CN116042471A - 耐盐芽孢杆菌及其菌液和应用 - Google Patents

耐盐芽孢杆菌及其菌液和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株耐盐芽孢杆菌，为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans Bh‑HP7‑12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21697。本发明还提供了一种上述菌株的菌液及应用。上述耐盐芽孢杆菌能强烈抑制辣椒、黄瓜、番茄等植物生长过程中枯萎病菌的菌丝生长、孢子形成和孢子萌发，抑制根际土壤病原菌的浓度并防止病原菌侵入，同时具有强耐盐能力，高盐条件下正常生长和定殖。因此，利用所述耐盐芽孢杆菌及其菌液能够促进植株生长，提高植株的抗逆能力，并显著提高根系活力，提高产量和品质。

Description

耐盐芽孢杆菌及其菌液和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种耐盐芽孢杆菌及其菌液与应用。
背景技术
土壤盐渍化、土传病害、土壤污染等土壤劣变是限制设施蔬菜产量和品质提升的主要胁迫因子，严重影响着植物生长，影响产量和品质。目前在生产中大量使用化肥和化学农药等会造成环境污染和食品安全问题，而且增加生产成本，还会诱发病原菌产生抗药性、土壤板结、土壤盐碱化的加重等问题。而植物根际促生菌在调节植物根际土壤环境、调控植物生长发育和提高植物系统抗性等方面具有重要作用。近年来，利用植物根际促生菌调节土壤微生物群落及土壤环境，保持土壤健康，提高植物胁迫耐受性受到广泛关注。通过识别和利用能与蔬菜作物相互作用的植物促生菌来减轻胁迫，为提高设施蔬菜逆境抗性提供了一种新策略，也为与胁迫耐受相关新机制的发现开辟了新途径。
植物根际土壤中存在着大量的微生物，它们中大多数是有益的，在土壤的物质转化、结构形成、以及抑制病原菌活性等方面发挥着重要的作用。植物根际促生细菌(PlantGrowth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)是存在于植物根际环境中，通过产生激素、溶磷、固氮等直接作用和竞争生态位、诱导植物系统抗性等间接作用促进植物生长的一类有益细菌。近年来大量研究表明，PGPR菌株能在植物根系及根际土壤有效定殖，具有促生、防病和增产效果、同时调节植物根际土壤微生态环境、缓解生态污染等特性，成为有机生态农业可持续发展的有效途径之一，应用前景十分广阔。植物根际促生细菌主要包括假单胞菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、类芽孢杆菌等，其中芽孢杆菌(Bacillus spp.)和类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)因能产生芽孢，耐高温耐干旱条件，且繁殖速度快，易在土壤定殖等优点被广泛应用。但在实际应用过程中大部分的有益微生物在高盐等复杂的土壤环境中无法正常生长繁殖，而耐盐芽孢杆菌是能够在高盐环境下生长繁殖，有利于发挥其促生、防病等自身活性。同一种耐盐芽孢杆菌对不同病原菌的拮抗活性、耐盐能力等功能存在较大差别，因此需要继续筛选出具有更多功能和活性的菌株，可以挖掘潜在的农用微生物资源，研发新型微生物制剂，提供更丰富的菌种资源。
为此，中国发明专利申请CN 111979149 A公开了一种耐盐芽孢杆菌SY1836及其应用。耐盐芽孢杆菌SY1836的保藏编号为CGMCC No.20080，具备较好的拮抗各种植物病原菌的效果，应用于辣椒生长过程中时，可以有效降低辣椒的病情指数，具备显著的辣椒疫病防治效果；同时，该耐盐芽孢杆菌SY1836还可以显著提高辣椒生长过程中的株高和鲜重。又例如，中国发明专利申请CN 115058358 A公开了一株耐盐芽孢杆菌及其应用，该耐盐芽孢杆菌菌株的保藏编号为CGMCC No.24115，具有对植物病原菌的抑菌活性并且具有较宽的抑菌谱；室内和田间试验结果表明，上述菌株发酵液对葡萄枝干病害具有一定的防治效果；此外，该菌株发酵滤液对葡萄叶面积和叶绿素含量具有明显的促进作用。
上述专利申请中的耐盐芽孢杆菌菌株虽然对植物病原菌具有抑菌活性的作用，并分别对辣椒和葡萄枝干的病害有防治效果，但并没有公开对具有缓解盐胁迫的功能，也没有公开其对其它蔬菜病害具有防治效果。
发明内容
有鉴于此，本发明确有必要提供一株耐盐芽孢杆菌及其菌液与应用，以解决上述问题。
具体地，本发明采取如下技术方案：
本发明提供一种耐盐芽孢杆菌，它为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans Bh-HP7-12，已于2021年01月21日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.21697。该耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌株是2017年8月23日在河南潢川采集的黄瓜根系分离、筛选获得。
本发明所得到的菌株具有以下生物学特性：该菌株的菌体为直杆状，直径0.5～0.8μm，长2.0～2.6μm，产生芽孢，革兰氏阳性，多个周生鞭毛，生长温度范围为4～50℃，最适生长温度为30～32℃，最高耐盐浓度为14％。在营养肉汁培养基(NA)上生长出黄色、不透明、表面不光滑、边缘不规则的菌落。该耐盐芽孢杆菌能利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、单宁酸、甘露醇，不能利用柠檬酸，硝酸盐还原、亚硝酸还原、过氧化氢酶反应和明胶液化呈阳性。该菌株的16S rRNA序列全长为1456bp，Bacillus halotolerans(耐盐芽孢杆菌)的16S rRNA序列同源性达到99％。综上所述，综合该菌株的菌落形态、培养条件和生理生化特性及分子生物学鉴定的结果，该菌株属于芽孢杆菌属的耐盐芽孢杆菌，其命名为Bacillushalotolerans Bh-HP7-12。
本发明提供的耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌株具有强耐盐能力，14％盐浓度下能够正常生长，在250mmol/L NaCl溶液的高盐胁迫环境下仍能够缓解盐胁迫并促进植物生长；耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌株抑制引起枯萎病的尖孢镰刀菌，抑制其菌丝生长、孢子形成和孢子萌发并防止病原菌侵入，有效防治植物枯萎病；耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌株抑菌谱比较广，除了能够抑制引起枯萎病的尖孢镰刀菌以外，还能够抑制引起小麦茎基腐病的禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌、引起小麦根腐病的麦根腐旋孢腔菌、引起小麦纹枯病的禾谷丝核菌、引起小麦全蚀病的顶囊壳菌、引起番茄叶霉病的黄褐孢霉菌、引起疫病的疫霉菌、引起炭疽病的炭疽菌、引起芹菜早疫病的尾孢菌、引起青枯病的拉尔氏菌等多种植物病原菌；还具有分解蛋白、分解淀粉、分解纤维素、产嗜铁素和产吲哚乙酸等功能。
本发明提供一种耐盐芽孢杆菌菌液，它包括所述耐盐芽孢杆菌和含硫酸镁缓冲液。
基于上述，所述耐盐芽孢杆菌菌液中耐盐芽孢杆菌的浓度为(1～5)×108CFU/mL。
基于上述耐盐芽孢杆菌菌液，它是通过含硫酸镁缓冲溶液和所述耐盐芽孢杆菌混合得到的，以100质量份计，所述含硫酸镁缓冲溶液包括以下质量份的组分：硝酸钾0.1～0.2份、氯化钠0.02～0.1份、磷酸氢二钾0.5～0.9份、磷酸二氢钾0.1～0.3份、硫酸镁0.01～0.05份、蔗糖0.5～1.5份、余量为无菌水。
本发明还提供一种上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12及其菌液在促进蔬菜植株幼苗生长和定殖中的作用。其中，所述蔬菜为黄瓜、辣椒或番茄。
本发明还提供一种促进蔬菜植株生长的方法，包括：
向所述蔬菜的植株或种子施用上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12或其菌液，其中，所述蔬菜为黄瓜、辣椒或番茄，所述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12的总活菌数不小于1×108CFU/mL。
基于上述方法，所述施用为施用于所述蔬菜植株的根际。具体地，蔬菜植株幼苗在移栽前进行根部浸泡处理或在移栽后20d之内进行灌根处理。
基于上述方法，所述施用为播种前利用上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12或其菌液浸泡所述蔬菜种子。
基于上述方法，所述施用为施用于所述蔬菜的育苗基质，将上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12或其菌液与所述育苗基质均匀混合。优选地，所述育苗基质和所述耐盐芽孢杆菌菌液的质量比为(10～15):1。
因此，本发明提供的上述耐盐芽孢杆菌能强烈抑制辣椒、黄瓜、番茄等植物生长过程中枯萎病菌的菌丝生长、孢子形成和孢子萌发，抑制根际土壤病原菌的浓度并防止病原菌侵入，同时具有强耐盐能力，在高盐条件下正常生长和定殖。
本发明提供的上述促进蔬菜植株生长的方法，利用所述耐盐芽孢杆菌或其菌液对植物种子进行浸泡、对待移栽植株的根部进行浸泡和对移栽后植株根际土壤进行浇灌，或者在采用所述耐盐芽孢杆菌菌液施用于育苗基质和幼苗育苗期浇灌；能够促进植株生长，缓解盐胁迫、枯萎病胁迫以及两者的复合胁迫，提高植株的抗逆能力，并显著提高根系活力，提高产量和品质。
附图说明
图1为耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌体形态(左)和菌落形态(右)。
图2为基于16S rRNA构建的Bh-HP7-12菌株的系统发育树图。
图3为Bh-HP7-12菌株在液体培养(左)和固体培养(右)条件下的耐盐能力图。
图4为Bh-HP7-12对尖孢镰刀菌的抑菌活性图。
图5为Bh-HP7-12对多种植物病原菌的抑菌活性图。
图6为Bh-HP7-12对尖孢镰刀菌产孢量(左图)和孢子萌发的抑制效果图(右图)。
图7为Bh-HP7-12菌株的生物学特性图。
图8为在枯萎病胁迫条件下本发明实施例3提供的Bh-HP7-12菌株在黄瓜根际定殖密度图。
图9为本发明实施例3提供的Bh-HP7-12菌液对黄瓜枯萎病的防治效果图(左图：效果图；右图：病情指数)。
图10为在盐胁迫条件下本发明实施例3提供的Bh-HP7-12在黄瓜根际定殖密度图。
图11为本发明实施例3提供的Bh-HP7-12菌液的灌注处理对黄瓜盐胁迫的缓解效果图。
图12为本发明实施例3提供的Bh-HP7-12菌液处理的黄瓜盐胁迫指数图。
图13为本发明实施例2提供的Bh-HP7-12菌液的浸种处理在盐胁迫条件下根系生长的促进效果图。
图14为利用本发明实施例4提供的Bh-HP7-12菌液配制的微生物育苗基质与普通蔬菜育苗基质培育的黄瓜苗对枯萎病和盐复合胁迫的抗性比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施例1Bh-HP7-12菌株的获得与鉴定
菌株的获得：2017年8月23日在河南省潢川采集黄瓜根部带土剪取1～2g，用研钵研碎，在100mL的无菌水中混荡培养30分钟，然后在80℃恒温水浴锅处理20分钟，用无菌水稀释至1000～10000倍，将稀释好得到的混合液均匀地涂在1/10TSA培养基平板上，倒置放于30℃恒温培养箱中培养48～72h，待菌株长出后，挑取大小、颜色和形态不同的细菌菌落，在TSA培养基平板上划线分离纯化，纯化后的菌株在加盐(NaCl 10％)培养基上培养，筛选出耐盐菌，然后与植物病原菌(如，枯萎病菌尖孢镰孢菌等)对峙培养，获得耐盐拮抗菌耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌株，并将Bh-HP7-12菌株放-80℃超低温冰箱里保存。
菌株鉴定
菌落形态：Bh-HP7-12菌株的菌落形态如图1所示，菌株的菌体为直杆状，产生芽孢，革兰氏阳性，在营养肉汁培养基(NA)上生长出黄色、不透明、表面不光滑、边缘不规则的菌落。
生理生化特性：Bh-HP7-12菌株的生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)，对碳源的利用、对氮源的利用、硝酸盐还原、亚硝酸还原、明胶液化、过氧化氢酶试验等生理生化指标进行测定，测定结果见表1。
表1 Bh-HP7-12的生理生化特性
鉴定指标 Bh-HP7-12 鉴定指标 Bh-HP7-12
生长温度范围 4℃～50℃ 尿素 -
耐盐浓度 ≤14％ 蛋白胨 +
葡萄糖氧化发酵和运动性 发酵型，运动型 氯化铵 +
蔗糖 + 硫酸铵 +
葡萄糖 + 硝酸钙 -
半乳糖 + 硝酸铵 -
麦芽糖 + 硝酸盐还原反应 +
单宁酸 + 亚硝酸盐还原反应 +
柠檬酸 - 明胶液化 +
甘露醇 + 过氧化氢酶试验 +
从表1中可以看出：Bh-HP7-12菌株在NB培养液中培养24h后，出现浑浊；生长温度范围为4～50℃，最适生长温度为30℃，最高耐盐浓度为14％。Bh-HP7-12菌株能利用蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、单宁酸、甘露醇、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵进行发酵，但不能利用柠檬酸、尿素、硝酸钙和硝酸铵进行发酵；硝酸盐还原、亚硝酸还原、过氧化氢酶反应和明胶液化均呈阳性。
16S rRNA序列同源性鉴定：Bh-HP7-12菌株的16S rRNA序列全长为1456bp，使用NCBI的BLAST功能，将测序获得序列与GeneBank数据库中进行同源性检索，与Bacillushalotolerans(耐盐芽孢杆菌)的16S rRNA序列同源性达到99％；使用MEGA软件构建基础绘制系统发育树如图2所示，最终确定Bh-HP7-12菌株为芽孢杆菌属耐盐芽孢杆菌，与前述菌落形态、培养条件和生理生化特性及分子生物学的结果一致，该菌株属于芽孢杆菌属的耐盐芽孢杆菌，其命名为Bacillus halotolerans Bh-HP7-12。
进一步将上述耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans Bh-HP7-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类命名：耐盐芽孢杆菌(Bacillushalotolerans)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No.21697；保藏日期：2021年01月21日。
菌株的生物学功能：
1、菌株的耐盐能力
试验方法：将Bh-HP7-12菌株接种到加盐(NaCl)的TSB培养基上，置于28℃恒温震荡培养72h后观察Bh-HP7-12的生长与否，结果如表2和图3所示。
表2Bh-HP7-12的耐盐生长能力
Figure BDA0004030187100000061
从表2和图3可知：Bh-HP7-12菌株具有很强耐盐能力，在液体培养和固体培养基上的耐盐浓度达到14％。
2、菌株对病原菌的抑制能力
(1)采用平板对峙法将筛选得到的Bh-HP7-12菌株进行其对多种植物病原菌的拮抗作用探究，将在PDA培养基上培养3～5d的作物枯萎病病原菌尖孢镰刀菌、小麦茎基腐病病原菌、小麦根腐病病原菌、小麦纹枯病病原菌、小麦全蚀病病原菌、番茄叶霉病病原菌、辣椒疫病病原菌、辣椒炭疽病病原菌、芹菜早疫病病原菌等多种植物病原真菌的菌饼(直径5mm)置于PDK培养基中央，然后距离菌饼25mm处接种Bh-HP7-12菌株，在28℃条件下培养5～7d后观察抑菌带形成情况；将在TSB培养基上培养16～24h的番茄青枯病菌0.1mL均匀涂抹在TSA培养基平板上，然后在其中央接种Bh-HP7-12菌株，在28℃条件下培养24～48h后观察透明圈形成情况。结果如图4和图5所示。
从图4和图5中可以看出：Bh-HP7-12菌株抑菌谱比较宽，能够抑制引起苦瓜、西瓜、番茄以及黄瓜等作物枯萎病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、引起小麦茎基腐病的禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌、引起小麦根腐病的麦根腐旋孢腔菌、引起小麦纹枯病的禾谷丝核菌、引起小麦全蚀病的顶囊壳菌、引起番茄叶霉病的褐孢霉菌、引起疫病的疫霉菌、引起灰霉病的灰葡萄孢菌、引起炭疽病的炭疽菌、引起芹菜早疫病的尾孢菌、引起青枯病的拉尔氏菌等多种植物病原菌；其中对尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌等镰刀菌属的抑制效果显著。尤其是图4中显示Bh-HP7-12菌株能强烈抑制尖孢镰刀菌的菌丝生长。
(2)分别采用摇床振荡培养方法和悬滴法测定Bh-HP7-12菌株对尖孢镰刀黄瓜枯萎病菌的分生孢子形成和分生孢子萌发的影响，以无菌水做对照。结果如图6所示。
从图4和图6中可以明显看出：Bh-HP7-12菌株能强烈抑制枯萎病菌(尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum)的菌丝生长(图4)，抑制分生孢子形成(图6左图)和孢子萌发(图6右图)。
3、菌株的性能测定
分解蛋白性能测定方法：采用平板透明圈法。将Bh-HP7-12菌株接于蛋白鉴别培养基(酪蛋白3.0，牛肉浸粉5.0，氯化钠2.0，磷酸氢二钾0.05，琼脂18g，蒸馏水1000mL)上，置于28℃恒温培养箱中培养3d后，观察透明圈的有无，若有透明圈则表示分解蛋白。结果如图7所示。
分解淀粉性能测定方法：采用平板透明圈法。将Bh-HP7-12菌株接于鉴别培养基(可溶性淀粉1g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，牛肉膏5g,，琼脂18g，蒸馏水1000mL)上，于28℃恒温培养箱中培养3d后，观察透明圈的有无，若有透明圈则表示分解淀粉。结果如图7所示。
分解纤维素性能测定方法：采用透明圈法。将Bh-HP7-12菌株接于羧甲基纤维素钠培养基(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，磷酸氢二钠1g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL)上，置于28℃恒温培养箱中培养3d后，用1mg/mL的刚果红染色1h后，用1mol/L的氯化钠溶液漂洗两次，观察透明圈的有无，若有透明圈则表示分解纤维素。结果如图7所示。
分解无机磷性能测定方法：采用溶磷圈法。将Bh-HP7-12菌株接种在PKO无机培养基(葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O0.03g、FeSO4·7H2O 0.003g、MnSO4·4H2O 0.03g、酵母膏0.4g、琼脂18g、蒸馏水1000ml、pH 7.0)上，置于28℃恒温培养箱中培养3d后，观察溶磷圈的大小。结果如图7所示。
产嗜铁素性能测定方法：采用Schwyn(1987)等方法，采用透明圈法。将Bh-HP7-12菌株接于铬奥醇CAS培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养3～5d后，观察透明圈的有无，若有透明圈则表示产嗜铁素。结果如图7所示。
产吲哚乙酸性能测定方法：采用
Figure BDA0004030187100000081
等(2011)法测定产吲哚乙酸的能力。将Bh-HP7-12菌株接种到添加终浓度为100mg/L色氨酸的LB培养液，在28℃，160rpm培养48～72h后，10000rpm离心5min，取上清液2mL加入4mL Salkawski显色剂(50mL，35％高氯酸，1mL0.5M氯化铁)，暗处反应15～30min后观察颜色变化。结果如图7所示。
从图7中可以看出：Bh-HP7-12在蛋白、淀粉、纤维素、产嗜铁素鉴别培养基上均产生透明圈，在含色氨酸的培养液中显粉红色，所以，该Bh-HP7-12菌株能够分解蛋白、分解淀粉、分解纤维素、分解无机磷、产嗜铁素、产吲哚乙酸等。
实施例2菌液及应用
本实施例提供一种耐盐芽孢杆菌菌液，它是由实施例1提供的耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌体均匀分散在含有硫酸镁的缓冲溶液中形成的。本实施例中，在所述耐盐芽孢杆菌菌液中的Bh-HP7-12菌株的浓度为1×108CFU/mL；以100质量份计，所述含硫酸镁缓冲溶液包括以下质量份的组分：硝酸钾0.1份、氯化钠0.05份、磷酸氢二钾0.75份、磷酸二氢钾0.2份、硫酸镁0.03份、蔗糖1份、余量为无菌水。
本实施例还提供一种上述耐盐芽孢杆菌菌液的应用，利用上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌液浸泡黄瓜、番茄、辣椒等蔬菜的种子。
实施例3
本实施例提供一种耐盐芽孢杆菌菌液，其与实施例2提供的耐盐芽孢杆菌菌液基本相同，主要不同之处在于：本实施例中Bh-HP7-12菌株的浓度为3×108CFU/mL；以100质量份计，所述含硫酸镁缓冲溶液包括以下质量份的组分：硝酸钾0.2份、氯化钠0.05份、磷酸氢二钾0.55份、磷酸二氢钾0.3份、硫酸镁0.05份、蔗糖0.8份、余量为无菌水。
本实施例还提供一种促进蔬菜植株生长的方法，包括：
向所述黄瓜、辣椒或番茄等蔬菜植株的根部施用上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌液。具体地，在黄瓜、辣椒或番茄等蔬菜植株幼苗在移栽前进行根部浸泡处理或在移栽后20d之内进行灌根处理。
实施例4
本实施例提供一种耐盐芽孢杆菌菌液，其与实施例2提供的耐盐芽孢杆菌菌液基本相同，主要不同之处在于：本实施例中Bh-HP7-12菌株的浓度为5×108CFU/mL；以100质量份计，所述含硫酸镁缓冲溶液包括以下质量份的组分：硝酸钾0.2份、氯化钠0.04份、磷酸氢二钾0.7份、磷酸二氢钾0.3份、硫酸镁0.04份、蔗糖1.4份、余量为无菌水。
本实施例还提供一种促进蔬菜植株生长的方法，包括：将上述耐盐芽孢杆菌Bh-HP7-12菌液与黄瓜、辣椒或番茄等蔬菜育苗基质均匀混合形成微生物育苗基质，将蔬菜种子或植株种植于所述微生物育苗基质中。本实施例中，所述蔬菜育苗基质和上述耐盐芽孢杆菌菌液的质量比为14:1形成微生物育苗基质，且所述蔬菜育苗基质由草炭土2份、蛭石1份、珍珠岩1份和营养液0.5份组成。
效果试验1
本试验通过盆栽试验测定实施例3提供的Bh-HP7-12菌液(3×108CFU/mL)在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度和对黄瓜枯萎病的防治效果。试验设四个处理。
处理一(control)：为对照试验，黄瓜苗移栽后利用无菌硫酸镁缓冲溶液进行灌注处理；
处理二(Bh-HP7-12)：黄瓜苗移栽后利用Bh-HP7-12菌液进行灌注处理；
处理三(FOC)：黄瓜苗移栽后先接种活菌量为1×107孢子/mL的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，再用无菌硫酸镁缓冲溶液进行灌注处理；
处理四(FOC+Bh-HP7-12)：黄瓜苗移栽后先接种活菌量为1×107孢子/mL的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，再用Bh-HP7-12菌液进行灌注处理。
黄瓜苗经上述四个处理后按照常规的栽培管理方法在育苗室培育21天后调查Bh-HP7-12在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度，以及黄瓜枯萎病发病程度，结果如图8和图9所示。
其中，1)定殖密度测定采用稀释涂布平板法，取黄瓜根系，在流水中清洗，剪取1g，研磨后用无菌水稀释，测根系定殖密度；取根际土壤1g用无菌水稀释，测根际土壤定殖密度。将根系和根际土壤稀释液分别涂布在含利福平的TSA培养基平板上，置于28℃恒温箱培养48～72h，待形成菌落，测定菌落数并换算定殖密度，结果如图8所示。
2)枯萎病的病情调查分级标准为：
0级：无症状；
1级：子叶黄化，少于1/4真叶萎蔫；
2级：子叶萎蔫，多于1/4，少于2/4真叶萎蔫；
3级：子叶萎蔫，多于2/4真叶萎蔫并植株矮化；
4级：全株枯死。
病情指数和防治效果计算公式：
病情指数＝〔Σ(各级株数×各级代表值)/(调查总数×最高级代表值)〕×100；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。
从图8中可以看出：Bh-HP7-12菌株在盆栽黄瓜根系和根际土壤均具有良好的定殖能力，尤其是在枯萎病菌胁迫下定殖密度增多，并显著降低枯萎病菌的危害。从图9中可以看出：经Bh-HP7-12菌液处理后的黄瓜对枯萎病具有显著的防治效果。
效果试验2
本试验通过盆栽试验测定实施例3提供的Bh-HP7-12菌液(3×108CFU/mL)在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度和对黄瓜盐胁迫的缓解效果。试验设四个处理。
处理一(control)：为对照试验，黄瓜苗移栽后利用无菌硫酸镁缓冲溶液进行灌注处理；
处理二(Bh-HP7-12)：黄瓜苗移栽后利用Bh-HP7-12菌液进行灌注处理；
处理三(NaCl)：黄瓜苗移栽后处理150mmol浓度的NaCl溶液处理，然后再用无菌硫酸镁缓冲溶液进行灌注处理；
处理四(NaCl+Bh-HP7-12)：黄瓜苗移栽后处理150mmol浓度的NaCl溶液，然后再用Bh-HP7-12菌液进行灌注处理。
黄瓜苗经上述四个处理后按照常规的栽培管理方法在育苗室培育21天后，调查黄瓜生育情况和盐胁迫程度及Bh-HP7-12在黄瓜根系和根际土壤的定殖密度，结果如图10～12所示。
其中，盐胁迫指数及缓解效果计算公式：
盐胁迫指数＝〔Σ(各级株数×各级代表值)/(调查总数×最高级代表值)〕×100；
缓解效果(％)＝(对照胁迫指数-处理胁迫指数)/对照胁迫指数×100。
从图10中可以看出：Bh-HP7-12菌株在黄瓜根系和根际土壤具有良好的定殖能力，尤其是在盐胁迫条件下定殖密度增多，并显著降低黄瓜的盐胁迫危害。从图11和图12中可以看出：经Bh-HP7-12菌液处理后的黄瓜对盐胁迫具有显著的缓解效果。
效果试验3
本试验在室内通过种子发芽试验测定实施例2提供的Bh-HP7-12菌液(1×108CFU/mL)的种子浸泡处理对种子萌发和盐胁迫的缓解效果。试验设四个处理。
处理一(control)：用无菌硫酸镁缓冲溶液进行黄瓜种子浸泡处理，然后用无菌水进行保湿；
处理二(Bh-HP7-12)：用Bh-HP7-12菌液进行黄瓜种子浸泡处理，然后用无菌水进行保湿；
处理三(NaCl)：用无菌硫酸镁缓冲溶液进行黄瓜种子浸泡处理，然后用150mmol浓度的NaCl溶液进行保湿；
处理四(NaCl+Bh-HP7-12)：用Bh-HP7-12菌液进行黄瓜种子浸泡处理，然后用150mmol浓度的NaCl溶液进行保湿。
黄瓜种子经过上述四个处理后在28℃恒温箱中，保湿培养72h后调查发芽情况及芽长，结果如图13所示。
从图13中可以看出：Bh-HP7-12菌液处理能促进黄瓜种子发芽，促进芽长；在用NaCl溶液保湿条件下也能促进种子发芽，促进芽长。同时还可以看出：经Bh-HP7-12菌液处理后的黄瓜种子对盐胁迫具有明显的缓解效果。
效果试验4
本试验通过穴盘育苗试验测定实施例4提供的Bh-HP7-12菌液(5×108CFU/mL)与蔬菜育苗基质混合获得的微生物育苗基质对黄瓜幼苗的促生效果。试验设2个处理。
处理一(control)：为对照，实施例4提供的蔬菜育苗基质；
处理二(Bh-HP7-12)：实施例4提供的微生物育苗基质，其中的Bh-HP7-12菌液与蔬菜育苗基质质量比1:14。
将黄瓜种子分别播种在上述两种育苗基质中，然后在25℃～28℃自然光周期的温室内培育20d，得到两种黄瓜苗；在此期间，测定黄瓜出苗、苗期生长状况、黄瓜苗叶绿素含量、根系活力等，并在人工接种条件下测定黄瓜苗对枯萎病和盐复合胁迫的抗性程度，结果如表3～6和图14所示。
黄瓜苗对枯萎病和盐复合胁迫的抗性试验：将黄瓜苗移栽至花盆，然后接种黄瓜枯萎病菌(107孢子/mL，50mL/株)和盐溶液(150mmol浓度的NaCl溶液50mL/株)，培育14d后调查胁迫程度。
其中，枯萎病和盐复合胁迫调查分级标准：0级：无症状；1级：子叶黄化，叶缘黄化，叶片不萎蔫或少于1/4叶片恢复性萎蔫；2级：子叶萎蔫，多于1/4，少于2/4叶片萎蔫黄化；3级：子叶萎蔫或脱落，多于2/4叶片萎蔫黄化；4级：所有叶片萎蔫黄化，植株濒临死亡。
复合胁迫指数及缓解效果计算公式：
复合胁迫指数＝〔Σ(各级株数×各级代表值)/(调查总数×最高级代表值)〕×100；
缓解效果(％)＝(对照胁迫指数-处理胁迫指数)/对照胁迫指数×100。
表3两种育苗基质对黄瓜出苗的影响
处理 出苗率(％) 出苗势(％)
处理一 100.00±0.00a 56.73±0.67b
处理二 100.00±0.00a 60.33±0.35a
从表3中可以看出：就黄瓜出苗率而言，在上述两个处理采用的育苗基质中没有差异，均是100％；而在Bh-HP7-12育苗基质上出苗比较整齐，出苗势要高于常用育苗基质。
表4两种育苗基质对黄瓜地上部生长和叶绿素含量的影响
处理 株高(cm) 茎粗(mm) 鲜重(g/株) 干重(g/株) 叶绿素含量(mg/g)
处理一 8.27±0.03b 3.54±0.05b 3.03±0.05b 0.18±0.00b 18.40±0.15b
处理二 8.90±0.15a 3.70±0.04a 3.54±0.09a 0.21±0.00a 32.20±1.46a
从表4中可以看出，利用本发明实施例4提供的微生物育苗基质的处理二培育的黄瓜苗的株高、茎粗、地上部鲜重、地上部干重都明显高于采用常用的蔬菜育苗基质的处理一培育的黄瓜苗；同时利用处理二培育的黄瓜苗叶绿素含量显著高于处理一的。由此可见，利用本发明实施例提供的微生物育苗基质能够显著促进黄瓜苗生长，提高叶绿素含量。
表5两种育苗基质对黄瓜根系生长和根系活力的影响
处理 根鲜重(g/株) 根干重(g/株) 根系活力(mg/g·h)
处理一 0.30±0.03a 0.01±0.00a 0.232±0.02b
处理二 0.30±0.01a 0.01±0.00a 0.252±0.01a
从表5可以看出，利用处理一和处理二两种育苗基质培育的黄瓜苗根系生长没有差异，而利用处理二的微生物育苗基质培育的黄瓜苗根系活力高于处理一的常用蔬菜育苗基质培育的黄瓜苗的根系活力。
表6利用两种育苗基质培育的黄瓜苗对枯萎病和盐复合胁迫的抗性
处理 胁迫指数 缓解效果(％)
处理一 61.11±1.39a --
处理二 20.83±0.00b 65.91
从表6和图14可以看出：处理二利用本发明实施例4提供的微生物育苗基质培育的黄瓜苗对枯萎病和盐复合胁迫的缓解效果明显高于处理一利用常用蔬菜育苗基质培育的黄瓜苗。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一株耐盐芽孢杆菌，其特征在于，它为耐盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans Bh-HP7-12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21697。
2.一种耐盐芽孢杆菌菌液，其特征在于：它包括权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌和含硫酸镁缓冲液。
3.根据权利要求2所述的耐盐芽孢杆菌菌液，其特征在于：所述耐盐芽孢杆菌的浓度为（1～5）×108 CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的耐盐芽孢杆菌菌液，其特征在于：以100质量份计，所述含硫酸镁缓冲溶液包括以下质量份的组分：硝酸钾0.1～0.2份、氯化钠0.02～0.1份、磷酸氢二钾0.5～0.9份、磷酸二氢钾 0.1～0.3份、硫酸镁 0.01～0.05份、蔗糖 0.5～1.5份、余量为无菌水。
5.一种权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌或权利要求2～4任一项所述的耐盐芽孢杆菌菌液在促进蔬菜植株幼苗生长和定殖中的作用。
6.一种促进蔬菜植株生长的方法，包括：
向所述蔬菜的植株或种子施用权利要求1所述的耐盐芽孢杆菌或权利要求2～4任一项所述的耐盐芽孢杆菌菌液，其中，所述蔬菜为黄瓜、辣椒或番茄，所述耐盐芽孢杆菌的总活菌数不小于1×108 CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述施用为施用于所述蔬菜植株的根际。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述施用为播种前利用所述耐盐芽孢杆菌或其菌液浸泡所述蔬菜种子。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述施用为施用于所述蔬菜的育苗基质，将所述耐盐芽孢杆菌或其菌液与所述育苗基质均匀混合。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述育苗基质和所述耐盐芽孢杆菌菌液的质量比为（10～15）: 1。
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CN117903964A (zh) * 2023-11-29 2024-04-19 山东省农药科学研究院 一株耐盐芽孢杆菌147及其应用

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