CN115191441B - 防治瓜类叶部病害的生物制剂及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂，其成分分别包括大豆卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺和多粘类芽孢杆菌菌悬液。多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的；所述多粘类芽孢杆菌为“多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp‑HK11‑9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“CGMCC No.24634。该类生物制剂能有效防治瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等瓜类蔬菜叶部病害且防治过程无公害、绿色、环保。

Description

防治瓜类叶部病害的生物制剂及其制备和使用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种防治瓜类叶部病害的生物制剂及其制备和使用方法。
背景技术
蔬菜的种类和品种多种多样，其中瓜类是大宗蔬菜，瓜类蔬菜包括黄瓜、丝瓜、南瓜、西葫芦、冬瓜、苦瓜等。随着蔬菜栽培面积不断扩大，蔬菜复种指数增加，瓜类蔬菜病害十分严重，其中瓜类蔬菜叶部常见的病害主要有霜霉病、白粉病、棒孢叶斑病和细菌性角斑病等。
瓜类白粉病在瓜类自幼苗到成株期均可发病，主要危害叶片，也危害叶柄和茎。白粉病病一旦发生，扩展蔓延很快，给生产造成巨大损失。瓜类霜霉病由假菌界霜霉菌引起的一种世界性病害，在瓜类整个生育期均可危害，以成株期为重，主要为害叶片。霜霉病流行速度快，一两周内即可使除顶端嫩叶外的其他所有叶片枯死，减产高达30％～50％。棒孢叶斑病又称褐斑病，由真菌界棒孢属的真菌引起的常见的病害，近期在瓜类作物生产中危害加重，造成严重损失。
这些瓜类作物叶部病害的防治目前主要是采用化学药剂，但长期在大范围施用化学农药，会造成环境污染、农药残留、以及使病原物产生抗药性，降低药剂防效等，严重影响了瓜类产量和品质且不利于可持续发展。
目前，利用生物制剂来防治病虫害，已成为无公害绿色农业可持续发展的趋势，但现有的生物制剂通常存在抑菌谱窄、农业大田施用防治率不高的缺陷，致使还没有出现可以同时防治瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病的生物制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂及其制备和使用方法，以解决上述问题。
本发明提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂，包括卵磷脂、葵花油和蒸馏水，其中卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为(3～10):(10～50):(30～100)。
如图1和图2所示，由于葵花油和蒸馏水是不相溶的，所以，当不加卵磷脂时，蒸馏水中的葵花油粒比较大不均匀，很快产生分层，如图2B所示。当添加卵磷脂时，水中的葵花油粒比较小、均匀，至少保存6个月都不会产生离层，如图2A所示。因此，当卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为(3～10):(10～50):(30～100)时，葵花油和蒸馏水的亲和力比较好，葵花油粒大小约为5～10微米，比较均匀，保存长时间也不会产生离层。
基于上述，所述的防治瓜类叶部病害的生物制剂还包括硫磺悬浮剂，其中卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为(3～10):(10～50):(30～100):(0.01～0.1)。
基于上述，所述防治瓜类叶部病害的生物制剂，还包括多粘类芽孢杆菌菌悬液，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的，且所述多粘类芽孢杆菌的浓度为(4～6)×108CFU/mL；所述多粘类芽孢杆菌菌悬液与由所述卵磷脂、所述葵花油、所述蒸馏水、所述硫磺悬浮剂组成的预混料的体积比为1：(5～15)。
所述多粘类芽孢杆菌为“多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp-HK11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“CGMCC No.24634”。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。该多粘类芽孢杆菌菌株是2008年11月11日在河南信阳鸡公山采集的金鸡菊植物根际分离筛选获得。
基于上述，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液的浓度为(4～6)×108CFU/mL；所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.01mL～0.1mL，(NH4)2SO4 0.01g～0.1g，K2HPO4 0.07g～0.1g，KH2PO4 0.02g～0.1g，MgSO4 0.001g～0.01g，蒸馏水1000mL。
本发明还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为(3～10):(10～50):(30～100):(0.01～0.1)分别称取原料并用破壁机混合3～5分钟，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂。其中，利用破壁机进行混合处理的主要是因为大豆卵磷脂和葵花油在水中形成的油粒比较大，利用破壁机将油粒打碎形成小粒。
基于上述，本发明还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为(3～10):(10～50):(30～100):(0.01～0.1)分别称取大豆卵磷脂、葵花油、蒸馏水和硫磺悬浮剂进行混合，并用破壁机粉碎3～5分钟，然后以体积比为(5～15):1的比例添加多粘类芽孢杆菌菌悬液，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂，其中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的，且所述多粘类芽孢杆菌的浓度为(4～6)×108CFU/mL。
本发明还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的使用方法，其步骤包括：将上述生物制剂分别稀释100～200倍后进行叶面喷雾处理，在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；当瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
其中，为了便于区分，将由卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂、多粘类芽孢杆菌菌悬液制得的制剂记为微生物制剂；将由卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂制得的制剂记为生物制剂。
具体地，本发明中的葵花油在植物叶部产生保护膜，起到防止病原菌侵入作用，是多种植物油中筛选出的效果比较好又比较经济的植物油；卵磷脂中的胆碱对脂肪有亲和力，能够起到油和水的亲和作用；硫磺胶悬剂用于防治病虫害，它对人、畜安全不易使作物产生药害，但是将硫磺单独喷雾到叶片时，会在叶表面产生大量药痕，而与卵磷脂、葵花油、蒸馏水混合后不留药痕，同时又能保护植物免受病原菌侵染的作用。经试验验证，生物制剂能够有效防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
同时，通过实验显示，生物制剂中选用的多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9菌株抑菌谱比较宽，能抑制黄瓜棒孢叶斑病菌、番茄叶霉病菌、灰霉病菌、芹菜早疫病菌、番茄早疫病菌、枯萎病菌、辣椒疫病菌、麦根腐平脐蠕孢等多种病原菌。特别是对棒孢霉菌的抑菌活性高，能强烈抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发。此外，该多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9菌株的悬浮液对黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的防治效果均能够达到50％以上。所以，本发明提供的含有该Pp-HK11-9悬浮液的微生物制剂能够明显提高防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病等叶部病害的效果，且应用时仅需要喷雾至叶部即可，施用方法简单、易于农业生产上进行实际应用，且还可以提高黄瓜的免疫能力，有利于提高产量和品质。
附图说明
图1为在显微镜下葵花油在蒸馏水中的形态(A为添加卵磷脂，B为未加卵磷脂)。
图2为葵花油在蒸馏水中的形态(A为添加卵磷脂，B为未加卵磷脂)。
图3为本发明提供的多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9的菌落形态。
图4为根据16Sr DNA测序结果构建的Pp-HK11-9的系统发育树，分支上的数字代表置信度。
图5为本发明提供的多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9的生物学特性图。
图6为本发明提供的多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9对植物病原菌的抑菌谱图。
图7为实施例2和实施例3的制剂对盆栽黄瓜白粉病的预防效果和治疗效果比较图，图中A为预防效果，B为治疗效果。
图8为实施例2和实施例3的制剂对盆栽黄瓜霜霉病的防治效果图。
图9为实施例2和实施例3的制剂对盆栽黄瓜棒孢叶斑病的防治效果图。
图10为实施例2和实施例3的制剂对田间黄瓜白粉病的防治效果图。
图11为实施例2和实施例3的制剂对田间黄瓜霜霉病的防治效果图。
图12为实施例2和实施例3的制剂对田间棒孢叶斑病的防治效果图。
图13为实施例2生物制剂处理后白粉菌的形态图；图标A为显微镜下观察的有无喷施生物制剂的白粉病菌分生孢子形态对照图，图标B为在黄瓜表面有无喷施生物制剂的白粉病菌形态对照图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂，包括卵磷脂、葵花油和蒸馏水，其中卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为3:10:30。
本实施例还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，其包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水的质量比为3:10:30，分别称取大豆卵磷脂、葵花油和蒸馏水并用破壁机混合5分钟。
实施例2
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂，包括卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂。其中卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为3:10:30:0.01。
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害生物制剂的制备方法，其包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为3:10:30:0.01分别称取原料进行混合，并用破壁机粉碎5分钟，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂。
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害生物制剂的使用方法，其步骤包括：将生物制剂稀释100倍～200倍后进行叶面喷雾处理，瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病发病初期，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
利用生物制剂处理后白粉菌的形态如图13所示，从图13A可以看出，与没有喷施生物制剂的对照组相比，生物制剂处理的白粉病菌分生孢子皱缩变形，从图13B可以看出，与没有喷施生物制剂的对照组相比在黄瓜叶片表面存在的白粉病菌分生孢子明显减少。
实施例3
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害生物制剂，包括卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂、多粘类芽孢杆菌菌悬液。其中，该多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的。所述多粘类芽孢杆菌的浓度为4×108CFU/mL；所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.01mL、(NH4)2SO4 0.01g、K2HPO4 0.07g、KH2PO4 0.02g、MgSO40.001g、蒸馏水1000mL。
其中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液与由所述卵磷脂、所述葵花油、所述蒸馏水、所述硫磺悬浮剂组成的预混料的体积比为1：5。
具体地，如图3至图6所示，所述多粘类芽孢杆菌为“多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp-HK11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“CGMCC No.24634”。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。该多粘类芽孢杆菌菌株是2008年11月11日在河南信阳鸡公山采集的金鸡菊植物根际分离筛选获得。
更具体地，所述多粘类芽孢杆菌的筛选和培养步骤包括：
在河南省信阳鸡公山采集健康生长的金鸡菊根部带土剪取1～2g，用研钵研碎，在100mL的无菌水中混荡培养30分钟，然后在80℃恒温水浴锅处理20分钟，用无菌水稀释至1000～10000倍，将稀释好得到的混合液均匀地涂在1/10TSA培养基平板上，倒置放于30℃恒温培养箱中培养48～72h。待菌株长出后，用无菌牙签挑取大小、颜色和形态不同的细菌菌落，在TSA培养基平板上划线分离纯化，纯化后的菌株与棒孢叶斑病菌进行对峙培养，筛选出对棒孢叶斑病菌具有拮抗活性的多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9，并将多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9菌株放-80℃超低温冰箱里保存。
菌株的鉴定：采用TSA培养基在28～32℃培养上述Pp-HK11-9菌株，在TSA培养基上菌落呈乳白色，边缘呈锯齿状，不透明，培养3～5天形成如图1所示的菌落。
从图中3和图4可以看出：Pp-HK11-9菌体为直杆状，革兰氏染色反应呈阳性，产生芽孢，具有运动性；生长温度范围为4～50℃，最适生长温度为30℃，最适pH为6.2～7.5，最高耐盐度为4％，可以利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、L-阿拉伯糖和山梨醇，亚硝酸还原、硝酸盐反应、淀粉水解和过氧化氢酶反应呈阳性，不产生硫化氢，明胶液化呈阴性。葡萄糖氧化发酵为发酵型。如图3所示，该菌16S rDNA序列全长为1449bp，与Paenibacilluspolymyxa(多粘类芽孢杆菌)的16S rDNA序列相似性达到99.72％，所以该菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp-HK11-9。
菌株的生物学功能：采用平板对峙法研究多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9抑菌情况，具体如图6所示，从图中可以看出，本该多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9抑菌谱比较宽，能抑制黄瓜棒孢叶斑病菌(棒孢霉Corynespora cassiicola)、番茄叶霉病菌(黄褐孢霉Fulviafulva)、灰霉病菌(灰葡萄孢Botrytis cineria)、芹菜早疫病菌(芹菜尾孢Cercosporaapci)、番茄早疫病菌(茄链格孢Alternaria solani)、枯萎病菌(尖孢镰孢Fusariumoxysporum)、辣椒疫病菌(辣椒疫霉Phytophthora capsici)、麦根腐平脐蠕孢(Bipolarissorokiniana)等多种病原菌。特别是对棒孢霉菌(黄瓜棒孢叶斑病菌)的抑菌活性高。另外，从图5中可以看出，多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9菌株具有分解淀粉、分解纤维素、分解蛋白、产嗜铁素等功能，有利于其发挥防病促生作用。
具体地，该多粘类芽孢杆菌菌悬液的制备方法，其包括以下步骤：
将多粘类芽孢杆菌菌株经过TSA培养基培养得到的多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9菌种；将所述多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9菌种接种到发酵培养基上，并在32℃发酵培养48h，得到该多粘类芽孢杆菌发酵液；
其中，发酵培养基的配方包括蛋白胨20g、酵母膏5g、NaCl 0.5g、0.25mol/L KCl10mL、2mol/L MgCl2 5mL、1mol/L葡萄糖20mL和蒸馏水1000mL，发酵培养基的pH值为7.0；
对所述多粘类芽孢杆菌发酵液进行离心处理，得到多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9的菌体；采用无菌缓冲溶液稀释所述多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9的菌体，获得多粘类芽孢杆菌菌悬液。
本实施例还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为3:10:30:0.01分别称取原料并用破壁机混合5分钟，得到预混料，然后以体积比为5:1的比例向预混料中添加多粘类芽孢杆菌菌悬液，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂。
本实施例还提供一种所述的防治瓜类叶部病害的生物制剂的使用方法，其步骤包括：
将防治瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等叶部病害的生物制剂稀释100倍～200倍后进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。其中，为了便于区分，将本实施例制得的生物制剂记为微生物制剂。
实施例4
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害生物制剂，包括卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂、多粘类芽孢杆菌菌悬液。该多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的。
所述多粘类芽孢杆菌为“多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp-HK11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“CGMCC No.24634”。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。该多粘类芽孢杆菌菌株是2008年11月11日在河南信阳鸡公山采集的金鸡菊植物根际分离筛选获得。
其中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液的浓度为5×108CFU/mL；所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.1mL、(NH4)2SO4 0.1g、K2HPO4 0.1g、KH2PO40.1g、MgSO4 0.01g、蒸馏水1000mL。其中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液与由所述卵磷脂、所述葵花油、所述蒸馏水、所述硫磺悬浮剂组成的预混料的体积比为1：15。
本实施例还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为10:50:100:0.1分别称取原料进行混合并用破壁机粉碎3分钟，得到预混料，然后以体积比为15:1的比例向预混料中添加多粘类芽孢杆菌菌悬液，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂。
本实施例还提供一种所述的防治瓜类叶部病害的生物制剂的使用方法，其步骤包括：将防治瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等叶部病害的生物制剂稀释100倍～200倍后进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
实施例5
本实施例提供一种防治瓜类叶部病害生物制剂，包括卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂、多粘类芽孢杆菌菌悬液。该多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的。
所述多粘类芽孢杆菌为“多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa Pp-HK11-9”，于2022年04月01日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为“CGMCC No.24634”。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。该多粘类芽孢杆菌菌株是2008年11月11日在河南信阳鸡公山采集的金鸡菊植物根际分离筛选获得。
其中，所述多粘类芽孢杆菌的浓度为5×108CFU/mL；所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.05mL、(NH4)2SO4 0.05g、K2HPO4 0.08g、KH2PO4 0.08g、MgSO4 0.007g、蒸馏水1000mL。其中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液与由所述卵磷脂、所述葵花油、所述蒸馏水、所述硫磺悬浮剂组成的预混料的体积比为1：9。
本实施例还提供一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为8:25:70:0.05分别称取原料进行混合并用破壁机粉碎4分钟，得到预混料，然后以体积比为9:1的比例向预混料中添加多粘类芽孢杆菌菌悬液，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂。
本实施例还提供一种所述的防治瓜类叶部病害的生物制剂的使用方法，其步骤包括：将防治瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等叶部病害的生物制剂稀释100倍～200倍后进行叶面喷雾处理；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病等病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次。
防治效果：
下面以实施例2和实施例3提供的防治瓜类叶部病害的生物制剂和微生物制剂为例，试验对黄瓜白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病的防治效果。
试验样品分组：
生物制剂组：实施例2提供的生物制剂100倍；
微生物制剂组：实施例3提供的微生物制剂100倍；
化学药剂组：50％烯酰吗啉可湿性粉剂3000倍；
对照组：清水。
1、黄瓜叶部常见病害的活体接种试验
(1)盆栽人工接种白粉病病菌防治试验：
1)白粉病病菌预防效果试验：
黄瓜2～3片真叶时，上述四组试验样品采用叶面喷雾处理的方式，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后在叶部喷雾接种黄瓜白粉病孢子菌悬液(105-6孢子/mL)，接种后套袋保湿，25～28℃温室培养，两天后去掉套袋继续培养。培养5～7d调查发病情况。结果如表1和图7所示。
2)白粉病病菌治疗效果试验：
黄瓜2～3片真叶时，叶面喷雾接种黄瓜白粉病孢子菌悬液(105-6孢子/mL)，接种白粉病孢子菌悬液24h后，叶面喷雾处理上述四组试验处理，然后套袋保湿，25～28℃温室培养，两天后去掉套袋继续培养。培养5～7d调查发病情况，结果如表1和图7所示。
其中，调查和防效计算方法如下：
白粉病和霜霉病病情调查根据病斑占面积，其分级标准：
0级：无病斑；
1级：病斑占整个叶片面积的≤5％；
3级：病斑占整个叶片面积的＞5％，≤10％；
5级：病斑占整个叶片面积的＞10％，≤25％；
7级：病斑占整个叶片面积的＞25％，≤50％；
9级：病斑占整个叶片面积的＞50％以上。
棒孢叶斑病病情调查根据病斑直径，其分级标准为：
0级：病斑直径0cm；
1级：病斑直径≤0.2cm；
2级：病斑直径＞0.2cm，≤0.4cm；
3级：病斑直径＞0.4cm，≤0.6cm；
4级：病斑直径＞0.6cm。
病情指数和防治效果计算公式：
病情指数＝〔Σ(各级病叶数×各级代表值)/(调查总数×最高级代表值)〕×100；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。
表1制剂对黄瓜白粉病的预防和治疗效果的比较
Figure BDA0003798247370000121
从表1、图7中可以看出：利用本发明实施例2提供的生物制剂和实施例3提供的微生物制剂处理的黄瓜白粉病发病很轻，病情指数明显低于化学药剂和对照处理。由此证明，本发明实施例2提供的生物制剂和实施例3提供的微生物制剂能够预防和治疗黄瓜白粉病。同时，两种试验结果相比，本实施例提供的生物制剂和微生物制剂对黄瓜白粉病的预防效果优于治疗效果，且微生物制剂的治疗效果优于生物制剂。
(2)盆栽人工接种霜霉病病菌防治试验：
黄瓜2～3片真叶时，叶面喷雾处理上述四组试验处理，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后在叶部喷雾接种黄瓜霜霉病菌游动孢子囊悬浮液(104-5孢子囊/mL)，接种后套袋保湿，25～28℃温室培养，两天后去掉套袋继续培养。培养4～5d调查发病情况。试验结果如下表2和图8所示。
表2盆栽人工接种制剂处理对黄瓜霜霉病的防治效果
样品 病情指数 防治效果(％)
生物制剂 7.80±3.21a 68.41
微生物制剂 8.72±1.70a 64.68
化学药剂 12.39±2.12b 49.82
对照 24.69±2.48c -
从表2和图8中可以看出，利用本发明实施例2和实施例3提供的生物制剂和微生物制剂处理的黄瓜霜霉病发病很轻，病情指数明显低于化学药剂和对照处理。由此证明，本发明实施例2提供的生物制剂和实施例3提供的微生物制剂能够防治黄瓜霜霉病。
(3)盆栽人工接种棒孢叶斑病病菌防治试验：
黄瓜2～3片真叶时，叶面喷雾处理上述四组试验处理，将黄瓜叶片正反面喷均匀，等晾干后在叶部针刺接种棒孢叶斑病菌分生孢子菌悬液(108孢子/mL)，每孔5μL孢子菌悬液，接种后套袋保湿，25℃温室培养，两天后去掉套袋继续培养。培养5～7d调查发病情况。试验结果如下表3和图9所示。
表3盆栽人工接种制剂处理对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果
Figure BDA0003798247370000131
Figure BDA0003798247370000141
从表3和图9中可以看出，利用本发明实施例2和实施例3提供的生物制剂和微生物制剂处理的黄瓜棒孢叶斑病发病很轻，病情指数明显低于化学药剂和对照处理。由此证明，本发明实施例2提供的生物制剂和实施例3提供的微生物制剂能够防治黄瓜棒孢叶斑病。
2、常见瓜类病害条件下的田间栽培试验
黄瓜田间栽培试验：
将黄瓜苗移栽定植，然后按常规方法进行水肥管理，在此期间，黄瓜白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病发病初期，每隔7d叶面分别喷雾处理上述四组试验处理，共处理4次，然后每隔4d叶面再次分别喷雾处理上述四个试验处理，共处理4次。在此期间，调查霜霉病、白粉病、棒孢叶斑病发病情况和黄瓜产量和品质，结果分别如图10、11、12及表4～7所示。
(1)田间发病情况
表4各种制剂对田间黄瓜白粉病、霜霉病、棒孢叶斑病的防治效果
Figure BDA0003798247370000142
从图10、图11、图12中和表4中可以看出，利用本发明实施例2和实施例3提供生物制剂和微生物制剂处理黄瓜白粉病、棒孢叶斑病和霜霉病均发病很轻，防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病的效果均能够达到50％以上，病情指数明显底于化学药剂。由此证明，本发明实施例2提供的生物制剂和实施例3提供的微生物制剂能够在大田种植时，能够防治黄瓜棒孢叶斑病、白粉病和霜霉病。
(2)黄瓜产量和品质
表5制剂处理对黄瓜产量的影响
样品 亩产量(kg) 增产率(％)
生物制剂 2478.00±15.0a 22.25
微生物制剂 2483.23±12.6a 22.50
化学药剂 2298.00±35.40b 13.37
对照 2027.13±15.04c -
表6制剂处理的黄瓜果实品质相关指标
处理 可溶性糖含量(％) 蛋白质含量(μg/g) VC含量(mg/100g)
生物制剂 0.172±0.002a 15.87±0.26b 1.944±0.24b
微生物制剂 0.173±0.002a 16.19±0.52a 2.483±0.25a
化学药剂 0.153±0.003b 14.52±0.19c 1.541±0.24c
对照 0.084±0.003c 13.92±0.23d 0.995±0.29d
从表5和6中可以看出：利用本发明实施例提供生物制剂和微生物制剂处理具有增产效果，且黄瓜果实中维生素C、可溶性糖和蛋白质含量增加，具有明显的提高果实品质的作用。就生物制剂和微生物制剂而言，微生物制剂处理过的黄瓜果实中的蛋白质和维生素C含量显著性增加。
表7制剂处理的黄瓜叶片厚度
样品 叶片厚度(mm)
生物制剂 0.65±0.03a
微生物制剂 0.64±0.02a
对照 0.51±0.01b
田间黄瓜叶片厚度及田间黄瓜叶片上生物制剂处理后白粉菌的形态：黄瓜叶片的厚度测定结果如表7所示。从表7中可以看出：利用本发明实施例提供生物制剂和微生物制剂处理黄瓜叶表面光滑，叶片变厚，不利于病原菌的侵入。
因此，本发明实施例提供的生物制剂和微生物制剂可以提高黄瓜的免疫能力、能够同时防治黄瓜白粉病、霜霉病和棒孢叶斑病，有利于提高黄瓜产量和品质。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (5)

1.一种防治瓜类叶部病害的生物制剂，其特征在于，包括多粘类芽孢杆菌菌悬液、卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂，其中卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为（3～10）:（10～50）:（30～100）:（0.01～0.1）；所述多粘类芽孢杆菌菌悬液与由所述卵磷脂、所述葵花油、所述蒸馏水、所述硫磺悬浮剂组成的预混料的体积比为1：（5～15）；
所述多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的，且所述多粘类芽孢杆菌的浓度为（4～6）×108 CFU/mL；所述多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9，保藏编号为 CGMCC No.24634。
2.根据权利要求1所述的防治瓜类叶部病害的生物制剂，其特征在于，所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油 0.01 mL～0.1 mL，(NH4)2SO4 0.01 g～0.1 g，K2HPO4 0.07 g～0.1 g，KH2PO4 0.02 g～0.1 g，MgSO4 0.001 g～0.01 g，蒸馏水1000 mL。
3.一种防治瓜类叶部病害的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：按照卵磷脂、葵花油、蒸馏水、硫磺悬浮剂的质量比为（3～10）:（10～50）:（30～100）:（0.01～0.1）分别称取原料，进行混合后得到预混料，然后以所述预混料与多粘类芽孢杆菌菌悬液的体积比为（5～15）: 1的比例向所述预混料中添加多粘类芽孢杆菌菌悬液，得到防治瓜类叶部病害的生物制剂，其中，所述多粘类芽孢杆菌菌悬液是由多粘类芽孢杆菌的菌体分散于无菌缓冲溶液制得的，且所述多粘类芽孢杆菌的浓度为（4～6）×108 CFU/mL；所述多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌Pp-HK11-9，保藏编号为 CGMCC No.24634。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述无菌缓冲溶液的配方为：甘油0.01 mL～0.1 mL，(NH4)2SO4 0.01 g～0.1 g，K2HPO4 0.07 g～0.1 g，KH2PO4 0.02 g～0.1g，MgSO4 0.001 g～0.01 g，蒸馏水1000 mL。
5.一种权利要求1或2所述的防治瓜类叶部病害的生物制剂的使用方法，其步骤包括：将所述防治瓜类叶部病害的生物制剂稀释100～200倍后进行叶面喷雾处理；在瓜类叶部病害发病初期时，每隔7天喷雾一次，共喷3～4次；在瓜类叶部病害发病严重时，每隔4天喷雾一次，共喷4～5次；其中所述瓜类叶部病害为黄瓜棒孢叶斑病、黄瓜白粉病和黄瓜霜霉病。
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