CN103865843B - 一种微生物复合菌及其在防治蔬菜真菌病害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治蔬菜真菌病害的广谱微生物复合菌，属于农业生物防治技术领域。它是由枯草芽孢杆菌BSD-2（<i>Bacillus？subtilis</i>）、短短芽孢杆菌ch2（<i>Brevibacillus？brevis</i>）、解淀粉芽孢杆菌Y10（<i>Bacillus？amyloliquefaciens</i>）和多粘类芽孢杆菌Y89（<i>Paenibacillus？polymyxa</i>）4种微生物按一定比例复配而成。该复合菌可以有效防治温室或大田蔬菜真菌病害如：灰霉病、叶霉病、霜霉病、白粉病和枯萎病等，田间防效达70%以上，增产5～20%，经济、社会和生态效益显著。有广阔的推广应用前景。

Description

一种微生物复合菌及其在防治蔬菜真菌病害中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物复合菌，具体涉及一种用于防治蔬菜真菌病害的广谱微生物复合菌。

背景技术

近年来，棚室蔬菜由于高产、高效益得到了快速发展，全国种植面积达4000多万亩。棚室所特有的温湿、连作及其它环境条件，使部分真菌病害如灰霉病、叶霉病、霜霉病、枯萎病等成为危害蔬菜生产的严重病害。多数病原真菌寄生范围广、繁殖速度快、易产生遗传变异等特点，容易给蔬菜生产造成减产20～40%，严重时可达60%以上。

随着蔬菜生产的发展，蔬菜真菌害发生越来越频繁。长期大量使用化学药物防治，导致蔬菜防治效果不断下降，药剂使用量不断加大；同时造成产品农药残留超标、环境污染，严重阻碍了农业的可持续性发展。

蔬菜真菌病害往往具有多发性，一旦发病，将很快波及整个种植区域造成大规模减产，并且病原菌不易根除。因此对于真菌病害，防大于治。可是在植株未发病时，判断其可能的病症是不现实的；再者，即使在发病初期，由于很多真菌病害在初期具有相似的表征，也不易确定其具体所感染的病症，这就给植物的真菌病害预防或初期防治带来很大困难。可是现有的拮抗制剂往往抑菌谱较窄，如CN102827773公开的一种复合菌剂，适用于防治灰霉病。

因此，本发明结合不同有益微生物的协同拮抗原理和天然抑菌产物构建广谱微生物复合菌剂，对多种蔬菜真菌病害进行生物防治，具有活性高、抗菌谱宽、易于被植物吸收、在环境中不积累等特点，为绿色蔬菜产业的健康可持续发展提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不仅可治疗而且可以有效预防多种蔬菜真菌病害，并且还具有改善蔬菜品质和提高蔬菜产量作用的广谱微生物复合菌。

本发明的主要技术方案为：

本发明的微生物复合菌包含保藏编号为CGMCCNo.8440的枯草芽胞杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、保藏编号为CGMCCNo.8362的解淀粉芽孢杆菌Y10以及类芽孢杆菌Y89，其中所述枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占所述复合菌总数的20～45%，所述短短芽孢杆菌ch2的菌数占所述复合菌总数的15～35%，所述解淀粉芽孢杆菌Y10的菌数占所述复合菌总数的10～20%，所述类芽孢杆菌Y89的菌数占所述复合菌总数的15～35%。

本发明的微生物复合菌中的细菌总数不低于2×10⁹cfu/mL。

本发明的微生物复合菌在防治蔬菜真菌病害中的应用。

本发明的微生物复合菌防治的蔬菜真菌病害包括灰霉病、白粉病、叶霉病、枯萎病、霜霉病、炭疽病菌或早疫病。

本发明的微生物复合菌的制备方法为将所述的枯草芽胞杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、解淀粉芽孢杆菌Y10或类芽孢杆菌Y89分别在培养基中培养，之后按照比例混合制成；所述菌种的比例为：枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占所述复合菌总数的20～45%，芽孢杆菌ch2的菌数占所述复合菌总数的15～35%，解淀粉芽孢杆菌Y10的菌数占所述复合菌总数的10～20%，类芽孢杆菌Y89的菌数占所述复合菌总数的15～35%。

本发明的微生物复合菌的制备方法中所述的培养基的组成为：每1升培养基中含蛋白胨10～13g、淀粉8～12g、牛肉膏5～8g、酵母膏1～3g、KH₂PO₄0.5～1.5g、K₂HPO₄0.3～1.0g、MgSO₄0.5～1.0g、CaCO₃1～10g及余量的水，pH7.0±0.2。

本发明的微生物复合菌的生物菌剂包括如下组分的复合菌以及培养基，其中复合菌的组成为占所述复合菌总数20～45%的枯草芽胞杆菌BSD-2，占所述复合菌总数15～35%的芽孢杆菌ch2，占所述复合菌总数10～20%的解淀粉芽孢杆菌Y10，占所述复合菌总数15～35%的类芽孢杆菌Y89，所述复合菌中的细菌总数不低于2×10⁹cfu/mL；其中所述培养基的的组成为：每1升培养基中含蛋白胨10～13g、淀粉8～12g、牛肉膏5～8g、酵母膏1～3g、KH₂PO₄0.5～1.5g、K₂HPO₄0.3～1.0g、MgSO₄0.5～1.0g、CaCO₃1～10g及余量的水，pH7.0±0.2。

本发明的微生物复合菌的生物菌剂进一步通过喷雾干燥制得粉剂，所得粉剂含细菌总数≥10×10¹⁰cfu/mL。

本发明的枯草芽胞杆菌BSD-2（Bacillussubtilis）：革兰氏染色阳性，芽孢中生，鞭毛周生，没有伴孢晶体形成。菌体长约2.5～3.0μm，宽约0.6～0.8μm。菌株保藏编号CGMCCNo.8440。

本发明的短短芽孢杆菌ch2（Brevibacillusbrevis）：革兰氏染色阳性，短杆，产芽孢，好氧或兼性厌氧。其已经被《黄瓜灰霉病高效拮抗菌的筛选鉴定及其作用研究》，河北师范大学硕士学位论文，公开，公开日为2012年3月20日。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Y10（Bacillusamyloliquefaciens）：菌体杆状，长度约1.9～4.0μm，宽度约0.8～1.1μm，革兰氏阳性、杆状、形成芽孢，芽孢椭圆或柱形，兼性厌氧。菌株保藏编号CGMCCNo.8362。

本发明的类芽孢杆菌（Paenibacillussp.）Y89：革兰氏染色阳性，菌体杆状，单个或成长链，椭圆形芽孢使孢囊膨大,芽孢中生到端生。其已经被《耐低温兼性厌氧淀粉酶产生菌Y89的筛选及酶学特性》，中国农学通报，2011,27（7）：107-111公开。

本发明所述的灰霉病的病原菌为灰葡萄孢菌，常见于多种植物，如番茄、黄瓜、萝卜、白菜、胡萝卜、卷心菜、辣椒等蔬菜及草莓、葡萄等水果。灰霉病是一种典型的气传病害，极难防治，可随空气、水流以及农事作业传播，难以采取有效措施彻底切断传染源，也难以彻底消灭病原菌。

本发明所述的白粉病的病原菌主要为二孢白粉菌和单丝壳白粉菌，可使葫芦科、豆类、茄果类、绿叶菜类及其它植物致病。一旦发病能迅速蔓延，若防治不及时，就会造成叶片焦枯，植株早衰，严重减产。

本发明所述的枯萎病的病原菌主要为尖镰孢菌，症状包括严重的点斑、凋萎或叶、花、果、茎或整株植物的死亡，生长迅速的幼嫩组织常被侵袭。

本发明所述的叶霉病的病原菌主要为黄枝孢菌，属半知菌亚门真菌。主要危害蔬菜如番茄等的叶片，可引起全叶干枯卷曲，植株呈黄褐色干枯状。严重时也可以危害茎、花、果实等。

本发明所述的霜霉病的病原菌为霜霉菌，常见于多种植物，如黄瓜、莴苣等蔬菜植物，发病初期在叶面形成浅黄色近圆形至多角形病斑，容易并发角斑病，空气潮湿时叶背产生霜状霉层，有时可蔓延到叶面。后期病斑枯死连片，呈黄褐色，严重时全部外叶枯黄死亡，类似黄萎病。

本发明所述的炭疽病的病原菌因植物不同而有所不同，主要有半知菌亚门、腔孢纲、黑盘孢纲或炭疽属的真菌，对植物有较大危害；在十字花科、葫芦科等蔬菜中常见。主要危害叶片和叶柄，也可为害花梗、种荚。

本发明所述的早疫病又称为轮纹病，主要病原菌为茄链格孢菌，是番茄、茄子、辣椒等植物的主要病害，成株期叶片被害，潮湿时病斑上长出黑色霉层（分生孢子及分生孢子梗），严重时叶片脱落。茎部染病，严重时造成断枝。青果、叶柄、果柄也易染病。

本发明的积极效果在于：与现有技术相比，首先，本发明制备的复合微生物菌剂，相对于化学产品更安全，其制备和使用过程无污染、无公害、对环境友好。其次，本发明采用的微生物为复合菌，除了对蔬菜真菌病害有防治作用外，还具有改善产品品质，提高产品产量的作用。第三，相对于单一菌株，该复合菌在使用过程中充分利用菌株间的协同增效作用，对多种蔬菜真菌病害有拮抗作用，具有更宽的抗菌谱与环境适应能力。本发明微生物复合菌的应用是解决蔬菜农药残留和病菌抗药性问题的有效途径。同时，对保障食品安全、保护环境，促进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

保藏方式

枯草芽孢杆菌BSD-2，分类命名为Bacillussubtilis，已于2013年11月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNo.8440。

短短芽孢杆菌ch2，分类命名为Brevibacillusbrevis，已于2011年3月16日保藏于河北省科学院生物研究所，地址：石家庄市友谊南大街46号，河北省科学院生物研究所，邮编050081，保藏编号为短短芽孢杆菌ch2，河北省科学院生物研究所保证向公众提供。

解淀粉芽孢杆菌Y10，分类命名为Bacillusamyloliquefaciens，已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCCNo.8362。

类芽孢杆菌Y89，分类命名为Paenibacillussp，已于2010年6月28日保藏于河北省科学院生物研究所，地址：石家庄市友谊南大街46号，河北省科学院生物研究所，邮编050081，保藏编号为类芽孢杆菌Y89，河北省科学院生物研究所保证向公众提供。

具体实施方式

在本发明中，菌株保藏编号CGMCCNo.8440的枯草芽胞杆菌BSD-2以及菌株保藏编号CGMCCNo.8362的解淀粉芽孢杆菌Y10可以通过中国普通微生物菌种保藏管理中心获得，短短芽孢杆菌ch2和类芽孢杆菌Y89经被文献公开，河北省科学院生物研究所可以向公众提供。

本发明涉及的四种菌的培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌和类芽孢杆菌Y89培养基，例如，可以为LB培养基，也可以为本发明所公开的培养基，当采用本发明所公开的培养基进行培养时，可适应上述四种菌的生长要求，生长效率快。所述LB培养基为本领域技术人员所公知。

本发明各实施例的复合菌的制备方法为：分别培养枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌和类芽孢杆菌，再按照比例进行混合。

本发明中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌和类芽孢杆菌的培养方法为本领域技术人员所公知。

下面，通过实施例对本发明进行更加详细的说明，但是不作为对本发明的限制。

实施例1~4：不同培养基组分对菌株发酵水平的影响

本发明中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌和类芽孢杆菌Y89采用实施例1~4所列的培养基组分进行培养，实施例1~4的培养基组成见表1，各组分溶于水中，最后定容至1L，调节pH7.0±0.2。各菌株在30℃，200rpm摇床振荡培养。培养末期，每种细菌的发酵水平达2～5×10⁹cfu/mL。如果采用常规LB或PB培养基，每种菌的发酵水平为0.1～1.8×10⁹cfu/mL。培养结果见表2。

实施例5：复合菌与单一菌应用效果

本实施例的防治蔬菜真菌病害的广谱微生物复合菌由以下4种菌株组成：枯草芽孢杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、解淀粉芽孢杆菌Y10和类芽孢杆菌Y89。上述各种微生物在复合菌中的细菌数含量（不同菌株的细胞数占复合菌总细胞数的百分含量）分别为：枯草芽胞杆菌BSD-2占35%、短短芽孢杆菌ch2占23%、解淀粉芽孢杆菌Y10占15%、类芽孢杆菌Y89占27%，菌液含细菌总数≥2.0×10⁹cfu/mL。

对比例1为枯草芽胞杆菌BSD-2，对比例2为短短芽孢杆菌ch2，对比例3为解淀粉芽孢杆菌Y10，对比例4为类芽孢杆菌Y89，各对比例的含细菌总数在施用前调整与实施例5的复合菌相同，菌液含细菌总数≥2.0×10⁹cfu/mL。

针对不同植物病原菌进行盆栽防治试验，将实施例5的复合菌和各对比例的单一菌稀释50倍后施用。先接种病原菌，再施用各生防菌液（除黄瓜枯萎病外），具体防治效果见表3，黄瓜枯萎病防治主要是黄瓜浸种0.5～1h并在其移栽时灌根穴施，每穴施用20mL菌液，长至3～4片叶子时接种病原菌；其他作物从苗期开始，间隔3~5天/次，喷施3次，叶面喷施至叶片湿而不滴。每个处理5个平行。按常规方法操作，每隔10～15d施用一次。

根据发病率和病情指数计算防治效果，由表3的数据可知，单一菌株对上述几种病害均有一定的防治效果，但只对某种病害的作用较显著，总体效果并不理想；通过制备为复合菌株，对各病害的防治效果显著提高，均可达到70%以上，说明其具有协同增效作用。

实施例6：

本发明实施例6的防治蔬菜真菌病害的广谱微生物复合菌由以下4种菌株组成：枯草芽孢杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、解淀粉芽孢杆菌Y10和类芽孢杆菌Y89。上述各种微生物在复合菌中的细菌数含量（不同菌株的细胞数占复合菌总细胞数的百分含量）分别为：枯草芽胞杆菌BSD-2占35%、短短芽孢杆菌ch2占23%、解淀粉芽孢杆菌Y10占15%、类芽孢杆菌Y89占27%，菌液含细菌总数≥2.0×10⁹cfu/mL。

制得的复合菌剂中还含有下述组分的培养基：蛋白胨10g/L，淀粉12g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏1g/L，KH₂PO₄0.5g/L，K₂HPO₄1.0g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCO₃2g/L，水1L，pH7.0±0.2。

实施例6所得复合菌剂对黄瓜灰霉病的防治作用：

盆栽试验，预先在室内培养黄瓜苗，定殖后3～4片真叶时供试。将复合菌液稀释50倍后进行叶面喷施。每个处理5个平行。先喷施复合菌液，再接灰霉菌，根据病情指数计算其防治效果为87.3%。先接种灰霉病菌，再喷施复合菌液的防治效果是76.2%。两个处理中黄瓜内的可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿体含量均显著增加。

田间试验中，将复合菌液稀释50倍后喷施，其防治效果为75.3%，增产5.6%，黄瓜内可溶性糖、可溶性蛋白提高15～18%。

实施例7：

本发明实施例7的防治蔬菜真菌病害的广谱微生物复合菌由以下4种菌株组成：枯草芽孢杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、解淀粉芽孢杆菌Y10和类芽孢杆菌Y89。上述各种微生物在复合菌中的细菌数含量（不同菌株的细胞数占复合菌总细胞数的百分含量）分别为：枯草芽胞杆菌BSD-2占22%、短短芽孢杆菌ch2占30%、解淀粉芽孢杆菌Y10占18%、类芽孢杆菌Y89占30%，菌液含细菌总数≥2.0×10⁹cfu/mL。

在制备复合菌时所使用的培养基含有下述组分：蛋白胨13g/L，淀粉8g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏3g/L，KH₂PO₄1.5g/L，K₂HPO₄0.3g/L，MgSO₄0.6g/L，CaCO₃5g/L，水1L，pH7.0±0.2。

制得的液体制剂通过喷雾干燥，制备为粉剂，喷雾干燥的方法为本领域技术人员熟知的常规方法，在进行喷雾干燥时所选用的吸附剂主要成分为环糊精和碳酸钙。制得的粉剂中的细菌总数≥10×10¹⁰cfu/mL。

实施例7对番茄叶霉病的防治作用：

盆栽试验，在实验室内预先培养番茄，生长至苗期供试，将实施例6所得粉剂溶解于水中得到复合菌液，比例为1g菌剂加800mL水。每个处理5个平行。先喷施复合菌，再接叶霉菌，防治效果为83.5%。先接种叶霉病菌，再喷施复合菌的防治效果是75.7%。两个处理中番茄内的可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿体含量均显著增加。

田间试验中，将复合菌稀释800倍后喷施，其防治效果为77.1%，增产5.2%，番茄内可溶性糖、可溶性蛋白提高17～19%。

实施例8~11

实施例8~11与实施例6仅复合菌的比例有区别，其具体比例见表4。其在田间应用中的使用效果见表5所示，均稀释50倍使用，其中黄瓜枯萎病防治，黄瓜种植前用菌液浸种0.5～1h，移栽时灌根穴施，每穴施用20mL菌液，在花期再灌根一次。其他作物主要是在苗期开始喷施，叶面喷施至叶片湿而不滴。每个处理5个平行。按常规方法操作，每隔15d喷施一次。

表5实施例8~11在蔬菜防病促生中的应用效果

Claims (8)

1.一种微生物复合菌，其特征在于其由保藏编号为CGMCCNo.8440的枯草芽胞杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、保藏编号为CGMCCNo.8362的解淀粉芽孢杆菌Y10以及类芽孢杆菌Y89组成，其中所述枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占所述复合菌总数的20～45％，所述短短芽孢杆菌ch2的菌数占所述复合菌总数的15～35％，所述解淀粉芽孢杆菌Y10的菌数占所述复合菌总数的10～20％，所述类芽孢杆菌Y89的菌数占所述复合菌总数的15～35％。

2.根据权利要求1所述的微生物复合菌，其特征在于所述复合菌中的细菌总数不低于2×10⁹cfu/mL。

3.一种如权利要求1或2所述的微生物复合菌在防治蔬菜真菌病害中的应用。

4.根据权利要求3所述的微生物复合菌在防治蔬菜真菌病害中的应用，其特征在于所述的蔬菜真菌病害包括灰霉病、白粉病、叶霉病、枯萎病、霜霉病、炭疽病或早疫病。

5.一种根据权利要求1或2所述的微生物复合菌的制备方法，其特征在于所述的枯草芽胞杆菌BSD-2、短短芽孢杆菌ch2、解淀粉芽孢杆菌Y10或类芽孢杆菌Y89分别在培养基中培养，之后按照比例混合制成；

所述菌种的比例为：枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占所述复合菌总数的20～45％，芽孢杆菌ch2的菌数占所述复合菌总数的15～35％，解淀粉芽孢杆菌Y10的菌数占所述复合菌总数的10～20％，类芽孢杆菌Y89的菌数占所述复合菌总数的15～35％。

6.根据权利要求5所述的微生物复合菌的制备方法，其特征在于所述的培养基的组成为：每1升培养基中含蛋白胨10～13g、淀粉8～12g、牛肉膏5～8g、酵母膏1～3g、KH₂PO₄0.5～1.5g、K₂HPO₄0.3～1.0g、MgSO₄0.5～1.0g、CaCO₃1～10g及余量的水，pH7.0±0.2。

7.一种含有权利要求1所述的微生物复合菌的生物菌剂，其特征在于其包括如下组分的复合菌以及培养基，其中复合菌的组成为占所述复合菌总数20～45％的枯草芽胞杆菌BSD-2，占所述复合菌总数15～35％的芽孢杆菌ch2，占所述复合菌总数10～20％的解淀粉芽孢杆菌Y10，占所述复合菌总数15～35％的类芽孢杆菌Y89，所述复合菌中的细菌总数不低于2×10⁹cfu/mL；其中所述培养基的的组成为：每1升培养基中含蛋白胨10～13g、淀粉8～12g、牛肉膏5～8g、酵母膏1～3g、KH₂PO₄0.5～1.5g、K₂HPO₄0.3～1.0g、MgSO₄0.5～1.0g、CaCO₃1～10g及余量的水，pH7.0±0.2。

8.根据权利要求7所述的微生物复合菌的生物菌剂，其特征在于其进一步通过喷雾干燥制得粉剂，所得粉剂含细菌总数≥10×10¹⁰cfu/mL。