R.R.(1990).Induction of common scab symptoms in asepticallycultured potato tubers by the vivotoxin,thaxtomin.Phytopathology,80(7),606-608.)。已经发现由于其纤维素合成抑制的特性，赋予了thaxtomins良好的除草剂性质(King,R.R.,Lawrence,C.H.,&Gray,J.A.(2001).Herbicidal properties of thethaxtomin group of phytotoxins.Journal of agricultural and food chemistry,49(5),2298-2301.)。有研究表明，thaxtomins可用于控制农田杂草而不影响农作物生长(Koivunen M,Marrone P.Uses of thaxtomin and thaxtomin compositions asherbicides:U.S.Patent 10,010,079[P].2018-7-3.)；以及可用于控制水生植物中的藻类杂草(Kang,Y.,Semones,S.,Leder,J.,&Tran,A.(2011).U.S.Patent No.7,989,393.Washington,DC:U.S.Patent and Trademark Office.)。目前thaxtomins的生产方法有生物合成和化学合成，而化学合成工艺复杂，耗能较高，限制了thaxtomins的生产应用(Zhang,H.,Ning,X.,Hang,H.,Ru,X.,Li,H.,Li,Y.,...&Wang,X.(2013).Total synthesisof thaxtomin A and its stereoisomers and findings of their biologicalactivities.Organic letters,15(22),5670-5673.)。而由于thaxtomin原始产生菌的产量低和需要消耗诱导剂等缺陷，限制着生物合成的进一步发展。链霉菌中普遍存在的cebR基因是thaxtomin生物合成的负调控因子，通过结合thaxtomin生物合成基因簇中的两个cbs(CebR binding site)位点，发挥对thaxtomin合成的抑制作用(Francis,I.M.,Jourdan,S.,Fanara,S.,Loria,R.,&Rigali,S.(2015).The cellobiose sensor CebR is thegatekeeper of Streptomyces scabies pathogenicity.MBio,6(2),e02018-14.)。近年来，已经有不少在thaxtomin高产方面的努力(Jiang,G.,Zhang,Y.,Powell,M.M.,Zhang,P.,Zuo,R.,Zhang,Y.,...&Ding,Y.(2018).High-yield production of herbicidalthaxtomins and thaxtomin analogs in a nonpathogenic Streptomycesstrain.Appl.Environ.Microbiol.,84(11),e00164-18.)(Loria R,Jourdan S,Rigali S,et al.Methods for thaxtomin production and modified streptomyces withincreased thaxtomin production[P].2016-03-24.)(娄春波，赵学金.提高thaxtomin发酵产量的方法：CN109554415[P].2019-04-02)(Yousong,Ding.,Guangde,Jiang.Methodsfor thaxtomin production in engineered non-native streptomyces in the absenceof cellobise[P].2019-06-06)，但是以上的报道并没有在异源宿主中敲除thaxtomin生物合成的负调控因子，宿主对于thaxtomin的产生仍然具有严密调控。
发明内容
本发明目的在于提供天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其利用该菌株生产天然除草剂thaxtomins的高产办法。该菌株可以稳定的复制和遗传，同时可以在没有诱导剂“纤维二糖”的情况下，大量产生thaxtomins，为工业生产节省了成本，提高了产量。
为实现上述目的，本发明提供一种天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，该菌株来源于S.albus J1074，用neo基因替换掉cebR基因，同时含有thaxtomin生物合成基因簇，其中thaxtomin生物合成基因簇依次包括：P450单加氧酶txtC基因，MbtH-like蛋白txtH基因，非核糖体肽类合成酶txtB基因，非核糖体肽类合成酶txtA基因，PrpoD启动子，正向调控因子txtR基因，P450单加氧酶txtE基因，一氧化氮合成酶txtD基因。
进一步，所述thaxtomin基因簇来源为疮痂链霉菌ATCC 49173。
进一步，txtR的基因序列如SEQ ID NO:39所示，txtC，txtH，txtB，txtA，txtE和txtD的序列见Ding Y,Jiang G.METHODS FOR THAXTOMIN PRODUCTION IN ENGINEEREDNON-NATIVE STREPTOMYCES IN THE ABSENCE OF CELLOBIOSE:U.S.Patent Application16/768,347[P].2020-11-19。
进一步，制备方法为，
thaxtomin基因簇的制备：PCR分别扩增得到SEQ ID NO:11-15所示的五个片段，通过酶切连接将其拼装成完整的thaxtomin基因簇，再通过λ-RED介导的同源重组将基因簇转换到链霉菌整合载体上，获得带有thaxtomin基因簇的重组质粒A；
cebR基因敲除的突变菌株的制备：通过温敏型质粒介导的同源重组双交换，将小白链霉菌J1074CGMCC 4.7233基因组中的cebR基因替换为卡那霉素抗性基因neo，获得cebR基因敲除的突变菌株J1074ΔcebR；
Thaxtomin生物合成基因簇的制备：将SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38,与线性化的pBluescript II KS(-)载体同源重组，得到含有SEQ IDNO:36,39,37和38片段的重组载体B，；然后将重组载体B上的SEQ ID NO:36,39,37和38片段通过内切酶切下，再通过λ-RED介导的同源重组系统，将SEQ ID NO:36,39,37和38片段与重组质粒A进行同源重组，获得带有thaxtomin生物合成基因簇的重组质粒C；
菌株的筛选：将重组质粒C通过链霉菌-大肠杆菌穿梭系统接合转移至突变菌株J1074ΔcebR中，通过安普霉素筛选突变株，最终获得thaxtomin的高产菌株。
本发明还包含所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株用于制备thaxtomins的用途。
本发明的发明人从多个小白链霉菌J1074的启动子中筛选得到启动效果最好的启动子“PrpoD”进行基因簇的分子改造。
本发明通过克隆thaxtomin基因簇，并在异源宿主中进行异源表达，以及敲除宿主中的cebR基因，排除宿主中负调控的抑制，使得可以在不添加诱导剂(纤维二糖)的情况下，大量生产thaxtomins。另一方面，通过替换基因簇中txtR基因的启动子，获得了改良的thaxtomin生物合成基因簇。Thaxtomin的生物合成基因在几种致病性的链霉菌中都有存在，并且都处在一个称为“毒力岛”的区域内。本发明采用分段扩增酶切连接的方法，从疮痂链霉菌ATCC49173的基因组中克隆完整的thaxtomin基因簇。
首先根据thaxtomin基因簇的特征，利用基因簇中原有的酶切位点(SacⅠ，NsiⅠ，NcoⅠ和NotⅠ)将基因簇分为五个片段，依次通过链式聚合酶反应(PCR)从疮痂链霉菌ATCC49173的基因组中扩增出来。然后在限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用下，将五个DNA片段连接成完整的thaxtomin基因簇，并通过sanger测序确定基因簇完整正确。获得的thaxtomin基因簇在pBluescript II KS(-)质粒上，因为这个质粒具有多克隆位点(MSC)，这为基因簇的拼装提供了很大优势。随后利用λ-RED介导的同源重组将thaxtomin基因簇从pBluescript II KS(-)载体上转移到EcoRⅤ线性化的pSET152载体上，其中被切开的lacZ基因作为左右侧的同源臂。以此获得了pSET152::txt重组质粒。
小白链霉菌J1074基因组中含有thaxtomin生物合成的抑制因子cebR基因，利用同源重组双交换的方法，将其敲除。首先，我们构建了pKC1139::ΔcebR质粒(图7)，将其通过大肠杆菌-链霉菌穿梭系统，导入到S.albus J1074中，然后在50mg/L安普霉素的筛选下，挑选具有抗性的转化子，将这些转化子在50mg/L卡那霉素的筛选下培养3天，40℃，200rpm；随后将一部分菌液在无抗培养基中培养3天，40℃，200rpm。将无抗培养基中的菌液稀释涂布在含有安普霉素的培养基平皿上，同时影印至含有卡那霉素的培养基平皿，筛选其中具有卡那霉素抗性并对安普霉素敏感的菌株。使用PCR验证cebR基因的成功敲除，在cebR基因两侧的同源臂上设计引物(图7)进行PCR扩增验证。验证结果如图8所示，成功的获得了3个cebR基因缺失的突变株J1074ΔcebR。
在获得的thaxtomin基因簇中存在两个CebR蛋白结合位点——cbs(CebR BindingSite)，CebR蛋白是thaxtomin生物合成的抑制因子。本发明通过引物引入点突变的方法，将pSET152::txt质粒中的两个cbs进行点突变，获得重组质粒pSET152::txtΔcbs。
另一方面，本发明通过启动子筛选，获得了在小白链霉菌中的强启动子PrpoD。通过PCR从pSET152::txt质粒中扩增得到LH和txtR片段，从pUC119::neo质粒中扩增得到neo片段，从S.albus J1074的基因组DNA中扩增获得PrpoD片段。将获得的LH、neo、PrpoD和txtR片段通过同源重组试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit与线性化载体pBluescript II KS(-)进行同源重组，获得重组质粒pBS::LHneoPrpoDtxtR(图9)。然后，将片段LHneoPrpoDtxtR从载体中切下，并与pSET152::txtΔcbs质粒进行λ-Red介导的同源重组，最终获得了PrpoD启动子替换掉原始txtR基因启动子的重组质粒pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtR，即为改良的thaxtomin生物合成基因簇。该改造的基因簇可以赋予宿主自由产生thaxtomins的能力，在不添加诱导剂“纤维二糖”的培养基中大量生产thaxtomins化合物。
将pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtR导入到J1074ΔcebR中，获得突变菌株J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR。将转化子接种在TSB培养基中于28℃，200rpm培养48h以获取种子液，随后将种子液以10％的比例添加进ISP4(International Streptomyces Projectmedium 4)培养基中发酵。将发酵液用乙酸乙酯萃取，随后真空蒸干获取晶体，溶解在甲醇中，通过C18反相硅胶柱进行产物纯化，获得thaxtomin A纯品。进行串联质谱(MS/MS)分析并与标准品thaxtomin A对照，确定发酵液中的产物确是thaxtomin A(图11)。
将pSET152::txt质粒导入到J1074菌株中，获得菌株J1074-txt，将其与J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR菌株用同样的方式进行发酵培养，使用发酵培养基ISP4发酵，纤维二糖原本用于诱导thaxtomins的产生，同时也作为S.albus生长的碳源，但是纤维二糖作为消耗品价格高昂，花费较多，所以我们希望摆脱对其的依赖。在ISP4培养基中，分别发酵J1074-txt和J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR菌株，然后用HPLC检测发酵液中thaxtomin A的产量，结果显示本发明构建的thaxtomin高产菌株J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR比野生型菌株J1074-txt高出9倍的产量。thaxtomin A的产量在ISP4培养基中最高达186mg/L。
附图说明
图1是thaxtomin A的化学结构示意图。
图2是天然除草剂thaxtomins基因簇的结构示意图。
图3是克隆thaxtomin基因簇的方法示意图。
图4是pBluescript II KS(-)的载体图谱。
图5是带有thaxtomin基因簇的pSET152::txt质粒酶切验证结果图。
图6是pUC119::neo质粒的载体图谱。
图7是小白链霉菌S.albus J1074中cebR基因敲除原理示意图。
图8是小白链霉菌S.albus J1074中cebR基因敲除后的电泳检测图。
图9是thaxtomin生物合成基因簇分子改造示意图。
图10是验证cbs位点突变测序结果图。
图11是发酵产物的验证结果图。
图12是突变株生产thaxtomin A的产量检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例的PCR反应体系(50μl)：ddH2O：17μl；2X Phanta Max Buffer(含有2mMMg2+)：25μl；dNTP Mix(10mM each)：1μl；上游引物(10μM)：2μl；下游引物(10μM)：2μl；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：1μl；模板DNA：2μl(20-400ng)。
PCR反应程序：95℃预变性3min；(95℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸(1min延伸1kb)；重复30个循环)；72℃彻底延伸5min。
酶切体系：10X buffer：2μl；DNA片段或者载体：1～17μl(小于1μg)；限制性内切酶：1μl；ddH2O：补足20μl；37℃反应1小时。
连接体系：10X T4 DNA ligase buffer：2μl；50％PEG4000 solution：2μl；Linearvector DNA：20-100ng；Insert DNA：1-5倍的载体DNA量；ddH2O：补足20μl；T4 DNA ligase：0.2μl；16℃连接过夜。
同源重组体系：线性化载体：0.03pM；每个插入片段：0.03pM；5X CE MultiSBuffer：4μl；Exnase MultiS：2μl；ddH2O：补足20μl；37℃连接30分钟。
ISP4培养基的配制(1L)：可溶性淀粉：10g；硫酸铵：2g；碳酸钙：2g；磷酸氢二钾：1g；七水合硫酸镁：1g；氯化钠：1g；七水和硫酸亚铁：0.001g；四水合氯化亚锰：0.001g；七水合硫酸锌：0.001g。以上组分加入1L去离子水中，加热至完全溶解。然后121℃灭菌15min。
发酵培养：
收集链霉菌孢子，用棉花过滤器过滤，于OD450分光光度计下测量浓度，稀释孢子液至OD450＝0.5。10μl上述菌液添加到10ml的TSB培养基中，28℃200rpm培养48h。收集种子液，0.5ml种子液添加到50ml发酵培养基(ISP4)中，28℃200rpm培养6天，然后收集发酵液，用于检测thaxtomin A的产量。
HPLC样品处理与分析程序：
在发酵瓶中添加等发酵液体积的甲醇溶液，使thaxtomins完全溶解，将发酵液14000g离心20min，去除菌体与不溶物，收集上清液。而后使用岛津LC-20A HPLC系统和ZORBAX SB-C18色谱柱进行检测分析，分析程序：首先由10％的溶液B(添加0.1％甲酸的乙腈)洗脱3min，接着将溶液B由10％线性增加到50％在12min内，随后再将溶液B在2min内增加到100％，于100％的溶液B洗脱2min，然后在2min内将溶液B降低到10％，最后由10％溶液B保持13min。流速设置为1ml/min，在380波长下检测产物。
实施例1：克隆thaxtomin基因簇
本实施例可以结合图2-图5的示意图来说明。
图2是天然除草剂thaxtomins基因簇的结构示意图。其中包括两个非核糖体肽类合成酶(NRPS)txtA和txtB基因，负责thaxtomins骨架二酮哌嗪的形成；一个MbtH-like蛋白txtH基因，负责辅助TxtA和TxtB蛋白发挥功能；两个负责氧化催化的P450单加氧酶txtC和txtE基因；一个一氧化氮合成酶txtD基因，负责从精氨酸中产生一氧化氮，为催化氧化提供原料；一个正向调控因子txtR基因，负责激活txtA、txtB和txtC的转录表达。图3是克隆thaxtomin基因簇的方法示意图。从图3中可以看出，将20kb长的thaxtomin基因分成五段，每段以唯一的酶切位点分隔，分别用PCR获得了thaxtomin基因簇片段后，通过酶切连接将其拼装成完整的基因簇，再通过PCR-targeting技术将基因簇转换到pSET152载体上。
具体步骤如下：
设计引物Txt 1F/Txt 1R,Txt 2F/Txt 2R,Txt 3F/Txt 3R,Txt 4F/Txt 4R,andTxt 5F/Txt 5R(序列见表1)，通过标准PCR程序，以提取疮痂链霉菌ATCC49173的基因组DNA为模板，扩增获得txt1(SEQ ID NO:11所示)，txt2(SEQ ID NO:12所示)，txt3(SEQ ID NO:13所示)，txt4(SEQ ID NO:14所示)和txt5(SEQ ID NO:15所示)等五段DNA片段；(扩增条件为通用条件，如前所述)。
表1各引物的序列表
名称 具体序列 序列号
Txt 1F ATTTCTAGACTGGAAGCCCTCCTCGGATACG SEQ ID NO:1
Txt 1R ATTAAGCTTGCGGAACCCTTCGAGCTCAG SEQ ID NO:2
Txt 2F ATTTCTAGACGTCCTGAGCTCGAAGGGTTCC SEQ ID NO:3
Txt 2R ATTAAGCTTGCTGCTGGTCATGCATCACATCG SEQ ID NO:4
Txt 3F ATTTCTAGAGGCGGCGATGTGATGCATGACCAGC SEQ ID NO:5
Txt 3R ATTAAGCTTAGAACGCGGCCGCCGACGAG SEQ ID NO:6
Txt 4F ATTTCTAGACGGCGGCCGCGTTCTC SEQ ID NO:7
Txt 4R ATTAAGCTTGTCGAGATGCGGATCCATGGG SEQ ID NO:8
Txt 5F ATTTCTAGACCCATGGATCCGCATCTCG SEQ ID NO:9
Txt 5R ATTAAGCTTCCTGGCGGACTACGAGAAC SEQ ID NO:10
将上述扩增得到的五个片段和载体pBluescript II KS(-)(比如可购买于北京华越洋生物，见图4)分别用XbaⅠ，HindⅢ酶切，然后使用T4 DNA连接酶将五个片段分别连接在该载体上。
将带有片段txt1，txt2，txt3的载体分别用SacⅠ&HindⅢ，SacⅠ&NsiⅠ，NsiⅠ&HindⅢ处理后回收酶切后的片段，然后将酶切后的片段txt1，txt2，txt3依次拼装起来得到重组质粒pBluescript II KS(-)::txt123，将带有片段txt4，txt5的载体分别用Nco Ⅰ，XbaⅠ处理后回收酶切后的片段，然后将酶切后的片段txt4，txt5拼装起来得重组质粒pBluescriptII KS(-)::txt45，最后用NotⅠ和HindⅢ，将质粒pBluescript II KS(-)::txt123和质粒pBluescript II KS(-)::txt45分别酶切后，将插入片段和载体连接得到重组质粒pBluescript II KS(-)::txt12345。测序确定序列正确。将测序正确的质粒pBluescriptII KS(-)::txt12345命名为pBluescript II KS(-)::txt。
随后将克隆获得的pBluescript II KS(-)::txt质粒导入到菌株BW25113/pIJ790中，使用10mM阿拉伯糖诱导后，将EcoRⅤ酶切过的pSET152，电转化该菌株。(电转化参数：200Ω，25μF和2.5kV)通过安普霉素筛选pSET152::txt转化子。图5是pSET152::txt质粒酶切验证结果图(其中Pst I的附图表示用Pst I酶切pSET152::txt质粒的电泳结果图，Sac I的附图表示用Sac I酶切pSET152::txt质粒的电泳结果图)。再进行测序确定获得的thaxtomin基因簇完整正确(其中txtR的序列为SEQ ID NO:39；txtC，txtH，txtB，txtA，txtE和txtD的序列见Ding Y,Jiang G.METHODS FOR THAXTOMIN PRODUCTION IN ENGINEEREDNON-NATIVE STREPTOMYCES IN THE ABSENCE OF CELLOBIOSE:U.S.Patent Application16/768,347[P].2020-11-19)。
实施例2：构建cebR基因敲除质粒
设计引物cebR Up F/cebR Up R和cebR Dn F/cebR Dn R分别用于扩增cebR基因上游同源臂Up(SEQ ID NO:25所示)和下游同源臂Dn(SEQ ID NO:26所示)，使用S.albusJ1074的基因组DNA作为PCR扩增的模板。Kan F和Kan R(引物序列见表2)用于扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO:27所示)，使用pUC119::neo质粒(质粒图谱见图6，基因序列见SEQ IDNO:16)作为PCR扩增的模板。上述的三个片段与线性化载体pKC1139(比如可商购于北京华越洋生物)同时使用vazyme公司的
Figure BDA0002838600760000061
MultiS One Step Cloning Kit试剂盒，基于同源重组原理获得pKC1139::ΔcebR。该质粒用于敲除小白链霉菌J1074中的cebR基因。
表2引物序列表
名称 序列 序列号
cebR Up F GGCTGCAGGTCGACTCTAGAGACGACGTCCTTGTTCTC SEQ ID NO:17
cebR Up R GGCGAGCGGTATCCAGGGGAATCGGAGGAGACCGTAAC SEQ ID NO:18
cebR Dn F GCGGGACTCTGGGGTTCGGGGTCCTGAACACGGAGTTG SEQ ID NO:19
cebR Dn R TATGACATGATTACGAATTCGTGGGTGTAGCTCAGTTG SEQ ID NO:20
Kan F TCCCCTGGATACCGCTCG SEQ ID NO:21
Kan R CCCGAACCCCAGAGTCCC SEQ ID NO:22
VerifyCebR1-F1 AACGCGGCAGGCAACATC SEQ ID NO:23
VerifyCebR1-R1 TGCTGGCGCAGTTCCTTC SEQ ID NO:24
实施例3：敲除小白链霉菌J1074中的cebR基因
将实施例2获得的敲除质粒pKC1139::ΔcebR通过大肠杆菌-链霉菌穿梭系统，转移到小白链霉菌J1074中，在安普霉素抗性中筛选转化子，随后于50ml卡那霉素TSB培养基中40℃，培养三天，将培养后的菌液用无菌水洗去抗生素，取1ml菌液于无抗TSB培养基中40℃，培养三天。最后取菌液稀释涂布至卡那霉素抗性MS固体培养基上，28℃培养至长出突变株。挑取其中单克隆，于安普抗性及卡那抗性下筛选，获得安普敏感同时对卡那霉素具有抗性的菌株，便是正确的突变株J1074ΔcebR。结果见图7和图8。其中图7为小白链霉菌S.albus J1074中cebR基因敲除原理示意图。通过同源重组双交换将S.albus J1074基因组中的cebR基因替换成卡那霉素的抗性基因neo。图8为设计引物(VerifyCebR1-F1和VerifyCebR1-R1，引物序列见表2)用PCR验证基因敲除的突变株的电泳结果图，其中泳道M为marker，泳道wt为小白链霉菌J1074基因组DNA，泳道1为J1074ΔcebR-1的基因组DNA，泳道2为J1074ΔcebR-2的基因组DNA，泳道3为J1074ΔcebR-3的基因组DNA。可以看出野生型的小白链霉菌经过PCR扩增获得的条带比突变株的条带大，因此得出经过同源重组成功将卡那抗性基因替换到cebR基因的位置，敲除了cebR基因。
实施例4 Thaxtomin基因簇的分子改造即Thaxtomin生物合成基因簇的制备
1、构建重组质粒pBS::LHneoPrpoDtxtR。
通过PCR-targeting的方法将txtR原始的启动子替换为PrpoD。过程如图9所示。首先构建重组质粒pBS::LHneoPrpoDtxtR。
LH(SEQ ID NO:36所示)的扩增：用引物LH-txtRpBS-F/LH-txtR-R采用通用方法以pSET152::txt为模板(以下的pSET152::txt均为实施例1得到的)扩增左侧同源臂LH。
neo基因(SEQ ID NO:37所示)的扩增：用引物neo-PacⅠ-F/neo-PacⅠ-R采用通用方法以实施例2中的pUC119::neo为模板扩增neo基因。
启动子PrpoD(SEQ ID NO:38所示)的扩增：通过引物PrpoD-neoPacⅠ-F/PrpoD-txtR-R以小白链霉菌J1074 CGMCC 4.7233的基因组DNA为模板，扩增启动子PrpoD。
txtR(SEQ ID NO:39所示)基因的扩增：用引物TxtR-PrpoD-F/TxtR-pBS-R采用通用方法以实施例1得到的pSET152::txt为模板扩增txtR基因。
表3引物序列表
名称 序列 序列号
LH-txtRpBS-F GCGGTGGCGGCCGCTCTAGACGTCGCCTCAGTCAACCA SEQ ID NO:28
LH-txtR-R GCGGTATCCAGGTTAATTAACCTGCGGGTGGCAGTCCA SEQ ID NO:29
neo-PacⅠ-F AATTTAATTAACCTGGATACCGCTCGCCG SEQ ID NO:30
neo-PacⅠ-R AATTTAATTAAGTACCCGAACCCCAGAGT SEQ ID NO:31
PrpoD-neoPacⅠ-F TGGGGTTCGGGTACTTAATTAACGAGCAGCACTGACCCTC SEQ ID NO:32
PrpoD-txtR-R TGCATGCCTGAGCTCGACATGAACAACCTCTCGGAACGTTGAA SEQ ID NO:33
TxtR-PrpoD-F AACGTTCCGAGAGGTTGTTCATGTCGAGCTCAGGCATGCAG SEQ ID NO:34
TxtR-pBS-R TCGACGGTATCGATAAGCTTCGGGAACCCCGTGCCGAA SEQ ID NO:35
线性化载体pBluescript II KS(-)的获得：使用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ将载体pBluescript II KS(-)(载体图片见图4)线性化。
将上述PCR扩增获得的LH，neo，PrpoD和txtR片段通过同源重组试剂盒ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit与线性化载体pBluescript II KS(-)进行同源重组，随后转化大肠杆菌感受态DH5α，获得重组质粒pBS::LHneoPrpoDtxtR。将获得的重组质粒进行一代测序确定序列的正确性。
2、重组质粒pSET152::txtΔcbs的获得。
将thaxtomin基因簇中的cbs位点突变。步骤为：
片段Bcbs1(SEQ ID NO:48所示)的扩增：使用引物Txt 2F/BcbsC-M-R以pSET152::txt为模板扩增片段Bcbs1。
片段Bcbs2(SEQ ID NO:49所示)的扩增：使用引物BcbsC-M-F/Txt 2R以pSET152::txt为模板扩增片段Bcbs2。
片段Bcbs(SEQ ID NO:50所示)的扩增：使用引物Txt 2F/Txt 2R以PCR扩增得到的Bcbs1片段和Bcbs2片段的1：1(摩尔比)混合物为模板扩增得到片段Bcbs。
然后用限制性内切酶SacⅠ和NsiⅠ将载体pSET152::txt和PCR扩增得到的片段Bcbs分别酶切处理，再使用T4 DNA连接酶将两者连接成重组质粒pSET152::txtΔcbs1。
ARcbs1(SEQ ID NO:51所示)的扩增：使用引物Txt 4F/ARcbsd-1-R以pSET152::txt为模板扩增ARcbs1。
ARcbs2(SEQ ID NO:52所示)的扩增：使用引物ARcbsd-2-F/ARcbsd-2SrfI-R以pSET152::txt为模板扩增ARcbs2。
ARcbs(SEQ ID NO:53所示)的扩增：使用引物Txt 4F/ARcbsd-2SrfI-R以扩增产物ARcbs1和ARcbs2的混合物(摩尔比为1:1)为模板扩增ARcbs。
使用限制性内切酶NotⅠ和SrfⅠ将扩增得到的ARcbs片段和载体pSET152::txtΔcbs1分别酶切处理，随后使用T4 DNA连接酶将两者连接成重组质粒pSET152::txtΔcbs(即为thaxtomin基因簇中cbs位点敲除重组质粒)。测序验证如图10所示。其中A为Bcbs片段，B为ARcbs片段。
3、构建重组质粒pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtR。
使用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ酶切上述所得的重组质粒pBS::LHneoPrpoDtxtR载体得到LHneoPrpoDtxtR片段。
将上述所得的pSET152::txtΔcbs通过CaCl2介导的化学转化法导入菌株BW25113/pIJ790(可商购，比如商购于武汉淼灵生物科技有限公司)中得到BW25113/pIJ790-pSET152::txtΔcbs。
使用终浓度为10mM的阿拉伯糖诱导BW25113/pIJ790-pSET152::txtΔcbs菌株中λ-RED介导的同源重组系统进行表达，28℃，200rpm条件下生长至OD600为0.4-0.6，即可通过电转化将酶切得到的核酸片段LHneoPrpoDtxtR导入到BW25113/pIJ790-pSET152::txtΔcbs菌株，通过λ-RED介导的同源重组系统将txtR的启动子替换为PrpoD，得到BW25113/pIJ790-pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtRneo。
使用限制性内切酶PacⅠ将得到的BW25113/pIJ790-pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtRneo的抗性基因neo切下，而后在T4 DNA连接酶的作用下再将载体自身连接，即获得重组质粒pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtR(即为Thaxtomin生物合成基因簇的质粒)。
表4各引物的序列表
primer sequence
Txt 2F ATTTCTAGACGTCCTGAGCTCGAAGGGTTCC SEQ ID NO:40
BcbsC-M-R CAGTCGGCGCCCTCCCGCTGGGGGAGGACTTCAGC SEQ ID NO:41
BcbsC-M-F AGCGGGAGGGCGCCGACTGCGCTGTAGACCTCGTC SEQ ID NO:42
Txt 2R ATTAAGCTTGCTGCTGGTCATGCATCACATCG SEQ ID NO:43
Txt 4F ATTTCTAGACGGCGGCCGCGTTCTC SEQ ID NO:44
ARcbsd-1-R CGCTGTACAAGAGAGCGCTGCTTATTGACAGTGCCCTGCG SEQ ID NO:45
ARcbsd-2-F CGCAGGGCACTGTCAATAAGCAGCGCTCTCTTGTACAG SEQ ID NO:46
ARcbsd-2SrfI-R ATTAAGCTTGCCCGGGCCAGGGTGGCC SEQ ID NO:47
实施例5：Thaxtomin生物合成基因簇的表达
通过大肠杆菌链霉菌穿梭系统(比如ET12567/pUZ8002(ETZ)介导的大肠杆菌链霉菌穿梭系统)，将重组质粒导入到小白链霉菌J1074中，借助pSET152质粒中的φC31重组酶介导的位点特异性重组，重组质粒可以整合在链霉菌的基因组中，获得突变菌株。
本发明将pSET152::txt导入小白链霉菌J1074中获得J1074-txt菌株。
将thaxtomin生物合成基因簇即pSET152::txtΔcbsPrpoDtxtR导入到小白链霉菌J1074ΔcebR菌株中，获得J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR突变株。
实施例6：Thaxtomins的发酵：
将实施例5获得的突变株进行发酵，收集突变株孢子，用棉花过滤后于分光光度计下测量OD值，用无菌水稀释孢子液至OD450＝0.5。取10μl该稀释后孢子液置于10ml TSB培养基中，28℃，200rpm培养48h获得种子液，而后收集种子液，以10％的体积比添加至发酵培养基ISP4中，于28℃，200rpm培养6天，获得含有thaxtomins的发酵液。
实施例7纯化并检测发酵培养基中的thaxtomin A
在实施例6获得的带有thaxtomins的发酵液中添加等体积的甲醇溶液，使thaxtomins完全溶解在上清液中，将上清液在离心机中14000g离心20min，去除发酵液中菌体以及不溶物。使用真空蒸发仪抽干发酵液，获得黄色固体粉末thaxtomins。将该粉末溶于甲醇中，通过C18反向硅胶柱进行分离，最终获得纯品thaxtomin A。
因为thaxtomin A是thaxtomins系列产物中产量最高，除草活性最好的组分，所以在对高产菌株的产量检测时，主要检测该组分的产量。
使用纯品thaxtomin A，制备不同浓度的thaxtomin A甲醇溶液，经过HPLC分析，绘制thaxtomin A的标准曲线，用于HPLC产量分析。
将实施例6获得的带有thaxtomins的发酵液添加等体积的甲醇，充分溶解thaxtomins后，取上清进行HPLC检测。其峰面积对应标准曲线，即可获得发酵液中thaxtomin A的浓度。结果见图11和图12。
其中图11是发酵产物的验证结果图，发酵液中化合物与标准品的MS/MS分析结果一致。A为thaxtomin A标准品的结果图；B为小白链霉菌J1074-txt菌株的发酵液提取物的结果图。图12是突变株生产thaxtomin A的产量检测结果图，其中J1074-txt表示野生型菌株，J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR表示本发明中改良thaxtomin基因簇的突变株。
从图11可以看出，通过MS/MS验证发酵产物中的化合物与thaxtomin A的标准品分子碎裂模式一致。本发明通过分子克隆及异源表达获得的天然产物为thaxtomin A。
从图12可以看出，未去除cebR基因的菌株J1074-txt发酵制备thaxtomin A的产量为20mg/L；；本发明所构建的高产菌株J1074ΔcebR-txtΔcbsPrpoDtxtR发酵制备thaxtominA的产量可达186mg/L。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 天然除草剂thaxtomins 的高产菌株及其制备方法和用途
<130> XNDX-20001-CNI
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttctagac tggaagccct cctcggatac g 31
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attaagcttg cggaaccctt cgagctcag 29
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atttctagac gtcctgagct cgaagggttc c 31
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attaagcttg ctgctggtca tgcatcacat cg 32
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atttctagag gcggcgatgt gatgcatgac cagc 34
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
attaagctta gaacgcggcc gccgacgag 29
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atttctagac ggcggccgcg ttctc 25
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attaagcttg tcgagatgcg gatccatggg 30
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atttctagac ccatggatcc gcatctcg 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
attaagcttc ctggcggact acgagaac 28
<210> 11
<211> 4329
<212> DNA
<213> 疮痂链霉菌ATCC 49173
<400> 11
ctggaagccc tcctcggata cgaatggcgc tcgcgtctca ccgccggctg gctgatcggc 60
gtcgaccgcc gcgaacggtt ccgagcacgt atcggcgacc tgctcctggc cggcgaggtc 120
tgctattccg gcagcgccta ctgcttcgcc ctggcccgct tcggcacacc cgccgacgct 180
gagatcctca ccgcctacct ggaccgctat ctcccccgga ccgacctcca ctacgaccag 240
cccgccgccc tgggcgccct cctccgcctc gacgcccgcc tcggcaccca ccacgccgac 300
cgcttcacgg tgcccgacgg cctctgggac gagtgggcca agggcgtggg acgcctcggc 360
tactccaacc acacccccgc cgaacagcgc cgctggacag acctccagtg cgacttcgcc 420
aacggctggc gacgccagta ggtcgcggcg gaccacaaag gccgcccaac ctacttcgcg 480
caggtcagac ggcctttcgt cgaacgtatt agacgttgaa gcggaacgtt aacagtaagg 540
ctctcacctg cgtaaacggg gttctgagag attccagtca gcacagaatc agcacggccc 600
cccgaggacc gtcttctacc tcgacggcgt cgaccaccga gcccttggcc ggacgctcgc 660
acttcggcgg ccggtcgctg gccaatgccc gcttgaccgt gttcttcgag atgcccagat 720
gcctcgcgat cgcccggacc tgcatctgct cggcccggtg cagcctgcga atctccgccc 780
agtcctccac gcagatcacc ctctccctcc tgacctcaga tcaagatcag gttcgggcga 840
agatcaccaa gtgggtcact gtcggccctc cgtggccctg gcactgatag tgatccagaa 900
ccaggattcg agcgacgccg agaggcgggc gcgccggtat gaccgcccgc tgcgctgctc 960
cctcggccga cgcgtcgtag gcacgtgaca ctggtgctcg cctcgcggca ggcccggtca 1020
ccaggtcatg ggcagctcat ggatgccgta ggtggccatg tcgtgccgga acggcaggtc 1080
ttccagagcg caggcgagcc gcatgccggg cagccgtcgg atcaccgcgg gaatggcctc 1140
ctggagttcg actcgggcca gtgcctggcc gacgcactgg tggggtccgt aaccgaagcc 1200
gacatggggc acggacgggc ggtcgaagtc gagttcgtcc gggttcggga agacactctc 1260
gtcccggttg gccaggggga gcgccgccac caccatctgg ccggcccgca ccgtgacgcc 1320
gcccacctcg acgtcctcgg tggcgatcct gcccagtccg agctgcgaga cggtgtgata 1380
gcgcagcaac tcctcgacga gcaggggtat ccgctccggg tgttcgtgga cgacggagaa 1440
cttctccggc tgcagtgcat aactcaccaa ggacagcgag atggtgctgg ccgtcgtgtc 1500
gtagcccccg acgatgagca tgaggatcac gccgatggtc tcgtggaagg tgagctgctt 1560
ctcctggtac gggcccgtca ccaggcgccg gatcaggctg tcctcgggca gttcggaggg 1620
gtcctggacg agcccgccga tgtactcgcc gagtgtccgg aacacctcgg caccttcgtc 1680
ctcgctcccc accgccgaga ccacgccctt gacgcatcgg gtgagcaacg cgcggtcctc 1740
ggccggaatc cccagcagcc ggaagacggt cgcggacgcg accggtacgg cgaaggcctc 1800
gagcatgtcc tggggaggcg cggtctcggc gagcccgtcg agcacaccct ggacgatctc 1860
gcggatcgcg gggcgcagca gctcgatgtg cttgggcagg aactcgcgtg cgatggtgcc 1920
tcgcaggcgc cggtgatcag gattgtcggt gcgtacgaac ggcggtgccg cggcctgcga 1980
ctggagcgtc ggagtgagtt cggtgaagtt gggtcggcgc gagtccgagc tgaaccgcct 2040
gtcctgcagc acggtccgca catcctcata cccggagaac acgtgcgccg gcgtgccgtt 2100
ccacagaccg accttcgcca ccgggcagga cttggcctcc gggtagatgt gatagggctc 2160
caacggcgag ttcgccgggt cgacctgggt ggccggagat tccatggtgt cgtttccttt 2220
ccaagaccgc aggcctgggc cgtgcggcgt cgtgacggcg tctcgcgtca taccgcctgg 2280
tcgaaactga agaagcggtc cgggtcacag gccgccttga cccgggagag ccgggcggcg 2340
ttgtcgcggt agtactcacg tcagtcctgc aggtccggct cggtgaatcc gccgtaggtg 2400
ccgtgcgacg cggtcggctg cccaacaagt actgcgcgtc caggtgccag gacgccgtcg 2460
cggccgggtc gacgcggcca tcacacgctc gtgaccgctg cgcccgccgt ccgtgaacac 2520
gccgaggacg gcgtctacga cagaaccggc gacgggtgcg gaatggaggt cacccttgat 2580
ggcggcggag ccgacacgtg gcaggcgcgc tccttcccgg gtgcccaccc gatggcaggc 2640
acgaaccctc gtcggcacct acgccggact cgccgggttt ccggaaggtc tccagcatcg 2700
cgccgagaca gtccgtctcc gtcgtccggc gttcggctgg gtggggcacc gacgtgcccc 2760
acccagccgg tccagcaccg cccaagcgct tcgcccggcc ccggccggcc ttcgggacca 2820
ccaccggagc cggtgcggcg tcggtgccgt acgagaccat cggcagggac accacgtcct 2880
cggaatcggc ggtcgcccag ccgagccagc cgtaaacggc ccggttctcg gcgacccgtg 2940
gccccgctcg atgttattgg ccgggtcatt cacggacgga cgccgggcgc atgtccgtcc 3000
attccttctc gatgtactca agggcgcttc cgcgggggct cggcccgctc acggaacgcc 3060
acccggaggg gatgtcggcg aaattcggcc agagtgagaa ctggccttcc tcgttgcgga 3120
gcacatggaa ctgcccgtca tggtcgtcga agggtgaggg cacggtgaat ttctcctagt 3180
cggcaaagag ggcccggcac cgggaattga cggtgctttc ggtggctttc gcgatgattc 3240
ggggtcggac ggctacggcc gtggtgagaa ggcccgccgt tccggctcgg tgaggatgtc 3300
cagggtgtga aggcgtgcgt ccgggtcgcg gaccgcggcg gacagcagca ggagataccg 3360
ctccaggagc agttcgactg tctcctggga gaagaggtcc gagctgtact cggtacggcc 3420
ggtgaggccc tgggcgaggc cggcgctgtc ccggctctcg tcccagttga acatcagatc 3480
gaagcgggcc gttccggtgt tcgggggcgg ttcgggggtg agggtgacgg agtcggcccg 3540
atggccgtcg ccgggcggtg cgtgcaggac gagggccgtc tggtagagcg ggtgacgtgc 3600
cgggtggcgt gccgggttga cgcgatccac cacctggtcg aacgggacct cctggtgggt 3660
gaaggcgtcg aggtccacgg cccgggtccg agcgagcagg gtgcggaacg tcgggtcgcc 3720
cgaggtgtcg acgcgaagga cgacactgtt ggcgaacagc ccgacgaggt cgtccagcgc 3780
ggggtccgtg cgcgccgcgg cagcggtgcc gacgacgatg tcggtgccgc cgcccagccg 3840
ggtcagcagt gccgcgagcg cggcgtgcag caccatgaag agcgtcgcgc ccgtctcccg 3900
cgcgcagttg agcagttcct gatggaggga ggcttcgacg tgggtgtgga cggtgccgcc 3960
acgataggta ggtctggccg gacggctccg gtcggccggc agccgcgtct cgaccggaag 4020
accgcgcagc gtccgctccc agaaggcgag ctggcgcccg aagccgctgc cgcggtcctg 4080
cgcctcggct gcttgctcgt tgtgccatac ggcgtagtcg cgatagtgaa ccggcagcgg 4140
ctgccactgc ggggcccgct gccccagccg cgcccggtag gcgtgcgcca ggtccgccgt 4200
caggggggcc agcgaccagg cgtccacggt gatgtggtgc atcaggagca ggagcgtgta 4260
ccggtcctgt ccgtgccgga acaggcgtgc gcgcagggga aggtccgtcc tgagctcgaa 4320
gggttccgc 4329
<210> 12
<211> 4393
<212> DNA
<213> 疮痂链霉菌ATCC 49173
<400> 12
cgtcctgagc tcgaagggtt ccgccgcggc ccgcgccagg tggccggcca gacggtcttc 60
ggcggcgtcg gtctcatgaa ggaccaccgc ggcgtcctcg ggggcgagga cccgttggcg 120
ggggccgtca ccgtcatcgg ggaagacggt acgcaggggt tcgtgacgag ccacgacgtc 180
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<211> 2084
<212> DNA
<213> 疮痂链霉菌ATCC 49173
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tcgagatggg cggcgtacgg atcgaggccg ggcagactct cgccctgttc ctgggctcgg 2520
ccaaccggga cgccaacatg ttcgagcgac cgaacgactt cgacctcgac cgtcccaaca 2580
gcgctcggca cctgtcgttc ggccaagggg tgcacgcctg tctcgccgcg cagctcatct 2640
ccctgcagct gaagtggttc tacgtcgccc tgctgaaccg cttcccgggc atccggacgg 2700
cgggcgagcc gatctggaac gagaacctcg aattccgctc ccttcgctcc ctgccgctca 2760
gcctccgctg acgaggtcag cgctctactc ccctgcgagg aatcgtgacc tccgaagtcg 2820
ctctgggccc ttccttgccc gccccgtccc cgacagcgtg cccggcactg gggcccgatt 2880
cgtcccttgg cccggtcccg tcggcggaac cggcgacgcc gcagtcctgc ggcgtcgccg 2940
atccaaatga ggctgaggag ttcctgcgcc agttccacgc ggagcagtcc gatcagcccg 3000
tcccgctcgc ccggcgcctg gagcaggtcc gcgccgccat cgacgccacg ggcacctacc 3060
ggcacaccac cgccgagctc gtgtacggtg cccgcgtcgc gtggcgcaac tccagtcgct 3120
gcatcggccg cctgtactgg aacagcctgc gcgtcctgga ccgccgggac gccacagccc 3180
ccgatgagat ccaccggcac ttgtgcacgc acctgcgcca ggcgaccaac ggcgggcgca 3240
tcaggccggt gatttcggtc ttcgccccgg actcccccgg ccggcccggc ccgcaggtgt 3300
ggaacgagca gctcatccgg tacgccggct accgccgcga cgacggcacc gtgctcggtg 3360
acccgcgcac cgccgacctc accgaggcca tcctccgcct cggctggcag ggctgccccc 3420
aagggccgtt cgacgtcctg cccctggtca tcgacacccc cgacgacaaa ccccggttct 3480
tcgagctgcc gcgggagctg gtcttggagg tccctatcac ccaccccgac gtcccacgcc 3540
tggccgaact gggcctgcgc tggcacgccg tacccgtcat ctccaacatg cgcctacgca 3600
tcggcgggat ggactacccg ctcgccccgt tcaacggctg gtacatgggc acggagatcg 3660
gcgcccgcaa cctcgtcgac gaggaccgct acaacatgct ccccgccgtc gccgcctgcc 3720
tccagctgga caccaccagc gagtcaaccc tgtggcgcga ccgcgccctg gtcgagctca 3780
acgtcgccgt cctgcactcc ttcgaggccg caggtgtccg gatcagcgac caccacgagg 3840
agtcccggcg cttcctcgcc cacctggcca aggaggaacg ccagggccgc accgtatccg 3900
cagactggag ctggatcgtc cccccgctct ccggcggcat cacccccgtg ttccaccgtt 3960
actacgacaa cgtcgaccag cgccccaact tctaccccca ccagtgaagt gatgaggcgt 4020
ctacaacccc gccccgcagc atctgctcga cggccgccag tgccggcggc tgtcgaactc 4080
ctccaggaag acgaggtggg aatggccgca ggtgtggctg acgacgtctc ccaaggccgg 4140
agcctgcgcg ccctcaccgt gactcgattc gctctagcag cagctgggcg gtcgccagcc 4200
aatcccgtcg gcgtcggcgt cgacgctggt cagctatggc gcgcactgcc tgaccagatg 4260
cgagtcaccg tagcggacca gggcagatgg gcgggcacct gaatgccgaa cccggcggcg 4320
tcggacatgg cgcccactgg tcaaagcgca acgtctgcag cctgatcgcg ctcaccaact 4380
cccgtaccgc ctgcaatcca ccactcccag cggccaagca gccagcacat cgccggggcc 4440
gtcaacatga ccacagggcg gtgctgtcgc agcgcggctt cggcgaccgc cgcatcaatc 4500
gcgtaggtgt gcccgcgcaa gccggcatcc atcaacagct tcgaggccgc ccgcgcctcc 4560
tcgtcgccca ccgggactac gcgcagtccg gaaagcaccc ggttcaggca agacatgttc 4620
gtacgggcgt ggacggcctc gatgatggtg agcgcgctga taacgacctc catgccgcgc 4680
gagcgggcct cggcaaccag agccaccact tgctcgtcgt cggcgagcag cttcgaaacc 4740
ccccgctgcc gaggaccagc gtcccctcgt gactcagctt gcggcgggcc actcggcctc 4800
ctcggcgaac acctcgtcga agacgtgccg cgcccgctgc cgggcttgct cggagcccgg 4860
ctccttacgg ttctcgtagt ccgccagg 4888
<210> 16
<211> 4133
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240
catgcctgca ggtcgactct agaggatccc ctggataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 300
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagaatcaa attatcgagg ttgacacctt 360
ttgccgattc tggtagaatg acaccaacat agatcgatct gatcaagaga caggatgagg 420
atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 480
gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 540
ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 600
gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 660
cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 720
gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 780
tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 840
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 900
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgca 960
catacccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1020
ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1080
ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1140
tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1200
tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgggtaccg agctcgaatt 1260
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 1320
gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 1380
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 1440
ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg 1500
tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 1560
cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 1620
ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 1680
gcacctcgac cccaaaaaac ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 1740
atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 1800
ccaaactgga acaacactca accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt 1860
gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 1920
taacaaaata ttaacgttta caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 1980
cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 2040
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 2100
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 2160
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 2220
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2280
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 2340
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 2400
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 2460
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 2520
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 2580
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 2640
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 2700
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 2760
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 2820
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 2880
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 2940
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 3000
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 3060
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 3120
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 3180
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 3240
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3300
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3360
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3420
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3480
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 3540
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 3600
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 3660
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 3720
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 3780
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 3840
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 3900
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 3960
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 4020
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 4080
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aag 4133
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggctgcaggt cgactctaga gacgacgtcc ttgttctc 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggcgagcggt atccagggga atcggaggag accgtaac 38
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcgggactct ggggttcggg gtcctgaaca cggagttg 38
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tatgacatga ttacgaattc gtgggtgtag ctcagttg 38
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcccctggat accgctcg 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cccgaacccc agagtccc 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aacgcggcag gcaacatc 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tgctggcgca gttccttc 18
<210> 25
<211> 1831
<212> DNA
<213> S.albus J1074
<400> 25
ggctgcaggt cgactctaga gacgacgtcc ttgttctcct tcatgtactg gtcgtagagt 60
ccggcctcct tgaggccgaa cgcaccgaag accccgacgg tcagcgtggt cttcccctgg 120
tccgaaccgg catcgccccc ggcggcctcg ggctcgtcgt ccgacgcgca gcccgcgagc 180
aggctggtcc ccagggcggc gacggccgcc aggaccaccg ccttgcgggc cgtacggctt 240
ctcgtacgca tggtgcgcat ggtctcctcc tgacgccggt ccggtcccgg cccgtcaacc 300
cccttgcggg cggctgaagt cggctcctcc gggtcgaacc agggaatgta cgggtgttgg 360
agtggcagct agggtgggag cgctcccacc cgtgatgtcg tgaagagtcg cggctgcggg 420
caggagtgtc aagacacatg acgccgccag gtccggtcgg ttgtcggggc tccttcgcga 480
atacccggcc cttcagggcg aaacggcgcc tgtcgtcccc tgatcggcac ccgccgctca 540
catggaatcc gatacgatgt gagaatgcag caagtcaagc gggcgttcaa gtaccgcttc 600
taccccacgg acgagcaggc ggccgagctg tcccgcacgt tcggctgcgt ccgcctggtg 660
tacaacaagg cgctggagga gcgcacgcgg gcctggtaca cggagcggcg ccgcgtctcc 720
tacgtgcagt cgtcggccgc tctgacggag tggaagaaga ccgaggagct ggcctttctg 780
gcggaggtgt cctccgtccc gctccagcag gcactgcgtc acctccagac cgggttcggg 840
aacttcttcg ccaagcgggc gcagtacccg cgcttcaaga gccggaagaa gtcccgggcg 900
tcggccgagt acacccgcag cgctttcaag tggcgcgacg ggcaactgac tctggcgaag 960
atggcggagc cgctgggcat ccgctggtcg cgtccgcttc ccgaaggcgc ggagccgacg 1020
acggtgaccg tgtcccgcga cgccgcaggg cgttggttcg tgtctctgct gtgcgaggac 1080
tccctcccct ccgcaccggc tacctcggcg gccgtgggta tcgatgccgg gatcacctcc 1140
ctcgtcacgc tgtccaccgg ggagaagatc accaatcccc ggcatgagcg ccgtgatcgc 1200
gcccgcctgg ccaaagccca gcgtgagctg tcccgtaaga tgaagggctc ggcgaacagg 1260
gagaaggccc ggcgcgcggt cgccagggtc cacgcacgga tcgccgaccg gcgccgcgat 1320
ttcctgcaca aactgtccac ccgcctcgtc cgtgagaacc aaacggtcgt gatcgaggac 1380
ctcaccgtcc gcaacctgct gaagaacggc acgctcgcgc gtgtcatctc cgacgcttcg 1440
tggacgcaac tccgctccat gctggagtac aagtgcgcct ggtacgggcg cgaactcgtc 1500
gtgatcgacc gctggttccc gtccagcaag ctgtgcggga actgcggcac ggtccgtgcg 1560
aggctgccgt tgaacgtccg cgagtggacg tgtggctgcg gcgccgtgca tgaccgcgac 1620
gtgaacgcgg caggcaacat cctggccgcc gggctggcgg cgtctgcctg tggagacggt 1680
gtaagacctc aacgggagtc ctcccggacg gggcggtcgt cggtgaagca ggaaccccag 1740
cgggcgaccg ctggaatccc ccgccattag gcaggggagg aagtcaacgg gctgttacgg 1800
tctcctccga ttcccctgga taccgctcgc c 1831
<210> 26
<211> 1563
<212> DNA
<213> S.albus J1074
<400> 26
gcgggactct ggggttcggg gtcctgaaca cggagttggt ggtgcgggcc tcgtcctgag 60
ccggtcgcgg caccggcgcg gggtgcgccg ggggcgcgcg gccgagcctc ccgcccccgg 120
cccaccccgc gccgtaccat ccctcgggtg gaactccccg actacctgat caggctccag 180
cgcgcggccg acgacgaggg gcgccggctc gaacacctcg acgaggacga gcgggacgcg 240
gcgcggcgcc tctacttcaa cgccgcggcc gaggtcgacg tggccgtacg cgacttcgcc 300
gccaccgccg gactcgaccg ccacaccgtg gagaaggaac tgcgccagca ggcccgccag 360
ccccccacgg agtgagcgcg gcccgttgtc gtacccccca agtacggtcg gctccatgaa 420
cacccgtacg gacaccgcgc cccgccccgc cgccgtggtc aacgccgaga tccgcgccct 480
cctcatgcgc cgcggcggcc tgacccccgc cgagcgcgcg gcgtacgaga ggctgctcgt 540
cgagtgggcc caggcggtcc gcgccgaggt ggtcgtcgcg gcctgacccc tgcccctgtg 600
cggcggcacg ggccacgacc gccggcggca gctatggcgc cgtacggcct cagaggcggg 660
gcgcggctca gcccgcgtgt tccaggacgt cggcggcgac ctttttctcc agggcggccc 720
ggaccagtgc ggcggcgagg acggccgggc ccgcgtcccc ggcgaggcgg gccaggcgct 780
tcgggtcctg ggggaggccg agccgctcgg cgccctggcg ggccttgccg tcgaagcggg 840
gcgcgtactc gggccagacg gcctgggcct cgcgcaggaa gatgccggcg cccgcggggc 900
ccatgcccgg ggtctcccgc aggccctgga cgagggtctg ctcgtcgccg tcggcctcct 960
cgcggagctg ccgcaggtcc ccccggtgtg cgtcgaggag cagttcggca ccgtcgccga 1020
gctgggtcgc ggtccgctcg tcgtaccgtc ggtaaccgcc ctcgccgagg gcgtccaccc 1080
gctcctgcca gctcgcgtcg gccatggtgc gcggattgcg catcccgtcg tggaacaggg 1140
cgcgggcggc ggccaccgcg acggaggccc ggatgcgggc gctgagcagg gaactgagga 1200
cgagcaactg gtagagcggc tgcggggtgt ccttgagggt gatccccgcc tcccgcgcgt 1260
aggtgctgcc gtgccggtcg aggagggtgg cggcgacggc ggactgcgaa gcactcacgt 1320
ccggtctccc ttcgtacgag gcgtacgtgt ccctggaggc gtgcctgctt cccactgtgg 1380
cgcggatcgg gcgggatcgc gcggggagcg gcccgcgggg aacgccaaga gccccgtcct 1440
gatctttcag gacggggctc ttggccacag ggtgagtgac gggacttgaa cccgcggcca 1500
cctggaccac aaccaggtgc tctaccaact gagctacacc cacgaattcg taatcatgtc 1560
ata 1563
<210> 27
<211> 979
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tcccctggat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 60
agcggaagaa tcaaattatc gaggttgaca ccttttgccg attctggtag aatgacacca 120
acatagatcg atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg 180
gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 240
aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 300
ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc 360
ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 420
aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 480
accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 540
ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 600
ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 660
cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcacatacc cgacggcgag gatctcgtcg 720
tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 780
tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 840
gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 900
tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag 960
cgggactctg gggttcggg 979
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gcggtggcgg ccgctctaga cgtcgcctca gtcaacca 38
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcggtatcca ggttaattaa cctgcgggtg gcagtcca 38
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aatttaatta acctggatac cgctcgccg 29
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aatttaatta agtacccgaa ccccagagt 29
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tggggttcgg gtacttaatt aacgagcagc actgaccctc 40
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tgcatgcctg agctcgacat gaacaacctc tcggaacgtt gaa 43
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aacgttccga gaggttgttc atgtcgagct caggcatgca g 41
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tcgacggtat cgataagctt cgggaacccc gtgccgaa 38
<210> 36
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cgtcgcctca gtcaaccacc ccggcgtagc gagtgagtgc agttgagcgg atagctggtg 60
aggtaaaccc aacgggcgag ttcgatgaac gcacgtacgg ctgcgccgac aatcccgcag 120
gtggcttgcg caccgcccgc caagacaatg ctcctgtgtg cgcaccctca ggagccaaca 180
cacaactccg gtcaatcagt aggtacttga ctggactgcc acccgcagg 229
<210> 37
<211> 956
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cctggatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 60
ggaagaatca aattatcgag gttgacacct tttgccgatt ctggtagaat gacaccaaca 120
tagatcgatc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat 180
tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac 240
agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc 300
tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc 360
tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 420
cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc 480
ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 540
atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 600
ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 660
cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc acatacccga cggcgaggat ctcgtcgtga 720
cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca 780
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<213> 小白链霉菌J1074 CGMCC 4.7233
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ccctcgcggc ccacggcgcg ccctccgccg ccttccggtc cgccgcagct gccgcccccc 60
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cgtccttcac ccaggacagg ggccggaagc cgttattcaa cgttccgaga ggttgttc 718
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<213> 人工序列
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atgtcgagct caggcatgca gataaaatct ttcaaggccg gcggggtcaa ggtgacgatc 60
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ccgcagagaa cagtcatatg cgtactgtca ggaatggcgt tcatcgctgg taccggaaac 180
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
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tctccgaccg ctcccggcgg taccggccgg agccgctcgt cgaggacgtg gatgcgggtg 480
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cgctctggta ctggatgtgg ctgcgcagcg tcccgccgtc cgcggcggag gccagatgct 1740
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
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tcgcacgggc attgaactgc gcgtacgtga gcgccgtgtc cccggcgacg agcgcgatgg 1320
cgtcaggtgt gtcggccacc cgcgcttcga ggagactcgg ccacgtcgtg gcgagcgctc 1380
cctccgggag atcttcaccg gtcaggtgcg acacaggtat ccgttcctct ctgtcgtcga 1440
gccgcccgtg ggcgcgctca agccgatggc atggaaagcg gaagcagggg aggggaaaga 1500
cgtcgggcct acgtggggcc gagtggcgcc aggagtggtg agcgacgacg gttcgggggg 1560
ccacggggta cgggtgccgg cttctcctac gagaacccga gccaccgcgt gcggccgacg 1620
ggccgccgga tcgagaagcg gttgcaggag aaccgttctc agaatgtctt gtccgtcccg 1680
atgaagcagg tgtcgtagca ccgggaatcc ccctgtgaat ggttctcgca cgttggaaca 1740
taagcatcat ggggttgttt ccgcggcgca gtcttgtcgg tcagtgaccg cgtcgttgcc 1800
tctggacgcc aggcttccgt ttgcagcggg agctactgcg aggaggccac gtgccgacga 1860
tccagcgggg tcgggcaacg gtgaggtggt gatccgcgcc cggggtcctg cagcccccgc 1920
cacctcgcaa aatttcgaca aacaaattcg acacaggaag accagacttc cgcgaccgga 1980
ggaaagcgca gggagctgcc tgtgacttcc cgcatcggca gcgctcgcgc tcgacgactc 2040
cgtccgtccg gcgggccgtc gcctcagtca accaccccgg cgtagcgagt gagtgcagtt 2100
gagcggatag ctggtgaggt aaacccaacg ggcgagttcg atgaacgcac gtacggctgc 2160
gccgacaatc ccgcaggtgg cttgcgcacc gcccgccaag acaatgctcc tgtgtgcgca 2220
ccctcaggag ccaacacaca actccggtca atcagtaggt acttgactgg actgccaccc 2280
gcagggcact gtcaataagc agcgctctct tgtacagcg 2319
<210> 52
<211> 296
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
cgcagggcac tgtcaataag cagcgctctc ttgtacagcg cagcacctcc tgatgagcag 60
tgacggactc gcacggactc agtaagcgaa gacgcgcacg gccccttccc cttacggccg 120
ttcgtggcct cgtgatgagt gaggaaaacc tgatggacaa atttgcctcg gacagacctg 180
gaaacccgat cgcggcgacg gagtttctct ctccgcactg tttccggagg cgctggccac 240
ggcatggaga aacggggcgc gaccgttacg gccaccctgg cccgggcaag cttaat 296
<210> 53
<211> 2575
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
atttctagac ggcggccgcg ttctcgggta tgacgtaggc ggcgaggtat ggctctccgg 60
gccggtcctc acgcaggacg acggcggcct gccggacccc gcggcacccg gcgatgacgg 120
attcgatctc gcccggctcg atacggaagc cgcgtacctt gacctggtcg tccgccctgc 180
cgacgaactc caggtctcct gaacgggtcc agcggccgag gtcaccgctg cggtacatac 240
ggctgccggc cgggccgaag gggtccgcca cgaaccgctg cgcggtcaga cccggccgct 300
cgaggtaccc gcgtgccagg ctgtgccccg cgatgtagat ctcgccgacc gctcccggca 360
caaccggtgc gaggcggtcg tcgaggacat ggatccgggt gccgtccacc gcccggccga 420
ccggcggcgc cacgtcgtcg gccagcggat cgctcatggt ggcgcagacg gtggactccg 480
tcgggccgta ggcgttcacc atcgtccggt gcgggcgcca gcgctgcacg agagccgccg 540
ggcacgcttc gcccgcgacg accagcgtca cgctcggagg cagcatgtcg gggcccagcg 600
cacccgcgac cgagggcggg agagtgacat gagtgactcc gtggtccgcg atcaacgcgg 660
ccagttcggc gtcgggcagc agccgccccg gcctgccgac cacgagcgcg gccccggcca 720
gcagcgccat cgacatctcc cagaaactgg cgtcgaaact cggggacgag aaggcgagca 780
cgcgtgaggc gccggtgacg gcgaggcgac gacgctgggt cgcgatcagg ctcgcgacgc 840
cttggtgggt gacgacgact cccttgggga tccccgtgga gccggaggtg tagatgatgt 900
aggcgggact cgcggggcgc agtggctcca aacgttcccc gtcctccatg tcgtggtccg 960
gcagacggcg cagtacgtcc tcggtggcct cgtcgtccag taccacgagg ctgccggtgg 1020
gcagctggcc cagaaggtcg ccccggacgt ccgacgtcgt caccagcacc acgggtgctg 1080
cgtcccgggc catgaaggac agtcgctcca cggggtagtt cggatccagc ggcaggtacg 1140
cggccccgca cttgagcacg gccgtcgcgc acaggaagaa gtccgcggac ctgcccagca 1200
ccagcccgac cgaccgctcc ggcccggcgc cgaggtactt cagccaccgg gcgagccggt 1260
tcgcacgggc attgaactgc gcgtacgtga gcgccgtgtc cccggcgacg agcgcgatgg 1320
cgtcaggtgt gtcggccacc cgcgcttcga ggagactcgg ccacgtcgtg gcgagcgctc 1380
cctccgggag atcttcaccg gtcaggtgcg acacaggtat ccgttcctct ctgtcgtcga 1440
gccgcccgtg ggcgcgctca agccgatggc atggaaagcg gaagcagggg aggggaaaga 1500
cgtcgggcct acgtggggcc gagtggcgcc aggagtggtg agcgacgacg gttcgggggg 1560
ccacggggta cgggtgccgg cttctcctac gagaacccga gccaccgcgt gcggccgacg 1620
ggccgccgga tcgagaagcg gttgcaggag aaccgttctc agaatgtctt gtccgtcccg 1680
atgaagcagg tgtcgtagca ccgggaatcc ccctgtgaat ggttctcgca cgttggaaca 1740
taagcatcat ggggttgttt ccgcggcgca gtcttgtcgg tcagtgaccg cgtcgttgcc 1800
tctggacgcc aggcttccgt ttgcagcggg agctactgcg aggaggccac gtgccgacga 1860
tccagcgggg tcgggcaacg gtgaggtggt gatccgcgcc cggggtcctg cagcccccgc 1920
cacctcgcaa aatttcgaca aacaaattcg acacaggaag accagacttc cgcgaccgga 1980
ggaaagcgca gggagctgcc tgtgacttcc cgcatcggca gcgctcgcgc tcgacgactc 2040
cgtccgtccg gcgggccgtc gcctcagtca accaccccgg cgtagcgagt gagtgcagtt 2100
gagcggatag ctggtgaggt aaacccaacg ggcgagttcg atgaacgcac gtacggctgc 2160
gccgacaatc ccgcaggtgg cttgcgcacc gcccgccaag acaatgctcc tgtgtgcgca 2220
ccctcaggag ccaacacaca actccggtca atcagtaggt acttgactgg actgccaccc 2280
gcagggcact gtcaataagc agcgctctct tgtacagcgc agcacctcct gatgagcagt 2340
gacggactcg cacggactca gtaagcgaag acgcgcacgg ccccttcccc ttacggccgt 2400
tcgtggcctc gtgatgagtg aggaaaacct gatggacaaa tttgcctcgg acagacctgg 2460
aaacccgatc gcggcgacgg agtttctctc tccgcactgt ttccggaggc gctggccacg 2520
gcatggagaa acggggcgcg accgttacgg ccaccctggc ccgggcaagc ttaat 2575

Claims (5)

1.一株天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，该菌株来源于S.albusJ1074，用neo基因替换掉cebR基因，同时含有thaxtomin生物合成基因簇，其中thaxtomin生物合成基因簇依次包括：P450单加氧酶txtC基因，MbtH-like蛋白txtH基因，非核糖体肽类合成酶txtB基因，非核糖体肽类合成酶txtA基因，PrpoD启动子，正向调控因子txtR基因，P450单加氧酶txtE基因，一氧化氮合成酶txtD基因；所述PrpoD启动子来源于小白链霉菌J1074。
2.如权利要求1所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，所述thaxtomin基因簇来源为疮痂链霉菌ATCC 49173。
3.如权利要求1所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，所述txtR的基因序列如SEQ ID NO:39所示。
4.如权利要求3所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株，其特征在于，制备方法为，
thaxtomin基因簇的制备：PCR分别扩增得到SEQ ID NO:11-15所示的五个片段，通过酶切连接将其拼装成完整的thaxtomin基因簇，再通过λ-RED介导的同源重组将基因簇转换到链霉菌整合载体上，获得带有thaxtomin基因簇的重组质粒A；
cebR基因敲除的突变菌株的制备：通过温敏型质粒介导的同源重组双交换，将小白链霉菌 J1074 CGMCC 4.7233基因组中的cebR基因替换为卡那霉素抗性基因neo，获得cebR基因敲除的突变菌株J1074ΔcebR；
Thaxtomin生物合成基因簇的制备：将SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38,与线性化的pBluescript II KS(-)载体同源重组，得到含有SEQ ID NO:36,39,37和 38片段的重组载体B；然后将重组载体B上的SEQ ID NO:36,39,37和 38片段通过内切酶切下，再通过λ-RED介导的同源重组系统，将SEQ ID NO:36,39,37和 38片段与重组质粒A进行同源重组，获得带有thaxtomin生物合成基因簇的重组质粒C；
菌株的筛选：将重组质粒C通过链霉菌-大肠杆菌穿梭系统接合转移至突变菌株J1074ΔcebR中，通过安普霉素筛选突变株，最终获得thaxtomin的高产菌株。
5.权利要求1-4任一所述天然除草剂thaxtomins的高产菌株用于制备thaxtomins的用途。
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