CN107345215B - 一株多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用 - Google Patents

一株多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，该菌种的保藏号为CGMCCNo.13554，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；经温室药效试验显示，该菌株制备的微生物制剂对黄瓜白粉病和霜霉病具有较好的防治效果。本发明所提供的多粘类芽孢杆菌及其制备的微生物制剂具有广谱的抑制植物真菌病害的能力，且无毒无致病性，对人畜安全、对环境友好，是微生物农药研发的有用资源，具有潜在的应用前景。

Description

一株多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的 应用
技术领域
本发明属于微生物筛选与应用技术领域，涉及一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)及其在植物病原防治方面的应用，尤其涉及一株多粘类芽孢杆菌及其微生物制剂在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用。
背景技术
黄瓜是葫芦科一年生蔓生或攀援草本植物，在中国各地普遍栽培，且许多地区均有温室或塑料大棚栽培，为中国各地主要菜蔬之一。
黄瓜白粉病是黄瓜栽培中常见病害之一且一年四季均可发病。黄瓜白粉病病原属子囊菌亚门，瓜类单丝壳白粉菌。系专性弱寄生菌，只在活寄主上存活。其病菌最适宜发病温度为16－25℃，孢子萌发温度范围为10－30℃，在高于30℃或低于1℃条件下很快失去生活力。白粉病最适宜发病湿度为75％。相对湿度达25％以上，分生孢子就能萌发，湿度越大病害越重。一般年份减产在10％左右，流行年份减产在20％-40％左右。
黄瓜霜霉病是黄瓜栽培中发生最普遍、为害最严重的病害。黄瓜霜霉病病原为鞭毛菌亚门假霜霉属古巴假霜霉菌【Pseudoperonosporacubensis(Berk.etCurt.)Rostov.】，该病菌的孢子囊靠气流和雨水传播。在温室中，人们的生产活动是霜霉病的主要传染源。黄瓜霜霉病最适宜发病温度为16－24℃，适宜的发病湿度为85％以上，特别在叶片有水膜时，最易受侵染发病。病菌在保护地内越冬，翌春传播。病菌为活体专性寄生真菌，种子不带菌，病菌主要靠气流传播，从叶片气孔侵入。
生物防治是利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方法，普遍被认为是防治土传病害的一种有效途径。因此，筛选和研制新的、高效安全的环境友好型生物制剂，来防治植物病害，对我国农业的安全可持续发展具有重要的意义。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提供一株多粘类芽孢杆菌及其微生物制剂在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用。
本发明的第一个方面上提供一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
本发明的第二个方面是提供一种微生物制剂，所述微生物制剂包含所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
本发明的第三个方面是提供一种微生物制剂在植物真菌病害中的应用，尤其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用。
本发明的第四个方面是提供一种微生物制剂的制备方法。
本发明的第五个方面是提供一种所述微生物制剂在植物真菌病害中的应用，尤其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用。
本发明的第六个方面是提供一种采用所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)或微生物制剂植物土传病害的生物防治方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其是从植物根际土壤中分离获得的，已于2017年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13554。
进一步地，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)具有以下生物学特性：在固态LB培养基平板表面的菌落为有光泽的圆形且粘稠，乳白偏黄色，菌体细胞呈直杆状；最适生长pH为7,最适生长温度为28-30℃。
进一步地，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的培养方法为：
(1)实验室纯化菌种采用固态LB培养基上由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0。加入15g琼脂用去离子水定容至1L；
(2)实验室液体培养采用LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、
NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0。用去离子水定容至1L；
(3)大量培养采用液体培养基由甘油20ml、淀粉7.8g、K2PO40.68g、胰蛋白胨0.5g、酵母膏0.25g。用去离子水定容至1L。
本发明的第二个方面是提供一种所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)在植物土传病害中的应用。
进一步地，在所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在植物土传病害中的应用中，所述植物病害为黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病。
本发明的第三个方面是提供一种用于防治黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病的微生物制剂，其包括所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
本发明的第四个方面是提供一种如权利要求4所述微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)划线制备所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株的单菌落于固态LB培养基上；
(2)将步骤(1)制备的单菌落接种至100ml/500ml(v/v)LB培养基摇瓶中；
(3)将步骤(2)培养的摇瓶放置30℃、转速180rpm/min摇床振荡培养48h；
(4)将步骤(3)培养的摇瓶接种至35l/50L(v/v)发酵罐的液体培养基中30℃、转速100rpm/min、通气量1.5m3/h、罐压0.1MPa培养96h。
进一步地，所述步骤(1)中的固态LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/LNaOH调pH至7.0；加入15g琼脂用去离子水定容至1L；高压下蒸汽灭菌20min，待培养基温度冷却至50℃，在超净台上倒入90mm一次性培养皿约需20ml培养基。
进一步地，所述步骤(2)中的LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/LNaOH调pH至7.0；用去离子水定容至1L；分装后高压下蒸汽灭菌20min，冷却备用。
进一步地，所述步骤(3)中的液体培养基由甘油20ml、淀粉7.8g、K2PO40.68g、胰蛋白胨0.5g、酵母膏0.25g；用去离子水定容至1L；高压下蒸汽灭菌20min，冷却备用。
本发明的第五个方面是提供一种所述微生物制剂在防治植物真菌病害中的应用。
进一步地，在所述微生物制剂在防治植物真菌病害中的应用，所述的植物病害为黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病。
本发明的第六个方面是提供一种植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)或所述的微生物制剂。
进一步地，所述本发明微生物制剂使用方法为：将上述微生物制剂稀释1000倍，对发病前或发病前期的黄瓜白粉病和霜霉病进行灌根和喷叶处理，每隔7天施用一次，其中黄瓜白粉病用药5次，黄瓜霜霉病用药3次。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明所提供的菌株为多粘类芽孢杆菌，是从植物根际土壤中分离获得的，已于2017年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13554；该多粘类芽孢杆菌对植物土传病害中的黄瓜白粉病和霜霉病具有较强的抑制作用，与目前已有专利所公开的菌株的抑菌谱完全不同，且范围更广，这表明多粘类芽孢杆菌分泌的抑菌物质与目前已报道的不同，具有新颖性；进一步的温室药效试验显示，该菌株制备的微生物制剂对黄瓜白粉病和霜霉病具有较好的防治效果。综上所述，本发明所提供的多粘类芽孢杆菌具有广谱的抑制植物真菌病害的能力，且无毒无致病性，对人畜安全、对环境友好，是微生物农药研发的有用资源，具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为本发明多粘类芽孢杆菌株根据16SrDNA序列获得的系统发育树图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1本发明实施例提供一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，其是从植物根际土壤中分离获得的，已于2017年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13554；所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)具有以下生物学特性：在固态LB培养基平板表面的菌落为有光泽的圆形且粘稠，乳白偏黄色，菌体细胞呈直杆状；最适生长pH为7,最适生长温度为28-30℃。
该多粘类芽孢杆菌的筛选分离过程如下：
该菌株是上海万力华生物科技有限公司从黄瓜根际土壤中分离得到的；2014年11月份上海万力华生物科技有限公司从上海孙桥黄瓜种植大棚，采用随机采样法采集白粉病和霜霉病发病区域中健康的黄瓜根际土壤。采用稀释分离法对采集的土壤样品中进行分离，称取样品土壤10g，加入至含90mL无菌水的锥形瓶中，稀释振荡混匀，待土壤颗粒沉降到锥形瓶底部，取1mL上清液，按1×10-1至1×10-6梯度稀释，再将1mL不同浓度的悬浮液转移至牛肉膏蛋白胨麦芽汁培养基的培养皿中涂板。牛肉膏蛋白胨麦芽汁培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂36g、用去离子水定容至1L。与等量的麦芽汁分别灭菌后，混合使用。
(1)该多粘芽孢杆菌的分类鉴定：该菌株生理生化实验结果(见表1)
表1细胞形态和理化实验结果
Figure BDA0001362259920000051
Figure BDA0001362259920000061
(2)利用16s rDNA序列鉴定分类
直接以菌液为模板，扩增引物分别为16s ribosomal RNA通用引物27F(5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’)，PCR扩增采用25μl体系：模板1μl、27F(10μM)1μl、1492R(10μM)1μl、PCR mix22μl。扩增条件:95℃2min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35cycles；72℃5min，4℃终止反应。PCR产物检测用1％的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。待测得16S rRNA基因序列后利用Blast工具与数据库中已知的相关序列进行在线比对与类芽孢杆菌属的同源性高达99％，表2所示为菌株16S rDNA同源性最高的10株菌株。并选取与多粘类芽孢杆菌同属的菌株用MEGA5.0软件进行系统发育树的构建，获得的系统发育树图如图1所示。
表2 16S rDNA同源性比较
Figure BDA0001362259920000062
Figure BDA0001362259920000071
该菌株的16srRNA基因序列测定结果如下(SEQ NO ID.1)：
GGACTGGCGGGTGCTATACTGCAGTCGAGCGGGGTTGTTAGAAGCTTGCTTCTAACTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGATAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGATCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGATGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGCTGGTTGAT
(3)该菌株的gyrB基因序列测定结果如下(SEQ NO ID.2)：
TTTGCTGATGTCAAAATCATCTCCAATCCCTGTACCCATTGCTGTTACCATTGACCGTATTTCATCACTGGACAAAATACGGTCCAAGCGTGCCTTTTCCACATTCAGGATCTTACCGCGAATTGGCAAAATCGCTTGAAAGTGACGATCACGCCCCTGCTTGGCCGATCCCCCTGCTGAGTCACCTTCGACGATGTACAGTTCACTGATCGAAGCATCCTTAGAGGAGCAATCCGCCAGCTTACCTGGGAGCGAACTGATTTCCAGCGCACTTTTGCGACGTGTAAGTTCACGCGCTTTGCGTGCTGCTTCCCGGGCACGAGCTGCTTGTAACGATTTATCAACTACACGGCGGGAGACGGACGGGTTCTCCTCCAGAAATTCCTGAAGTTTCTCTGCGAACAGGGACTCGACAATTCCTCGAACTTCACTGTTGCCAAGCTTTGTTTTAGTCTGACCCTCAAACTGTGGTTCAGGAATTTTGACGGAGATAATCGCTGTCAAACCTTCGCGTACATCGTCACCAGTCAAATTGGCATTGTTGTCCTTAATTAAGCCATTTTTGCGTGCATAATCGTTAATAATCCGGGTTAATGCACTCTTGAAACCTGATTCATGAGTTCCGCCCTCATGAGTATTGATATTGTTGGCGAAAGAATAAATATTCTCGGTATAGCTGTCGTTATATTGCAATGCAACTTCGACTTGAATCATGTCACGAGAGCCTTCGACATAAATCGGCTGTTCATGCAGGGCTTCTCTTTTTTGATTCAGAAACTGCACATACTCACTGATTCCACCCTCATAGTGGAATGTATCGCTGGCGCCTGTCCGTTCATCGGTCAAGCTAATTGCAATGCCTTTGTTCAAGAAAGCCAGCTCACGAATC。
综上，根据菌株的细胞形态、生理生化特征、16S Rrna基因序列、gyrB基因序列的实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》，将该菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
实施例2本实施例提供一种实施例1的多粘类芽孢杆菌的培养方法，具体包括如下步骤：
(1)实验室纯化菌种采用固态LB培养基上由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、
NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0。加入15g琼脂用去离子水定容至1L；
(2)实验室液体培养采用LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0。用去离子水定容至1L；
(3)大量培养采用液体培养基由甘油20ml、淀粉7.8g、K2PO40.68g、胰蛋白胨0.5g、酵母膏0.25g，用去离子水定容至1L。
实施例3本实施例提供了一种用于防治黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病的微生物制剂，该微生物制剂包括所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，该所述微生物制剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)制备所述的多粘类芽孢杆菌种子平板；
(2)接种步骤(1)制备的种子平板单菌落至100ml/500ml(v/v)LB培养基摇瓶中30℃、180rpm/min摇床振荡培养48h；
(3)接种步骤(2)制备的100ml种子液至35L/50L(v/v)大量培养所用液体培养基发酵罐中30℃、转速100rpm/min、通气量1.5m3/h、罐压0.1MPa培养144h；
(4)检测上述发酵液中菌体和芽孢的数量，发酵所得活菌数为2*109cfu/ml左右，其中芽孢所占比例为80％；所得即为多粘类芽孢杆菌的发酵液原液；
(5)取步骤(4)中的发酵液原液，添加15％轻质碳酸钙、8％白炭黑、5％葡萄糖、2％甘油，过300目筛后用电热鼓风干燥箱60℃烘干至相对湿度30％左右，用旋转闪蒸干燥机闪蒸至相对湿度5％左右，即得到该制剂原粉，活菌率大于3*109cfu/g；
(6)取步骤(5)20％原粉、6％十二烷基硫酸钠、2％硅酸镁铝，用轻质碳酸钙补足至100％，所得即为该微生物制剂。
(7)上述微生物制剂，其活菌率为6*108cfu/g左右。
所述步骤(1)中的固态LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/LNaOH调pH至7.0；加入15g琼脂用去离子水定容至1L；高压下蒸汽灭菌20min，待培养基温度冷却至50℃，在超净台上倒入90mm一次性培养皿约需20ml培养基。
所述步骤(2)中的LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/LNaOH调pH至7.0；用去离子水定容至1L。分装后高压下蒸汽灭菌20min，冷却备用。
所述步骤(3)中的液体培养基由甘油20ml、淀粉7.8g、K2PO40.68g、胰蛋白胨0.5g、酵母膏0.25g。用去离子水定容至1L；高压下蒸汽灭菌20min，冷却备用。
实施例4防治黄瓜白粉病的温室药效试验
(一)试验目的：测试多粘类芽孢杆菌发酵液和制剂对黄瓜白粉病的防效，并明确药剂的使用量和使用方法，为田间使用提供依据。
(二)试验条件
(1)供试靶标：作物：黄瓜；品种：颜如玉；病害：白粉病，孙桥温室自然发病；
(2)供试药剂：烯酰吗啉，有效成分含量：50％，水分散颗粒，江苏耘农化工有限公司；
(3)生长条件：大棚栽培；
(4)仪器设备：喷壶。
(三)试验设计
(1)表3：防治黄瓜白粉病试验药剂处理如下表
Figure BDA0001362259920000101
Figure BDA0001362259920000111
(2)试验处理
1)剂量设计：试验设置4个处理，3个重复；
2)喷药量：按照45L～60L/亩用药量处理，喷雾至叶面微滴水为度；
3)处理时间：本次试验从2016.3.17日起每隔7天施药一次(3.17、3.24、3.30、4.6、4.13)，直到出现白粉病共计施药5次；
4)病指统计时间：2016年4月26日；
5)用药方法：试验时用喷雾器从空白对照及药剂由低浓度到高浓度，分别将试验药剂均匀喷施于叶片。
(四)试验方法
选择长势一致的黄瓜开展试验，每20棵作为一个处理，共6个处理。
(五)数据处理与统计方法
(1)调查内容：调查植株发病情况，同时观察各处理药剂对作物的安全性
(2)调查方法：叶片上病斑数
(3)叶片发病程度分级标准为：0级：叶片上无病斑；l级：单叶有病斑3个；3级：单叶有病斑4-6个；5级：单叶有病斑7-10个；7级：单叶有病斑11-20个，部分密集成片；9级：单叶有病斑密集，占叶面积的1/4以上,待对照处理出现明显的病斑后调查并计算药效。
(4)统计分析：用邓肯氏方差分析对平均数的差异性进行显著性分析。
(六)结果与分析
(1)白粉病的防治如下表4所示，生物活体药物预防效果显著好于化学药物防效；
(2)表4：2016年4月白粉病发病情况如下表
处理 处理药剂 防效
1 多粘类芽孢杆菌发酵液 38.39b
2 多粘类芽孢杆菌制剂 51.2a
3 化药(烯酰吗啉) 26.74c
4 对照处理(清水) /
实施例5防治黄瓜霜霉病的温室药效试验
(一)试验目的
验证多粘类芽孢杆菌对黄瓜霜霉病的预防效果。
(二)试验条件
(1)供试靶标：作物：黄瓜；品种：颜如玉；病害：白粉病，孙桥温室自然发病；
(2)供试药剂：露娜森，有效成分：42.8％，悬浮剂，德国拜尔公司；
(3)生长条件：大棚栽培；
(4)仪器设备：喷壶
(三)试验设计
(1)表5：防治黄瓜霜霉病试验药剂处理如下表
Figure BDA0001362259920000121
(2)试验处理
1)剂量设计：试验设置5个处理，3个重复；
2)喷药量：按照45-50g/亩用药量处理，喷雾至叶面微滴水为度；
3)处理时间：第一次施药：5月19日、第二次施药：5月26日、第三次施药：6月3日；
4)病指统计时间：2016年6月10日
5)用药方法：试验时用喷雾器从空白对照及药剂，分别将试验药剂均匀喷施于叶片。
(四)试验方法
选择长势一致的黄瓜开展试验，每10棵作为一个处理，共4个处理，每处理3个重复。
(五)数据处理与统计方法
(1)调查内容：调查植株发病情况，同时观察各处理药剂对作物的安全性
(2)调查方法：叶片上病斑数
(3)叶片发病程度分级标准为：0级：叶片上无病斑；l级：单叶有病斑3个；3级：单叶有病斑4-6个；5级：单叶有病斑7-10个；7级：单叶有病斑11-20个，部分密集成片；9级：单叶有病斑密集，占叶面积的1/4以上,待对照处理出现明显的病斑后调查并计算药效。
(4)统计分析：用邓肯氏方差分析对平均数的差异性进行显著性分析。
(六)结果与分析
(1)霜霉病的防治如下下表6所示，生物活体药物预防效果显著好于化学药物防效；
(2)表6：2016年4月霜霉病发病情况如下表
Figure BDA0001362259920000122
Figure BDA0001362259920000131
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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<110> 上海万力华生物科技有限公司
<120> 一株多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1453
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
ggactggcgg gtgctatact gcagtcgagc ggggttgtta gaagcttgct tctaactaac 60
ctagcggcgg acgggtgagt aacacgtagg caacctgccc acaagacagg gataactacc 120
ggaaacggta gctaataccc gatacatcct tttcctgcat gggagaagga ggaaaggcgg 180
agcaatctgt cacttgtgga tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaaaggcc 240
taccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgccaggga 420
agaacgcttg atagagtaac tgctcttgaa gtgacggtac ctgagaagaa agccccggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg 540
cgtaaagcgc gcgcaggcgg ctctttaagt ctggtgttta atcccgaggc tcaacttcgg 600
gtcgcactgg aaactgggga gcttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tgggctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgaatgctag gtgttagggg tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac 840
attaagcatt ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900
acccgcacaa gcagtggagt atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc cctctgaccg gtctagagat agatctttcc ttcgggacag aggagacagg 1020
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccttat gcttagttgc cagcaggtca agctgggcac tctaagcaga ctgccggtga 1140
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200
cacgtactac aatggccggt acaacgggaa gcgaagccgc gatgtggagc caatcctaga 1260
aaagccggtc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaattgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttacaa cacccgaagt cggtgaggta accgcaagga gccagccgcc 1440
gaagctggtt gat 1453
<110> 上海万力华生物科技有限公司
<120> 一株多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 2
<211> 889
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 2
tttgctgatg tcaaaatcat ctccaatccc tgtacccatt gctgttacca ttgaccgtat 60
ttcatcactg gacaaaatac ggtccaagcg tgccttttcc acattcagga tcttaccgcg 120
aattggcaaa atcgcttgaa agtgacgatc acgcccctgc ttggccgatc cccctgctga 180
gtcaccttcg acgatgtaca gttcactgat cgaagcatcc ttagaggagc aatccgccag 240
cttacctggg agcgaactga tttccagcgc acttttgcga cgtgtaagtt cacgcgcttt 300
gcgtgctgct tcccgggcac gagctgcttg taacgattta tcaactacac ggcgggagac 360
ggacgggttc tcctccagaa attcctgaag tttctctgcg aacagggact cgacaattcc 420
tcgaacttca ctgttgccaa gctttgtttt agtctgaccc tcaaactgtg gttcaggaat 480
tttgacggag ataatcgctg tcaaaccttc gcgtacatcg tcaccagtca aattggcatt 540
gttgtcctta attaagccat ttttgcgtgc ataatcgtta ataatccggg ttaatgcact 600
cttgaaacct gattcatgag ttccgccctc atgagtattg atattgttgg cgaaagaata 660
aatattctcg gtatagctgt cgttatattg caatgcaact tcgacttgaa tcatgtcacg 720
agagccttcg acataaatcg gctgttcatg cagggcttct cttttttgat tcagaaactg 780
cacatactca ctgattccac cctcatagtg gaatgtatcg ctggcgcctg tccgttcatc 840
ggtcaagcta attgcaatgc ctttgttcaa gaaagccagc tcacgaatc 889

Claims (7)

1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在植物真菌病害中的应用，其特征在于，所述植物真菌病害为黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病；所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的保藏号为CGMCCNo.13554，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括如权利要求1中所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)；所述微生物制剂用于在防治植物真菌病害，所述植物真菌病害为黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病。
3.一种如权利要求2所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)划线制备所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株的单菌落于固态LB培养基上；
(2)将步骤(1)制备的单菌落接种至100ml/500ml(v/v)LB培养基摇瓶中；
(3)将步骤(2)培养的摇瓶放置30℃、转速180rpm/min摇床振荡培养48h；
(4)将步骤(3)培养的摇瓶接种至35L/50L(v/v)发酵罐的液体培养基中30℃、转速100rpm/min、通气量1.5m3/h、罐压0.1MPa培养96h。
4.根据权利要求3所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的固态LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/LNaOH调pH至7.0；加入15g琼脂用去离子水定容至1L；高压下蒸汽灭菌20min，待培养基温度冷却至50℃，在超净台上倒入90mm一次性培养皿需20ml培养基。
5.根据权利要求3所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的LB培养基由胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g组成，摇动容器直至溶质溶解；用5mol/LNaOH调pH至7.0；用去离子水定容至1L；分装后高压下蒸汽灭菌20min，冷却备用。
6.根据权利要求3所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的液体培养基由甘油20ml、淀粉7.8g、K2PO40.68g、胰蛋白胨0.5g、酵母膏0.25g；
用去离子水定容至1L；高压下蒸汽灭菌20min，冷却备用。
7.一种植物土传病害的生物防治方法，其特征在于，向具有真菌病害的植物施用权利要求1中所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)或权利要求2所述的微生物制剂。
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