CN108244140B - 一种液体发酵及配方剂型制备多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体发酵及配方剂型制备多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的方法，其所采用的多粘类芽孢杆菌发酵液，解决了传统液体发酵芽孢转化率低的问题，芽孢转化率超过98％；且本发明生产的多粘类芽孢杆菌发酵液为活性多粘芽孢菌体，抵御外界不良环境能力强，寿命长，因此可长时间储存，货架期长，发酵工艺适合于产业化生产；以及该多粘类芽孢杆菌母药与多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的生产配制方法，工艺简单，芽孢回收率达到98％以上，采用多种芽孢保护工艺，使产品货架期超过18个月，具有商业运用价值。

Description

一种液体发酵及配方剂型制备多粘类芽孢杆菌生物农药可湿 性粉剂的方法

技术领域

本发明涉及一种制备生物农药的方法，尤其涉及一种液体发酵及配方剂型制备多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的方法。

背景技术

植物病害是制约植物安全生长的主要障碍之一，目前防治方法主要是喷施化学药剂。蔬菜作物生长期短，频繁使用化学药剂存在农药残留的风险，研制和使用生物农药能减少化学药剂的使用量。对植物病原菌具有拮抗作用的微生物是研制生物农药的主要来源，这类微生物种类繁多、分布广泛，即使同一种微生物由于分布于不同地区，其拮抗作用强弱或机制也有一定差异。挖掘生防微生物资源，首先是用目标病菌广泛筛选拮抗菌，这是生物防治研究领域的基础工作。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)是芽孢杆菌科(Bacillaceae)类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的革兰氏阳性细菌，在划入类芽孢杆菌属(Paenibacillus)之前又称Bacilluspolymyxa。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的细胞呈杆状，(0.5-2.5)μmX(1.2～10.0)μm，G+C含量为40％～50％；利用周生鞭毛运动，在膨大孢子囊中产生椭圆型芽孢；最适生长pH为7，最适温度为28～30℃；兼性厌氧，分解葡萄糖和其他糖类产酸，有时产气，在营养琼脂上无可溶性色素，应用前景广阔。

传统农业中化学农药的过量使用不仅会增加农药残留量，同时导致了许多作物病虫害的抗药性，并对土壤、水体及生态环境造成污染。随着社会的进步，人们生活水平的提高，对食品安全的意识不断加强，在这种情况下应用高效、广谱、安全、无毒的有益微生物进行植物疫病的防治越来越受到人们的重视。多粘类芽孢杆菌产生的多肽类抗菌物质对植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性质比较稳定，可用于多种植物病害的生物防治。因此，多粘类芽孢杆菌是一类极具开发前景和应用价值的生防细菌。

目前国内对多粘类芽孢杆菌的研究主要集中在菌种的筛选、分离鉴定、抑菌效果以及对发酵液化学成分的分析，而对于多粘类芽孢杆菌的发酵培养方面还罕见报道。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种液体发酵及配方剂型制备多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的方法。

本发明提供了一种液体发酵制备多粘芽孢杆菌生物农药的方法，相对于现有的液体发酵技术生产的多粘类芽孢杆菌制剂，本发明生产的多粘芽孢的活性孢子粉，产品货架期长而且工艺简单、设备投资小。

同时本发明提供了一种新的液体发酵培养液，解决了传统液体发酵芽孢转化率低的问题。该培养基包括了碳源、氮源、无机盐，其中所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、玉米淀粉中的一种或多种；所述氮源选自豆饼粉、大豆粉、棉籽饼粉、酵母膏中的一种或多种；所述无机盐包含磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙、氯化钠中的一种或多种。

此外，本发明还提供了一种采用上述方法制备的多粘芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种多粘类芽孢杆菌发酵液的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤11，将菌种接于培养基中，恒温培养；

步骤12，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到一级种子液；

步骤13，向发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤2中得到的种子液倒入到发酵罐中，加压通入无菌空气进行发酵，得多粘类芽孢杆菌发酵液。

进一步地，在所述的多粘类芽孢杆菌发酵液的制备方法中，按重量百分比计，所述步骤12和步骤13中培养液由以下组分配制而成：

进一步优选地，在所述的多粘类芽孢杆菌发酵液的制备方法中，按重量百分比计，所述步骤12和步骤13中培养液由以下组分配制而成：

进一步地，所述菌种为是多粘类芽孢杆菌P1，分类命名为：多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，其已于2017年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13554。

进一步地，步骤11中采用的“培养基”和步骤12、13中采用的“培养液”，在没有特别说明的情况下，本领域技术人员可根据不同菌种采用现有技术进行选择和配制。

进一步优选地，所述的多粘类芽孢杆菌发酵液的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤11，将菌种接于培养基中，恒温培养；

步骤12，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到一级种子液；

步骤13，配制所述培养液并投入中级发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至35～37℃，倒入步骤2得到的一级种子液，35～37℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/h空气流量和150～180rpm转速下进行发酵，得多粘类芽孢杆菌发酵液。

进一步优选地，所述中级发酵罐指的是大于1L而小于1吨规格的发酵罐，所述规格为本技术领域公知常识。

进一步较为优选地，步骤13中，中级发酵罐发酵方法为：55L培养液投入75L规格的发酵罐中，高温高压灭菌；发酵罐保持正压，冷却至37℃，倒入步骤2得到的一级种子液，35～37℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/h空气流量和150～180rpm转速下进行发酵，获得多粘芽孢菌体。

进一步优选地，所述高温高压灭菌优选为121℃温度、15磅压力下灭菌25分钟。

进一步优选地，在所述高温高压灭菌前，向所述发酵罐内投入消泡剂；如，在所述75L规格发酵罐中消泡剂加入体积优选为50ml。

本发明的第二个方法还提供了一种多粘类芽孢杆菌生物农药母药的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤21，采用如上述方法制得的多粘类芽孢杆菌发酵液和絮凝剂、干燥保护剂、分散载体混合，得到含固量5-20％的固液混合物；

步骤22，将固液混合物在0.05-0.3Mpa压力下经过板框压滤得到含有多粘芽孢杆菌的滤饼；

步骤23，将滤饼在80-150℃进风温度、引风机风量1000-30000立方每小时、每小时3Kg-300Kg的进料速度下，经过闪蒸干燥，制得多粘类芽孢杆菌母药。

进一步地，述步骤21中，固液混合物各组分质量百分比为：多粘类芽孢杆菌发酵液82-95.5％，絮凝剂1-5％；干燥保护剂0.5-3％；分散载体3-10％。

进一步地，所述步骤21中，所述絮凝剂选自氯化铁、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、壳聚糖、豆浆中的一种或多种，优为两种混合使用。

进一步地，所述步骤21中，所述干燥保护剂选自蔗糖，麦芽糊精、海藻糖、甘油、脱脂奶粉中的一种或几种混合。

进一步地，所述步骤21中，所述分散载体选自白炭黑、硅藻土、轻质碳酸钙、蛭石粉、玉米淀粉、珍珠岩粉中的一种或几种。

进一步优选地，所述硅藻土颗粒大小优选为700目，所述硅藻土与所述多粘类芽孢杆菌发酵液体积比优选为1:1。

进一步优选地，所述步骤22中过滤采用板框压滤机过滤分离。

进一步优选地，所述步骤23中闪蒸干燥的进口温度为65-100℃，出口温度为40-60℃。

进一步地，所述步骤23制得的多粘类芽孢杆菌母药中芽孢含量为50亿-200亿cfu/g，水活度为0.7-0.8。

本发明的第三个方面是提供一种多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的制备方法，具体包括如下步骤：采用上述方法制得的多粘类芽孢杆菌母药和助悬剂、紫外保护剂、润湿剂、分散剂、保湿剂、载体按照以下质量百分比混合而得：

进一步地，所述助悬剂选自硅酸镁铝、黄原胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、卡波姆中的一种或多种；所述紫外保护剂为叶酸、脱脂奶粉、抗坏血酸中的一种或两种。

进一步地，所述润湿剂选自丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸盐、异丙基萘磺酸钠、烷基芳基磺酸钠等中的一种或多种。

进一步地，所述分散剂选自磷酸酯、磺酸盐类、烷基萘磺酸盐缩聚物、羧酸盐高分子、聚羧酸盐高分子改性树脂、烷基硫酸盐、改性烷基磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、萘磺酸盐(缩聚物)类、聚羧酸盐高分子分散剂、多苯乙烯苯醚磷酸酯分散剂、萘磺酸盐甲醛缩合物、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物磺酸盐、木质素磺酸盐(例如木质素磺酸钠SDS等)、马来酸-丙烯酸共聚物钠盐、烷基磺基琥珀酸盐等中的一种或是多种。

进一步地，所述保湿剂选自甘油、α-吡咯烷酮羧酸钠、三甲基甘氨酸、甲壳素、泛酰醇等中的一种或多种。

进一步地，所述载体选自膨润土、高岭土、滑石粉、碳酸钙、陶土、硅藻土、白炭黑、叶蜡石、凹凸棒土、碳酸氢钾、麦芽糊精等中的一种或多种。

本发明的第四个方面是提供一种采用上述方法制备的多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂。

本发明的第五个方面是提供一种如所述的多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂在植物病害防治中的应用。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供了一种液体发酵及配方剂型制备多粘类芽孢杆菌生物农药的方法，其所采用的多粘类芽孢杆菌发酵液，解决了传统液体发酵芽孢转化率低的问题，使用该方法每毫升发酵液芽孢产量在极短的时间内达到40亿芽孢个以上，且芽孢转化率超过98％；相对于液体发酵的现有技术生产的多粘芽孢菌体，本发明生产的多粘类芽孢杆菌发酵液为活性多粘芽孢菌体，抵御外界不良环境能力强，寿命长，因此可长时间储存，货架期长，发酵工艺适合于产业化生产；

此外，还提供了多粘类芽孢杆菌母药与多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的生产配制方法，其方法工艺简单，芽孢回收率达到98％以上，采用多种芽孢保护工艺，使产品货架期超过18个月，具有商业运用价值。

附图说明

图1为实施例1培养液优化前(基础培养基)的产孢情况；

图2为实施例1培养液优化后的产孢情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1培养液的优化

本实施例在基础培养基(蛋白胨：38.4g/L，淀粉：39g/L，七水硫酸镁：1.05g/L，磷酸氢二钾：1.7g/L，葡萄糖：10g/L)的基础上考察了几种常用碳、氮源和无机盐对多粘类芽孢杆菌产芽孢的影响。在培养液中使用不同碳源对多粘类芽孢杆菌的活菌数和芽孢量的影响见表1；在培养基中使用不同氮源对多粘类芽孢杆菌的活菌数和芽孢量的影响见表2。

表1不同碳源对多粘类芽孢杆菌活菌数及芽孢量的影响

表2不同氮源对多粘类芽孢杆菌活菌数及芽孢量的影响

由上述表1、表2可见，可溶性淀粉和蔗糖是较为合适的碳源，豆饼粉和棉籽饼粉是较为合适的氮源。在上述单因子试验之后，对碳源、氮源及无机盐的浓度作了进一步的筛选，得出较为合适的比例，即可溶性淀粉1％～3％；酵母提取物0.1％～0.5％；棉籽饼粉1～3％；磷酸氢二钾0.1～0.3％；硫酸镁0.02％-0.08％。用经过优化的培养液进行发酵，培养48小时，芽孢率能达到98％以上。

图1为培养液优化前(基础培养基)的产孢情况；

图2为培养液优化后的产孢情况；

注：图1和图2中，灰色杆状的为菌体，黑色的为芽孢。

实施例2多粘类芽孢杆菌发酵液的制备

在实施例1培养液的基础上进行以下操作：

多粘类芽孢杆菌无菌条件下接种于土豆汁培养基的平皿内，然后将平皿放入恒温培养箱中，在35～37℃培养3-5天。本实施例所采用的多粘类芽孢杆菌是多粘类芽孢杆菌P1，其已于2017年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13554。土豆汁的培养基组分如下:

将培养后的多粘类芽孢杆菌在无菌操作下转移到有300ml培养液的1L摇瓶中，将摇瓶放在摇床上，35～37℃、200rpm转速条件下培养2天，培养结束后得到一级种子液。所述培养液主要组分如下(根据实施例1的结果)：

配制相同的培养液，将培养液投入到发酵罐中，并加入消泡剂，然后进行高温(121℃)高压(15磅)灭菌，灭菌时间25分钟。发酵罐保持正压，待冷却到28℃时降低空气流量，在火焰口倒入得到的一级种子液，35～37℃、0.4～0.5kg压力、1500～1800L/h空气流量和150～180rpm转速下进行发酵，获得多粘类芽孢杆菌发酵液。

实施例3多粘类芽孢杆菌生物农药母药与多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的制备

将实施例2制得的多粘类芽孢杆菌发酵液500L与10Kg海藻酸钠、10Kg壳聚糖、10Kg蔗糖、20Kg甘油、10Kg白炭黑、30Kg硅藻土充分混合固液混合物；

固液混合物在0.2Mpa压力下经过板框压滤得到含有多粘芽孢杆菌的滤饼；

滤饼在进风温度120℃、引风机风量8000m³/小时、进料速度25Kg/小时的条件下，经过闪蒸干燥，得到多粘类芽孢杆菌生物农药母药。在该多粘类芽孢杆菌生物农药母药中芽孢含量为200亿cfu/g，含水量15％。

将20Kg上述制得的多粘类芽孢杆菌生物农药母药与增悬剂、紫外保护剂、润湿剂、分散剂按照以下质量百分比投入锥形混匀器：

经过锥形混匀器充分混合30min后，得到多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂，检测检结果如表3。

表3多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂控制项目指标

注：在无特殊说明情况下，本发明计量单位wt％均指的是质量百分含量。

实施例4多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂对草莓苗期炭疽病的田间防治试验

按实施例3配制的多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂进行草莓苗期炭疽病的防治试验。试验设在金山草莓种植园区，试验时间为2016年6月-8月。试验设置150g/亩、300g/亩、600g/亩，共三个剂量，以常规处理—多种化学农药(吡唑醚菌酯、咪鲜胺、噁唑菌酮·硅唑)交替喷施及清水处理作为对照，试验小区设在8m*60m的大棚内，大棚内有4条垄，每垄约100棵草莓苗。每条垄分5个小区，共试验3条垄，每条垄为一个试验重复，共3个重复。施药时间分别为：6月24日，7月05日，7月14日，7月30日，共施4次。施药前各处理的田间管理等基本一致。6月24日第一次施药进行一次病指统计，7月21日、8月5日进行第二、三次药后病指统计，每小区随机统计20株草莓苗，分别调查叶片、叶柄和匍匐茎发病情况，记载病害级数，计算病情指数。

(病情分级标准：0级，无病斑；l级，病斑占整个器官(叶片、叶柄、葡匐茎)面积的5％以下；3级，病斑占整个器官面积的6％～10％；5级，病斑占整个器官面积的11％～25％；7级，病斑占整个器官面积的26％～50％；9级，病斑占整个器官面积的50％以上。)表4为最后一次(8月5日)病指调查的数据。

表4：多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂防治草莓炭疽病试验结果

处理	病指	防效(％)
			150克/亩多粘类芽孢杆菌WP	36.11b	47.86b
300克/亩多粘类芽孢杆菌WP	17.59a	74.60a
			600克/亩多粘类芽孢杆菌WP	23.52a	66.04a
化学处理	35.18b	49.20b
			空白处理	69.26c	/

注：表5中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P≦0.05，邓肯新复极差法)

实施例4的结果表明：多粘类芽孢杆菌WP300克/亩和600克/亩处理的防效无显著性差异，但是均显著性的高于150克/亩处理以及化药处理的防效，300克/亩的处理为防治设施大棚草莓炭疽病的最佳浓度。

实施例5多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯早疫病的田间防治试验

按实施例3配制多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂，进行马铃薯早疫病的田间防治试验。试验设在马铃薯早疫病连年发生的孙桥农业园06号蔬菜大棚内，试验时间为2017年3月-5月。试验设置125g/亩、250g/亩、500g/亩，共三个剂量，以25％嘧菌酯悬浮剂和清水处理作为对照，每个处理设三个重复，共15个小区，每个小区面积为10m2。第一次施药：4月11日；第二次施药：4月27日；第三次施药：5月4日；于末次药后10天进行早疫病病情指数调查。(分级标准为0级：无病；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；3级：病斑面积占整个叶面积的6-10％；5级：病斑面积占整个叶面积的11-25％；7级：病斑面积占整个叶面积的25-50％；9级：病斑面积占整个叶面积的50％以上)，试验结果见表5。

表5多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂防治马铃薯早疫病试验结果

处理	病指	防效
			125克/亩多粘类芽孢杆菌WP	17.1ab	64.55％a
250克/亩多粘类芽孢杆菌WP	8.4ab	82.54％a
			500克/亩多粘类芽孢杆菌WP	3.9a	89.40％a
25％嘧菌酯	36.6ab	16.34％b
			空白对照	43.8b	-

实施例5的结果表明：末次药后10天，多粘类芽孢杆菌3个处理的病情指数明显低于化学对照和空白对照，且在125克/亩的用量下即对马铃薯早疫病具有良好的防治效果。

综上，采用本发明所述培养液进行液体发酵，解决了传统液体发酵技术中难以生成芽孢的难题；而且本发明上述方法制备的产品均为活性芽孢粉粉，芽孢寿命长，抵御外界不良影响能力强，因此，本发明制备的产品质量稳定，储存时间长，货架期长。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种多粘类芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤11，将菌种接于培养基中，恒温培养；

步骤12，将培养后的菌种转移至培养液进行摇瓶培养，得到种子液；

步骤13，向发酵罐中投入培养液，高温高压灭菌，然后将步骤12中得到的种子液倒入到发酵罐中，加压通入无菌空气进行发酵，得多粘类芽孢杆菌发酵液；

按重量百分比计，所述步骤12和步骤13中培养液由以下组分配制而成：

2.一种多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用多粘类芽孢杆菌母药和助悬剂、紫外保护剂、润湿剂、分散剂、保湿剂、载体按照以下质量百分比混合而得：

所述多粘类芽孢杆菌母药的制备方法，包括如下步骤：

步骤21，采用如权利要求1制得的多粘类芽孢杆菌发酵液和絮凝剂、干燥保护剂、分散载体混合，得到含固量5-20％的固液混合物；

步骤22，将固液混合物在0.05-0.3Mpa压力下经过滤得到含有多粘芽孢杆菌的滤饼；

步骤23，将滤饼在80-150℃进风温度、引风机风量1000-30000立方每小时、每小时3Kg-300Kg的进料速度下，经过闪蒸干燥，制得多粘类芽孢杆菌母药；

所述步骤21中，固液混合物各组分质量百分比为：多粘类芽孢杆菌发酵液82-95.5％，絮凝剂1-5％；干燥保护剂0.5-3％；分散载体3-10％；

其中，所述步骤21中，絮凝剂选自氯化铁、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、壳聚糖、豆浆中的一种或多种；所述干燥保护剂选自蔗糖，麦芽糊精、海藻糖、甘油、脱脂奶粉中的一种或几种；所述分散载体选自白炭黑、硅藻土、轻质碳酸钙、蛭石粉、玉米淀粉、珍珠岩粉中的一种或几种；

其中，所述步骤23制得的多粘类芽孢杆菌母药中芽孢含量为50亿-200亿cfu/g，水活度为0.7-0.8。

3.根据权利要求2所述的多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，所述助悬剂选自硅酸镁铝、黄原胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、卡波姆中的一种或多种；所述紫外保护剂选自叶酸、脱脂奶粉、抗坏血酸中的一种或两种；所述润湿剂选自丁基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸盐、异丙基萘磺酸钠、烷基芳基磺酸钠等中的一种或多种；所述分散剂选自磷酸酯、磺酸盐类、烷基萘磺酸盐缩聚物、羧酸盐高分子、聚羧酸盐高分子改性树脂、烷基硫酸盐、改性烷基磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、萘磺酸盐缩聚物类、聚羧酸盐高分子分散剂、多苯乙烯苯醚磷酸酯分散剂、萘磺酸盐甲醛缩合物、烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物磺酸盐、木质素磺酸盐、马来酸-丙烯酸共聚物钠盐、烷基磺基琥珀酸盐等中的一种或多种；所述保湿剂选自甘油、α-吡咯烷酮羧酸钠、三甲基甘氨酸、甲壳素、泛酰醇等中的一种或多种；所述载体选自膨润土、高岭土、滑石粉、碳酸钙、陶土、硅藻土、白炭黑、叶蜡石、凹凸棒土、碳酸氢钾、麦芽糊精等中的一种或多种。

4.一种如权利要求2-3任一项所述方法制备的多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂。

5.一种如权利要求4所述的多粘类芽孢杆菌生物农药可湿性粉剂在草莓苗期炭疽病和马铃薯早疫病植物病害防治中的应用。

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