CN117187121A - 一种康土抑草菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物或酶技术领域，具体公开了一种康土抑草菌及其应用。一种康土抑草菌，为卡氏酸链霉菌（Streptomyces acidiscabies），保藏编号为CCTCC M 20231081。本发明还提供了康土抑草菌在除草剂中的应用。与现有技术相比，本发明制备的康土抑草菌具有除草活性、适应性强、稳定性好、不易老化等优点，其所制备的生物型绿色除草剂能够防治农业草害，改良土壤，符合可持续绿色发展的要求。

Description

一种康土抑草菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物或酶技术领域，尤其涉及一种康土抑草菌及其应用。

背景技术

杂草的防治是农业生产的一个重要环节，虽然随着近代农业机械化和化学农药的推广应用，杂草危害已经得到了一定控制。化学防治是目前防治农田杂草的主要手段，然而随着化学除草剂的长期使用，也带来了诸如环境污染、农产品农药残留、杂草抗药性上升等负面影响。相对于化学除草剂，微生物除草剂具有环境友好、对作物安全性高、杂草不容易产生抗性等特点。因此，研究和开发微生物除草剂具有广阔的前景。

除草剂使用中常常伴随着药液流失、雾滴飘移、蒸发等问题，导致药液沉积性差，对杂草的防除效果不佳。除草剂的防除效果与靶标杂草的叶片结构特征及除草剂药液的物理性状关系密切，很多茎叶处理除草剂具有较好的除草活性但田间防除效果并不理想，这与药液在杂草表面的铺展和持留密切相关。喷雾助剂是添加到农药喷洒液中用来提高农药对有害生物防除效果的辅助制剂。助剂能够通过降低除草剂药液的表面张力，提高药液黏度，促进药液对杂草叶片的润湿和展布，增加药液在杂草表面的黏附与沉积，实现除草剂的利用率和杂草防效的提高。

中国专利202010166462.6公开了一种具有除草活性的双色平脐蠕孢菌及其应用。一种双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor(Mitra)Shoem)SYNJC-2-2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年9月2日，保藏号：CGMCCNo.18160。根据作物安全性测试，该双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2在棉花、油菜、芝麻、烟草、蔬菜等作物田、茶园和中药园可安全使用，用于控制牛筋草、狗尾草、葇枝莠竹等禾本科杂草。这表明双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2具有开发为防除牛筋草等禾本科杂草的生物除草剂潜力。

发明内容

本发明提供了一种康土抑草菌，为卡氏酸链霉菌（Streptomyces acidiscabies），保藏编号为CCTCC M 20231081，保藏日期2023年6月1日。

本发明提供一种康土抑草菌，从自然界中发掘提取具有除草活性、适应性强、稳定性好、不易老化的菌种，并合理利用特种植物提取物与微生物及微生物代谢产物和微生物酶之间的协同作用，通过发酵技术生产，可实现工业化生产，用于有机绿色可持续农业种植业，可有效保护生态环境，避免人畜及有益动物伤害，具有发展成为防治农业草害及土壤修复的新型绿色除草剂的潜力，市场前景广阔。

本发明的康土抑草菌是通过定向筛选得到，具体步骤为：

S1从桉树人工林中选择杂草密度大的地块进行土壤取样，采用5点取样法采集土壤样品4份，作为实验土样；

S2将土样加水后于摇床上震荡洗涤15~45min，然后取样稀释10倍，以此类推，重复4次，将最后3次的稀释液涂布于加入抑制剂重铬酸钾（50mg/L）ISP2培养基中，各做3个重复，培养5~7d，依据菌落形态产孢等特征，挑选具有链霉菌典型菌落的单菌落进行重复平板划线，直到平板上长出的菌落外部形态完全一致，从而获得链霉菌单菌落；

S3将典型链霉菌菌落分别接种到发酵培养基中进行培养；

S4将步骤S3中的发酵培养液上清液滴加于滤纸片上，以枯草芽孢杆菌CGMCC1.88为检定菌，滤纸片置于测定培养基平板上，在滤纸片另侧相距1cm处放置一片含谷氨酰胺的滤纸片，于30~35℃培养20~24h；选择对检定菌有抑制作用，且在谷氨酰胺滤纸片一侧抑菌圈消失的菌株，从而获得对谷氨酰胺生物合成有竞争抑制作用的链霉菌，试验其发酵上清液喷洒于杂草叶面，进行除草活性验证；选择喷药后2~3d内杂草叶片边缘开始卷曲，随后发黄，7~10d后逐渐枯萎的链霉菌株作为出发菌株，通过US-EMS（紫外线-甲基硫酸乙酯）复合诱变，重复上述试验，直至筛选到具有高除草活性的生产菌株康土抑草菌，分类命名为Streptomyces.Dyzb19，简称Dyzb19，即本发明所指的康土抑草菌。

进一步的，所述步骤S2中摇床为200~250r/min，土样与水的重量比为1：10；ISP2培养基成分包括麦芽浸粉10g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖4g/L、琼脂20g/L，pH=6.8~7.3，蒸馏水1L。

进一步的，所述步骤S3中培养的条件为28~30℃，200~250r/min摇床震荡培养5~7d；培养基成分包括糖蜜5g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、大豆油2g/L、甘油2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.1g/L、微量元素液1mL/L；微量元素液成分包括硼酸1.5g/L、氯化铁1g/L、氯化锰0.8g/L、氯化锌0.06g/L、氯化铜0.1g/L、钼酸钠0.2g/L、氯化钴0.01g/L、氯化镍0.01g/L，蒸馏水1L。

进一步的，所述步骤S4中测定培养基的成分为葡萄糖5g/L、柠檬酸铵2.5g/L、硫酸镁2g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、琼脂20g/L、蒸馏水1 L。

本发明还提供了上述康土抑草菌在制备除草剂中的应用。具体如下：

一种除草剂的制备方法，包括如下步骤：

X1将康土抑草菌斜面菌株接入灭菌的种子培养基进行培养；

X2将步骤X1中培养的种子液以0.5~3wt%的接种量接入一级种子灌灭菌培养基中继续培养；

X3将步骤X2中制得的种子液以4~8wt%的接种量接入二级发酵灌灭菌培养基中继续培养；

X4经过上述条件培养发酵72h后，每隔24h向发酵液流加发酵液总重量5%的灭菌营养液，继续培养144h，得到抑草菌发酵母液；

X5向步骤X4中的母液加入总重量25~35%的泥胡菜乙酸乙酯提取物、0.1~1%的酪蛋白胨、0.05~0.2%的琼脂，再按每mL母液/15~25U的添加量加入纤维素酶，每mL母液/5~15U的添加量加入半纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，20~60rpm下进行螯合，反应16~30h，得到复合混合母液；

X6向步骤X5中的混合母液中加入总重量25~35%的地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液，得到混合母液；

X7向步骤X6中的混合母液中加入总重量3%的有机硅助剂，混合均匀即得除草剂。

进一步的，所述步骤X1中的培养条件为30℃，200r/min摇床震荡培养36h，种子培养基成分为淀粉5g/L、葡萄糖5g/L、糖蜜20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠1g/L。

进一步的，所述步骤X2中的培养条件为30℃，转速100~360rpm，无菌空气通气量0.1~0.5v/vmin，灌压0.03MPa条件下培养30h；培养基成分为淀粉5g/L、葡萄糖5g/L、糖蜜20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠1g/L、大豆油2g/L。

进一步的，所述步骤X3中的培养条件为26~30℃，转速150~300rpm，无菌空气通气量0.2~0.8v/vmin，灌压0.03~0.06MPa条件下培养72h；培养基成分为培养基成分糖蜜5g/L、甘油4g/L、胰蛋白胨5g/L、大豆蛋白胨2g/L、酵母膏5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠1g/L、大豆油2g/L、吐温80 0.5g/L、萘啶酮酸0.01g/L、生物素0.0001g/L、微量元素液5mL/L；微量元素液包括硼酸1.5g/L、氯化铁1g/L、氯化锰0.8g/L、氯化锌0.06g/L、氯化铜0.1g/L、钼酸钠0.2g/L、氯化钴0.01g/L、氯化镍0.01g/L，蒸馏水1L。

进一步的，所述步骤X4中的营养液成分包括糖蜜300g/L、酵母膏100g/L、桐油40g/L、丙氨酸5g/L。

进一步的，所述步骤X6中地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液是由以下方法制备：将地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌斜面菌株分别划线LB活化平板培养基中，32℃活化培养20h，挑取活化培养基上的菌种分别转接三角瓶LB液体培养基于摇床200rpm，30℃培养16h，将两种液体菌种等体积混接发酵培养基；所诉发酵培养基成分包括糖蜜10g/L、蛋白胨15g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、酵母膏0.5g/L、碳酸钙5g/L、淀粉5g/L、消泡剂2g/L；所述培养条件为温度28~33℃，转速150~300rpm，无菌空气通气量0.2~0.8v/vmin，灌压0.03~0.06MP条件下培养36h。

进一步的，所述有机硅助剂为乙氧基改性聚三硅氧烷或改性腰果酚聚醚。最佳的，所述有机硅助剂为改性腰果酚聚醚。

腰果酚聚氧乙烯醚由于腰果酚独特的结构，因而具有优异的净洗性能和低泡性，以及较强的高温洗涤能力，另外，由于环氧乙烷的作用，让腰果酚聚氧乙烯醚的螯合分散性能大大增强，能在溶液中分散均匀，其经生物降解成烷基酚聚氧乙烯醚类的化合物，因此，随着时间推移，当腰果酚聚氧乙烯醚分子化合物的大分子分解成较小的分子时，不会产生对环境污染的物质。通过对腰果酚聚氧乙烯醚进行复配改性能够进一步提升其润湿性，能够帮助活性物质更好地释放和铺展。将该抑草菌进行发酵培养后于植物萃取液及特种酶制剂、改性腰果酚聚醚混合制得除草剂，能够抑制杂草生长、改良土壤、促进作物生长，改性腰果酚聚醚能够帮助除草剂更好地润湿作物表面、提升其药效，减少使用量，并且降解后不会产生污染性成分，更符合可持续发展策略。

所述改性腰果酚聚醚的制备方法，包括如下步骤：

Y1称取腰果酚聚氧乙烯醚1~3重量份，加热至40~50℃后加入2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物0.1~0.3重量份，再加入0.15mol/L亚磷酸钠水溶液1~3重量份、0.2mol/L次氯酸钠水溶液1~3重量份，在40~50℃下搅拌16~26h后冷却至室温，滴加饱和亚硫酸钠溶液至溶液pH=6~7，加入二氯甲烷萃取分液，再用酸洗、水洗，有机相减压浓缩后用三氟乙酸的二氯甲烷溶液（体积比=1：1）搅拌1~2h，减压浓缩得到残余物；

Y2将步骤Y1中的残余物加入到10~20重量份的二氯甲烷中，再加入2~4重量份的四乙烯五胺，加热至100~120℃下搅拌4~6h，反应结束后降温，减压蒸发除去溶剂，将残余物取1~2重量份、KOH取0.2~0.5重量份，混合后密闭抽真空至－0.1MPa后加热至90~130℃，然后加入6~12重量份环氧丙烷，保持压力＜0.4MPa，直至压力减少降至负压后停止反应，将生成的残余物取1~2重量份后、KOH取0.2~0.5重量份重复上述步骤，然后加入2~4重量份的环氧乙烷，保持压力＜0.3MPa，温度为100~120℃，反应结束后烘干得到改性腰果酚聚醚。

本发明还提供了上述除草剂的使用方法：

杂草茎叶：按重量比将除草剂用水稀释150~200倍后对杂草茎叶定向均匀喷雾，每年1~2次；

灌木、秸杆：按重量比将除草剂用水稀释100倍后对灌木或秸杆定向均匀喷雾；

茶园、桑园、果园、林地：按重量比将除草剂用水稀释100~150倍，对地面杂草用进行定向均匀喷施，尽量避开作物，避免喷到作物叶片，若喷到作物茎杆、根系不会对作物造成影响；

对辣椒、烟草、蕃茄、芋头、豇豆、草莓、蓝莓的行间杂草：按重量比将除草剂用水稀释200倍，对行间杂草进行定向均匀喷雾。

本发明的有益效果：

1、本发明提供一种康土抑草菌，从自然界中发掘提取具有除草活性、适应性强、稳定性好、不易老化的菌种，并合理利用特种植物提取物与微生物及微生物代谢产物和微生物酶之间的协同作用，达到抑制杂草生长、改良土壤的功效；

2、该康土抑草菌的发酵液母液对杂草谷氨酰胺合成酶有竞争性抑制作用，干扰杂草体内氮的代谢，造成氨的累积而起到抑草作用，泥胡菜乙酸乙酯提取物对草的根系有抑制作用，再经过酶催化以及与母液代谢产物螯合反应产生的次级代谢物质联合作用大大增强了除草效果，因其复杂的代谢产物又避免了杂草产生抗性，能够加速枯草的分解腐熟，改良土壤，培肥地力。琼脂可以起到稳定母液成分，增加粘稠性以及附着性的作用；

3、所制备的改性腰果酚聚醚能够帮助除草剂更好地润湿作物表面、提升其药效、减少药剂使用量，并且降解后不会产生污染性成分，更符合可持续发展策略。

生物保藏

本发明提供的菌株为卡氏酸链霉菌(Streptomyces acidiscabies)，并于2023年6月21日被保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮政编码：430072)(保藏单位的缩写为CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 20231081。

实施方式

淀粉为马铃薯淀粉。

泥胡菜乙酸乙酯提取物为20g泥胡菜干粉用200mL乙酸乙酯浸没提取，浸提2次，每次48h，合并提取液，旋蒸浓缩至原体积的1/10得到。

地衣芽孢杆菌CGMCC1.10314，解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.857，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心

消泡剂，采用道康宁AFE-1520。

乙氧基改性聚三硅氧烷，货号kmkg158，武汉克米克生物。

腰果酚聚氧乙烯醚，BGF-7，济宁棠邑化工。

实施例1

本发明的新菌株是通过以下途径获得的，发明人从广西国有高峰林场桉树人工林中，选择杂草密度大有零散杂草枯萎的地块进行土壤取样后带回实验室，对土壤中链霉菌进行了定向筛选及抑草菌株的筛选，通过US-EMS复合诱变得到了所述康土抑草菌。分类命名为Streptomyces.Dyzb19，简称Dyzb19。其具有典型的链霉菌特征，菌落隆起、圆形、边缘整齐，呈白色细密绒状，与培养基结合紧密，不易挑起，不产可溶性色素，能够利用葡萄糖、果糖、甘露醇、蔗糖、棉子糖和甘油，不能利用鼠李糖，液化明胶，牛奶胨化。

本发明的康土抑草菌的培养是通过定向筛选所得到的，具体步骤为：

S1从桉树人工林中选择杂草密度大的地块进行土壤取样，采用5点取样法采集土壤样品4份，作为实验土样；

S2将土样加水后于摇床上250r/min震荡洗涤30min，然后取样稀释10倍，土样与水的重量比为1：10，以此类推，重复4次，将最后3次的稀释液涂布于加入抑制剂重铬酸钾（50mg/L）ISP2培养基中，各做3个重复，培养7d；ISP2培养基成分包括麦芽浸粉10g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖4g/L、琼脂20g/L，pH=7.0，余量为水；依据菌落形态产孢等特征，挑选具有链霉菌典型菌落的单菌落进行重复平板划线，直到平板上长出的菌落外部形态完全一致，从而获得链霉菌单菌落；

S3将典型链霉菌菌落分别接种到发酵培养基中进行培养，培养的条件为30℃，250r/min摇床震荡培养7d，培养基成分包括糖蜜5g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L、大豆油2g/L、甘油2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.1g/L、微量元素液1mL/L；微量元素液成分包括硼酸1.5g/L、氯化铁1g/L、氯化锰0.8g/L、氯化锌0.06g/L、氯化铜0.1g/L、钼酸钠0.2g/L、氯化钴0.01g/L、氯化镍0.01g/L，蒸馏水水1L；

S4将步骤S3中的发酵培养液上清液滴加于滤纸片上，以枯草芽孢杆菌CGMCC1.88为检定菌，滤纸片置于测定培养基平板上，在滤纸片另侧相距1cm处放置一片含谷氨酰胺的滤纸片，于34℃培养24h；测定培养基的成分为葡萄糖5g/L、柠檬酸铵2.5g/L、硫酸镁2g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾3.5g/L、琼脂20g/L；选择对检定菌有抑制作用，且在谷氨酰胺滤纸片一侧抑菌圈消失的菌株，从而获得对谷氨酰胺生物合成有竞争抑制作用的链霉菌，试验其发酵上清液喷洒于杂草叶面，进行除草活性验证；选择喷药后2d内杂草叶片边缘开始卷曲，随后发黄，7d后逐渐枯萎的链霉菌株作为出发菌株，通过US-EMS复合诱变，重复上述试验，直至筛选到具有高除草活性的生产菌株康土抑草菌，分类命名为Streptomyces.Dyzb19，简称Dyzb19。经过由分子生物学16S rDNA序列形成的菌株系统发育树显示，该菌株与链霉属同源性较高，与菌株Streptomycesacidiscabies相似度最高，故经分子生物学鉴定分析，认定该菌株为卡氏酸链霉菌Streptomyces acidiscabies。该菌株16SrRNA序列如下SEQ ID NO：1所述。

实施例2

一种含康土抑草菌的除草剂的制备方法，包括如下步骤：

X1将康土抑草菌斜面菌株接入灭菌的种子培养基进行培养，培养条件为30℃，200r/min摇床震荡培养36h，种子培养基成分为淀粉5g/L、葡萄糖5g/L、糖蜜20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠1g/L；

X2将步骤X1中培养的种子液以1wt%的接种量接入一级种子灌灭菌培养基中继续培养，培养条件为30℃，转速250rpm，无菌空气通气量0.2v/vmin，灌压0.03MPa条件下培养30h；一级种子灌灭菌培养基成分为淀粉5g/L、葡萄糖5g/L、糖蜜20g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠1g/L、大豆油2g/L；

X3将步骤X2中制得的种子液以6wt%的接种量接入二级发酵灌灭菌培养基中继续培养，培养条件为26℃，转速150rpm，无菌空气通气量0.2v/vmin，灌压0.03MPa条件下培养72h；二级发酵灌灭菌培养基成分为培养基成分糖蜜5g/L、甘油4g/L、胰蛋白胨5g/L、大豆蛋白胨2g/L、酵母膏5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠1g/L、大豆油2g/L、吐温800.5g/L、萘啶酮酸0.01g/L、生物素0.0001g/L、微量元素液5mL/L；微量元素液包括硼酸1.5g/L、氯化铁1g/L、氯化锰0.8g/L、氯化锌0.06g/L、氯化铜0.1g/L、钼酸钠0.2g/L、氯化钴0.01g/L、氯化镍0.01g/L，蒸馏水水1L；

X4经过上述条件培养发酵72h后，每隔24h向发酵液流加发酵液总重量5%的灭菌营养液，继续培养144h，得到抑草菌发酵母液，营养液成分包括糖蜜300g/L、酵母膏100g/L、桐油40g/L、丙氨酸5g/L；

X5向步骤X4中的母液加入总重量30%的泥胡菜乙酸乙酯提取物、0.5%的酪蛋白胨、0.1%的琼脂，再按每mL母液/20U的添加量加入纤维素酶，每mL母液/10U的添加量分别加入半纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，50rpm下进行螯合，反应24h，得到复合混合母液；

X6向步骤X5中的混合母液中加入总重量30%的地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液，该发酵液是由以下方法制备：将地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌斜面菌株分别划线LB活化平板培养基中，32℃活化培养20h，挑取活化培养基上的菌种分别转接三角瓶LB液体培养基于摇床200rpm，30℃培养16h，将两种液体菌种等体积混接发酵培养基；所诉发酵培养基成分包括糖蜜10g/L、大豆蛋白胨15g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.05g/L、酵母膏0.5g/L、碳酸钙5g/L、淀粉5g/L、消泡剂2g/L；所述培养条件为温度30℃，转速200rpm，无菌空气通气量0.6v/vmin，灌压0.05MP条件下培养36h。

X7向步骤X6中的混合母液中加入总重量3%的乙氧基改性聚三硅氧烷，混合均匀即得除草剂。

实施例3

同实施例2，唯一的区别是将乙氧基改性聚三硅氧烷替换为改性腰果酚聚醚；

所述改性腰果酚聚醚的制备方法，包括如下步骤：

Y1称取腰果酚聚氧乙烯醚25g，加热至45℃后加入2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物2.5g，再加入0.15mol/L亚磷酸钠水溶液25mL、0.2mol/L次氯酸钠水溶液25mL，在45℃下搅拌20h后冷却至室温，滴加饱和亚硫酸钠溶液至溶液pH=6，加入二氯甲烷萃取分液，再用酸洗、水洗，有机相减压浓缩后用25mL三氟乙酸的二氯甲烷溶液（体积比=1：1）搅拌1h，在35℃，－0.9MPa下减压浓缩得到残余物；

Y2将步骤Y1中的加入到300mL二氯甲烷中，再加入35g四乙烯五胺，加热至110℃下搅拌6h，反应结束后降温，35℃，－0.9MPa减压蒸发除去溶剂得到中间产物，将中间物取20g、KOH取3g，混合后密闭抽真空至－0.1MPa后加热至130℃，然后加入120g环氧丙烷，保持压力＜0.4MPa，直至压力减少降至负压后停止反应，将生成的残余物取20g后、KOH取3g重复上述步骤，然后加入40g环氧乙烷，保持压力＜0.3MPa，温度为110℃，反应结束后80℃烘干2h得到改性腰果酚聚醚。

测试例1

对实施例所制备的除草剂进行了除草试验，试验地位于广西壮族自治区南宁市高峰林场延河分场，所在地属温润的亚热带季风气候，阳光充足，雨量充沛；年均降雨量达1304.2mm，平均相对湿度为79%；年平均气温在21.6℃左右，极端最高气候40.4℃，极端最低气候-2.4℃，年平均日照时数1656h。试验地所处地理位置为北纬23°1′8.26″，东经108°28′9.86″；海拔200m，坡度29°。土壤为砂页岩发育形成的赤红壤，土层厚度80cm以上。试验林面积约130公顷，于21年4月份造林，造林株行距是1.8*4m，造林前是采伐过一次的桉树人工林。林下恶性杂草主要以藿香蓟、淡竹叶、马唐、棕叶狗尾草、柔枝莠竹为主。在上述试验林中，选择杂草分布均匀，桉树幼林长势均匀的第2代植苗造林的免炼山桉树幼林作为试验地，采用完全随机区组设计，将试验地划分为15个5m×5m的固定标准地，设置2个试验组和1个空白对照组，试验组所用除草剂为实施例所制备除草剂稀释150倍，空白对照组则喷洒清水，各处理每公顷需水量为120kg，每个处理重复4次。试验于2022年9月初进行，施药时选择天气晴朗时进行，使用喷雾器均匀的喷洒相应药剂于对应的样方中，用药后24h未遇降水。自喷药之日起后5d，15d，35d目测生物除草剂对杂草的影响。施药后根据杂草枯黄情况，计算杂草枯黄率，当有杂草出现枯死现象时，计算枯死率。

杂草枯黄率=枯黄杂草株数/杂草总株数×100%

杂草死亡率=死亡杂草株数/杂草总株数×100%

表1药后5、15、35d后样地内杂草枯黄死亡情况

喷施药剂5d、15d、35d后的杂草枯黄死亡情况见表1。由表1可知，实施例3中试验地的杂草灭除情况比实施例2中的更好。施药5d后各处理的杂草都出现不同程度的枯黄，未出现枯死现象。施药15d后样地内各类别杂草进一步枯黄，实施例3处理杂草枯死率在85%以上，实施例2处理杂草枯死率在60%以上，除草药效十分明显，对恶性杂草的灭杀情况也比较可观。大部分藿香蓟、棕叶狗尾草等发黑枯死。其中，马唐枯死率较其余杂草偏高，实施例3处理达90%，比实施例2处理高20%，其余杂草在各处理中也呈现了这样的趋势。施药后35d样地杂草枯死率均高于90%，实施例3处理存在杂草枯死率达到100%的现象，此时对照组在未施除草剂的情况下也出现了5%的枯黄。实施例2和实施例3的区别可能是由于实施例3中所添加的改性腰果酚聚醚能够帮助除草剂更好地润湿作物表面、提升其药效、减少药剂使用量，并且其降解后不会产生污染性成分，更符合可持续发展策略。

Claims (8)

1.一种康土抑草菌，为卡氏酸链霉菌（Streptomyces acidiscabies），保藏编号为CCTCC M 20231081。

2.如权利要求1所述的康土抑草菌在制备除草剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述除草剂的制备方法为：

X1将权利要求1所述的康土抑草菌斜面菌株接入灭菌的种子培养基进行培养；

X2将步骤X1中培养的种子液接种至一级种子灌灭菌培养基中继续培养；

X3将步骤X2中制得的种子液接种至二级发酵灌灭菌培养基中继续培养；

X4经过上述条件培养发酵72h后，每隔24h向发酵液流加发酵液总重量5%的灭菌营养液，继续培养144h，得到抑草菌发酵母液；

X5向步骤X4中的母液加入总重量25~35%的泥胡菜乙酸乙酯提取物、0.1~1%的酪蛋白胨、0.05~0.2%的琼脂，再按每mL母液/15~25U的添加量加入纤维素酶，每mL母液/5~15U的添加量加入半纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，20~60rpm下进行螯合，反应16~30h，得到复合混合母液；

X6向步骤X5中的混合母液中加入总重量30%的地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌混合发酵液，得到混合母液；

X7向步骤X6中的混合母液中加入总重量3%的有机硅助剂，混合均匀即得除草剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤X2中的接种量为0.5~3wt%。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤X3中的接种量为4~8wt%。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述有机硅助剂为乙氧基改性聚三硅氧烷或改性腰果酚聚醚。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述有机硅助剂为改性腰果酚聚醚。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述除草剂的使用方法为：

杂草茎叶：按重量比将除草剂用水稀释150~200倍后对杂草茎叶定向均匀喷雾，每年1~2次；

灌木、秸杆：按重量比将除草剂用水稀释100倍后对灌木或秸杆定向均匀喷雾；

茶园、桑园、果园、林地：按重量比将除草剂用水稀释100~150倍，对地面杂草用进行定向均匀喷施，尽量避开作物，避免喷到作物叶片，若喷到作物茎杆、根系不会对作物造成影响；

对辣椒、烟草、蕃茄、芋头、豇豆、草莓、蓝莓的行间杂草：按重量比将除草剂用水稀释200倍，对行间杂草进行定向均匀喷雾。