CN111286480B

CN111286480B - 一种复合微生物菌剂及其在防治多种植物病害中的应用

Info

Publication number: CN111286480B
Application number: CN202010257789.4A
Authority: CN
Inventors: 叶健; 姚香梅; 尹策策
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: CN111286480A

Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌剂及其在防治多种植物病害中的应用。所述复合微生物菌剂不仅对细菌、真菌和卵菌等引起的青枯病、根腐病、软腐病、黑胫病、赤霉病、根黑腐病等多种主要土传病害均有显著的抑制作用，同时对茄科作物番茄、十字花科作物快菜和葫芦科作物黄瓜的生物量均有显著地提高，而且对植物病毒病害番茄黄化曲叶病毒也具有显著的抑制作用。本发明有效解决了以往微生物菌剂仅针对单一病原菌的缺陷和化学农药防治带来的环境污染和食品质量问题，对绿色环保和农业可持续发展具有较好的应用前景。

Description

一种复合微生物菌剂及其在防治多种植物病害中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用，特别涉及一种复合微生物菌剂及其在防治多种植物病害中的应用。

背景技术

因有限的耕地资源和市场经济利益的驱动，连作和复种连作的面积日趋加大，加重了连作障碍。发生连作障碍的作物以茄科作物(辣椒、西红柿、烟草等)为主，瓜类、豆类、以根部入药的三七等药用植物均表现突出，连作障碍是一个复杂又难以解决的历史性问题，长期以来一直是国内外农业发展中亟需克服的重点和难点。烟草作为我国重要的经济作物，烟草种植的连作障碍是烟草生产的难题之一，连作障碍中的烟草青枯病和黑胫病是烟草生产上的主要根茎类病害，与叶部病害主要导致产量降低、品质下降不同，根茎类病害通常都是毁灭性病害。据国家烟草专卖局统计，上述2种病害年均给烟草生产造成的直接经济损失达到30亿元以上。并严重影响烤烟产量与质量的进一步提高，解决烟草连作障碍是烟草生产可持续发展的关键所在。

研究与开发生防制剂，利用生防细菌和PGPR细菌是一种比较有效的防治手段，通过空间位点竞争和营养的竞争，直接分泌胞外酶降解作用，产生抗生素抑制病原，诱导植物产生抗病性等机制，既可以减少化学农药使用带来的环境污染，提高农产品的价值，又可以改善土壤微生态环境，降低有害生物的种群数量，利于农作物的可持续生产，为我国无公害绿色生产提供有力保障。

利用有益微生物或其代谢产物保护烟草免受青枯病菌和黑胫病菌的侵染或切断其传播途径已经被证明具有良好的防治效果，如湖南农业大学肖启明教授团队开发的“XQ生防菌剂”对烟草青枯病防治效果在烟稻轮作区和旱地烟区均有显著效果。但是目前报道的菌剂往往只针对单一的病害，植物病害的发生往往是多种病原菌综合引起的，同时针对多种主要根茎类病害的生防菌剂仍然鲜见报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种复合微生物菌剂。

本发明提供的复合微生物菌剂的活性成分为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium、吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia、嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans和荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。

进一步的，每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.2×10¹⁰CFU所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.5×10⁹CFU所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.5×10¹⁰CFU所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有2.5×10¹¹CFU所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有2.0×10¹¹CFU所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.0×10⁹CFU所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。

更进一步的，所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia、所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans、所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的CFU比可为(10-15)：(1-2)：(10-20)：(200-300)：(150-250)：1；具体为12:1.5:15:250:200:1。

本发明的另一个目的是提供制备上述复合微生物菌剂的方法。

本发明提供的制备上述复合微生物菌剂的方法包括如下步骤：将苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂、吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂、嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂和水混匀，得到所述复合微生物菌剂。

进一步的，每克所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis；具体含有10¹⁰CFU苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis。

每克所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；具体含有10⁹CFU解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。

每克所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium；具体含有10¹⁰CFU巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。

每克所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia；具体含有10¹¹CFU吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia。

每克所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans；具体含有10¹¹CFU嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans。

每克所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens；具体含有10⁹CFU荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。

更进一步的，所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂、所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂、所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂、所述嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans菌剂、所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂和所述水的配比可为(1-1.5)g：(1-2)g：(1-2)g：(2-3)g：(1.5-2.5)g：(0.5-1.5)g：2L；具体为1.2g：1.5g：1.5g：2.5g：2.0g：1.0g：2L。

上述方法中，所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂、所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂、所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂和所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂的制备方法包括如下步骤：

a1)将苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis或解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens或巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium或吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia或嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans接种于LB液体培养基中培养，得到种子液；a2)将所述种子液接种于LB液体培养基中培养，离心，收集菌体沉淀；a3)用海藻糖水溶液重悬所述菌体沉淀，并将重悬后菌液置于培养皿平板里；a4)将培养皿平板盖用打孔器均匀的打孔后放置在超低温冰箱冷冻干燥至少3小时，得到冷冻菌剂；a5)将所述冷冻菌剂进行冻干浓缩，得到冻干菌剂，即得到所述苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis菌剂或所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂或所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂或所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂或所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂。

所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂的制备方法包括如下步骤：b1)将荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens接种于KB液体培养基中培养，得到种子液；b2)将所述种子液接种于KB液体培养基中培养，离心，收集菌体沉淀；b3)用海藻糖水溶液重悬所述菌体沉淀，并将重悬后菌液置于培养皿平板里；b4)将培养皿平板盖用打孔器均匀的打孔后放置在超低温冰箱冷冻干燥至少3小时，得到冷冻菌剂；b5)将所述冷冻菌剂进行冻干浓缩，得到冻干菌剂，即得到所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂。

进一步的，所述a1)或b1)中，所述培养条件为28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h。

所述a2)或b2)中，所述培养条件为28℃，200rpm条件下振荡培养24-48h。所述离心的条件为4000rpm离心20min。

所述a3)或b3)中，所述海藻糖溶液的浓度为2％。

更进一步的，所述LB液体培养基配方如下：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，dH₂O补足到1L，pH7.0。

所述KB液体培养基配方如下：蛋白胨20g，K₂HPO₄ 1.5g，甘油8mL，MgSO₄0.74g，dH₂O补足到1L，pH7.0。

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia、嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans和荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens在制备复合微生物菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述复合微生物菌剂或方法或应用中，所述苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis NMB1 CGMCC No.15434。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis NMB1 CGMCC No.15434的分类命名为Bacillusthuringiensis，该菌株已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NMB3 CGMCC No.15437。解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NMB3 CGMCC No.15437的分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，该菌株已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium为巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumNMB4 CGMCC No.15436。巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NMB4 CGMCC No.15436的分类命名为Bacillus megaterium，该菌株已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia为吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia XXB-24CGMCC No.17252。吡咯伯克霍尔德菌Burkholderiapyrrocinia XXB-24CGMCC No.17252的分类命名为Burkholderia pyrrocinia，该菌株已于2019年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans为嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans NMB17 CGMCC No.15435。嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivoransNMB17CGMCC No.15435已于2017年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分离与鉴定方法记载于申请号为201710480486.7的专利文件中。

所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens pf27 CGMCC No.14105。荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens pf27CGMCCNo.14105已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分离与鉴定方法记载于申请号为201810282989.8的专利文件中。

上述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis NMB1或解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NMB3或巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NMB4或吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia XXB-24也属于本发明的保护范围。

本发明还有一个目的是提供上述复合微生物菌剂或按照上述方法制备得到的复合微生物菌剂的新用途。

本发明提供了上述复合微生物菌剂或按照上述方法制备得到的复合微生物菌剂在如下(1)-(7)中任一种中的应用：

(1)防治植物土传病害；

(2)抑制土传病原菌生长；

(3)降低植物发病率；

(4)促进植物生长；

(5)提高植物产量；

(6)防治植物病毒病害；

(7)抑制病毒在植物体内积累。

本发明还有一个目的是提供一种产品；

所述产品的功能为如下(1)-(7)中任一种：

(1)防治植物土传病害；

(2)抑制土传病原菌生长；

(3)降低植物发病率；

(4)促进植物生长；

(5)提高植物产量；

(6)防治植物病毒病害；

(7)抑制病毒在植物体内积累。

本发明提供的产品的活性成分为上述复合微生物菌剂或按照上述方法制备得到的复合微生物菌剂。

进一步的，所述植物土传病害包括如下一种或两种或多种病害：青枯病、根腐病、软腐病、黑胫病、赤霉病、根黑腐病。

所述防治植物土传病害具体体现在降低土壤中青枯病和/或根腐病和/或软腐病和/或黑胫病和/或赤霉病和/或根黑腐病的病菌含量和/或降低植物发病率。

所述青枯病所用代表病菌为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。

所述根腐病所用代表病菌为镰刀菌(Fusarium)。

所述软腐病所用代表病菌为欧文氏菌(Erwina)。

所述黑胫病所用代表病菌为卵菌(Phytophthora)。

所述赤霉病所用代表病菌为赤霉菌(Gibberella)。

所述根黑腐病所用代表病菌为串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)。

所述发病率具体为青枯病发病率。

所述植物病毒病害具体可为番茄黄化曲叶病毒病；所述病毒具体可为番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)。

本发明最后一个目的是提供一种防治植物土传病害和/或降低植物发病率和/或促进植物生长和/或提高植物产量和/或防治植物病毒病害和/或抑制病毒在植物体内积累的方法。

本发明提供的防治植物土传病害和/或降低植物发病率和/或促进植物生长和/或提高植物产量和/或防治植物病毒病害和/或抑制病毒在植物体内积累的方法包括用上述复合微生物菌剂或按照上述方法制备得到的复合微生物菌剂处理植物的步骤。

进一步的，所述处理的方法可为在育苗期将上述复合微生物菌剂或按照上述方法制备得到的复合微生物菌剂均匀撒在植物的育苗盘中，或在植物幼苗移栽前用上述复合微生物菌剂或按照上述方法制备得到的复合微生物菌剂蘸根处理植物幼苗。

上述任一所述的应用或方法或产品中，所述植物可为茄科作物或十字花科作物或葫芦科作物。所述茄科作物包括烟草、番茄等作物；所述十字花科作物包括快菜等作物，所述葫芦科作物包括黄瓜等作物。

通过实验证明：本发明的复合微生物菌剂不仅对细菌、真菌和卵菌等引起的青枯病、根腐病、软腐病、黑胫病、赤霉病、根黑腐病等多种主要土传病害均有显著的抑制作用(抑制率高达45％～96％)；同时对茄科作物番茄、十字花科作物快菜和葫芦科作物黄瓜的生物量均有显著地提高(对番茄、快菜和黄瓜的生物量增加了2～6倍)，具有促进植物生长的作用，尤其能够促进茄科、十字花科和葫芦科农作物生长。而且对植物病毒病害番茄黄化曲叶病毒也具有显著的抑制作用(与对照组相比，处理组的病毒含量降低约2.5倍)。本发明的复合微生物菌剂不仅可以防治多种植物主要病害(包括主要的土传病害和植物病毒病害)，而且还能显著促进植物的生长，提高植物生物量。有效解决了以往微生物菌剂仅针对单一病原菌的缺陷和化学农药防治带来的环境污染和食品质量问题，对绿色环保和农业可持续发展具有较好的应用前景。

附图说明

图1为土壤中各病菌含量的定量PCR检测结果。图1A为茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)；图1B为镰刀菌(Fusarium)；图1C为串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)；图1D为欧文氏菌(Erwina)；图1E为卵菌(Phytophthora)；图1F为赤霉菌(Gibberella)。其中CK为对照组，Treatment(T)为复合菌剂处理组，*表示在0.05水平上差异显著，**表示在0.01水平上差异显著，***表示在0.001水平上差异显著，同下。

图2为大田烟草对照组和复合菌剂处理组烟草生长情况。图2A为幼苗期对照组的烟草生长情况；图2B为幼苗期复合菌剂处理组的烟草生长情况；图2C为烤烟期对照组的烟草生长情况；图2D为烤烟期复合菌剂处理组的烟草生长情况。

图3为复合微生物菌剂处理组和对照组番茄、快菜和黄瓜生长情况。图3A为番茄生物量统计；图3B为番茄生物量对照组和处理组对比图；图3C为快菜生物量统计；图3D为快菜生物量对照组和处理组对比图；图3E为黄瓜生物量统计；图3F为黄瓜生物量对照组和处理组对比图。其中control或CK为番茄、快菜和黄瓜种植后的对照组，Treatment为复合菌剂处理后番茄、快菜和黄瓜处理组。

图4为复合微生物菌剂处理组和对照组番茄双生病毒发病情况。图4A为对照组和处理组番茄接种TYLCV后发病症状图；图4B为对照组和处理组番茄植株中TYLCV的含量。其中CK为对照组，T为复合菌剂处理组。

保藏说明

菌种名称：巨大芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus megaterium

菌株编号：NMB4

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年03月08日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15436

菌种名称：苏云金芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus thuringiensis

菌株编号：NMB1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年03月08日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15434

菌种名称：解淀粉芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens

菌株编号：NMB3

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年03月08日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15437

菌种名称：吡咯伯克霍尔德菌

拉丁名：Burkholderia pyrrocinia

菌株编号：XXB-24

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年02月21日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17252

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的细菌分离培养基配方如下：

LB培养基(液体)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，水1L，pH7.0。

LB培养基(固体)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉12g，水1L，pH7.0。

PDA培养基(液体)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L。

PDA培养基(固体)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水1L。

KB培养基(液体)：蛋白胨20g，K₂HPO₄ 1.5g，甘油8mL，MgSO₄ 0.74g，dH₂O补足到1L，pH 7.0。

KB培养基(固体)：蛋白胨20g，K₂HPO₄ 1.5g，甘油8mL，MgSO₄ 0.74g，琼脂粉12g，dH₂O补足到1L，pH 7.0。

用于菌落总数测定的平板计数琼脂(PCA)培养基：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，dH₂O补足到1L，pH 7.0±0.2。

下述实施例中所用的荧光假单胞菌pf27菌株的保藏编号为CGMCC No.14105，已于2017年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分离与鉴定方法记载于申请号为201710480486.7的专利文件中。

下述实施例中所用的嗜油不动杆菌NMB17菌株的保藏编号为CGMCC No.15435，已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分离与鉴定方法记载于申请号为201810282989.8的专利文件中。

实施例1、NMB1、NMB3、NMB4、XXB-24菌株的分离、鉴定与保藏

(一)NMB1、NMB3、NMB4菌株的分离、鉴定与保藏

一、NMB1、NMB3、NMB4菌株的分离

NMB1、NMB3、NMB4菌株均分离自内蒙古自治区乌兰察布市甜菜连作地块甜菜根腐病发病严重的根际土壤。具体分离方法如下：将采自甜菜连作地块的根际土壤，挑取根系，刮取根际土，称量5g，无菌条件下放进已准备好的灭菌三角瓶中，用灭菌水梯度稀释到10^-6倍，设置3个重复。将梯度稀释的土壤样品取200μL分别涂到PDA培养基平板上，在28℃培养箱中培养，每天观察菌落的生长状态，结果显示稀释为10^-5、10^-6倍时平板上基本上没有菌落长出，而稀释为10^-4倍时，平板上能长出单一的菌落，并挑取在PDA培养基上长出单一的细菌和真菌菌落，将细菌和真菌分别在LB液体培养基和PDA液体培养基中进一步扩大培养，做进一步的菌株鉴定，将获得的细菌菌株分别命名为NMB1、NMB3和NMB4。

二、NMB1、NMB3、NMB4菌株的鉴定

1、形态鉴定

NMB1菌株的菌落形态圆润，表面湿润无粘液，菌落外沿稍有扩散而不很整齐。

NMB3菌株的菌落形态菌落为乳白色不透明，圆形质地皱纹状突起，菌落形状呈念珠状，菌落中间隆起，边缘整齐。

NMB4菌株的菌落形态为淡白色，圆形，扁平，湿润光滑，边缘模糊。

2、分子鉴定

提取NMB1、NMB3、NMB4菌株的基因组DNA，采用通用引物Eubac27F/Eubac1492R进行PCR扩增，得到含有NMB1、NMB3、NMB4菌株16S rDNA保守区的PCR产物。引物序列如下：

Eubac27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Eubac1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

将PCR产物经TA克隆连接到pEASY-T3(购买自北京全式金生物有限公司)，以通用引物M13F/M13R在英潍捷基公司测序。测序结果表明：NMB1、NMB3、NMB4菌株的16S rDNA保守区的核苷酸序列分别如序列1、序列2和序列3所示。将测序所得序列与NCBI数据库进行blast比对，发现NMB1、NMB3、NMB4菌株分别属于苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。

三、NMB1、NMB3、NMB4菌株的保藏

综合上述鉴定结果，确定NMB1菌株名称为苏云金芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus thuringiensis，该菌株已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15434。

综合上述鉴定结果，确定NMB3菌株名称为解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为Bacillus amyloliquefaciens，该菌株已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15437。

综合上述鉴定结果，确定NMB4菌株名称为巨大芽孢杆菌，其分类命名为Bacillusmegaterium，该菌株已于2018年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15436。

(二)XXB-24菌株的分离、鉴定与保藏

一、XXB-24菌株的分离

XXB-24菌株分离自湖南省湘西州花垣试验基地烟草连作地块烟草青枯病和黑胫病发病严重的根际土壤。分离的具体步骤同(一)中的步骤一，将获得的细菌菌株命名为XXB-24。

二、XXB-24菌株的鉴定

1、XXB-24菌株的形态鉴定

XXB-24菌株在LB培养基上培养24h～48h后可形成黄色菌落，菌落状态呈圆形，表面光滑有凸起边缘整齐，较粘稠，易挑起。

2、XXB-24菌株的分子鉴定

提取XXB-24菌株的DNA，采用通用引物Eubac27F/Eubac1492R进行PCR扩增，得到含有XXB-24菌株16S rDNA保守区的PCR产物。分子鉴定的具体步骤同(一)中的步骤二。测序结果表明：XXB-24菌株的16S rDNA保守区的核苷酸序列分别如序列4所示。将测序所得序列与NCBI数据库进行blast比对，发现XXB-24菌株属于吡咯伯克霍尔德菌Burkholderiapyrrocinia。

三、XXB-24菌株的保藏

综合上述鉴定结果，确定XXB-24菌株名称为吡咯伯克霍尔德菌，其分类命名为Burkholderia pyrrocinia，该菌株已于2019年02月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.17252。

实施例2、复合微生物菌剂的制备

1、种子液的制备

将实施例1获得的苏云金芽孢杆菌NMB1、解淀粉芽孢杆菌NMB3、巨大芽孢杆菌NMB4、吡咯伯克霍尔德菌XXB-24和嗜油不动杆菌NMB17以及荧光假单胞菌pf27分别接种于液体培养基(NMB1、NMB3、NMB4、XXB-24和NMB17菌株接种于LB液体培养基，pf27菌株接种于KB液体培养基)中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，分别制成NMB1种子液、NMB3种子液、NMB4种子液、XXB-24种子液、NMB17种子液和pf27种子液。

2、菌体沉淀的制备

将步骤1获得的NMB1种子液、NMB3种子液、NMB4种子液、XXB-24种子液、NMB17种子液和pf27种子液按照1:100比例分别加入到液体培养基(NMB1种子液、NMB3种子液、NMB4种子液、XXB-24种子液和NMB17种子液接种于LB液体培养基，pf27种子液接种于KB液体培养基)中，28℃，200rpm条件下振荡培养24-48h，然后4000rpm离心20min，弃上清液，分别收集菌体沉淀。

3、菌剂的制备

1)用经过滤灭菌可以保护细菌活性的浓度为2％海藻糖水溶液将步骤2获得的各菌体沉淀进行重悬，然后分别将各菌体重悬后菌液放置在直径为120mm的培养皿平板里，再将培养皿平板盖用打孔器均匀的打孔，确保在冷冻干燥过程中水分可以更好的挥发，最后放置在-80℃超低温冰箱冷冻干燥至少3小时以上，分别得到冷冻的菌剂。

2)在超低温的环境中，分别将冷冻的菌剂转移到预冷1小时以上的CHRIST真空冷冻离心浓缩仪上进行冻干浓缩，待菌液冻干成粉末状态时，分别得到冷冻干燥菌剂(冻干菌剂)，并将其收取到密封袋中，放置在4℃冰箱冷藏备用。

4、冻干菌剂的活菌菌落计数

分别取1mg步骤3中制备的NMB1、NMB3、NMB4、XXB-24、NMB17、pf27冻干菌剂，然后分别用1mL无菌水稀释，再分别进行10倍梯度稀释，最后分别取100μL10^-6的稀释液均匀涂布在菌落计数PCA琼脂平板上，28℃培养箱中培养48小时后进行活菌菌落计数。

结果表明：NMB1、NMB3、NMB4、XXB-24、NMB17和pf27冻干菌剂成品的有效活菌浓度均在1×10⁹-1×10¹¹CFU/g之间。其中，NMB1冻干菌剂有效活菌浓度为1×10¹⁰CFU/g，NMB3冻干菌剂有效活菌浓度为1×10⁹CFU/g，NMB4冻干菌剂有效活菌浓度为1×10¹⁰CFU/g，XXB-24冻干菌剂有效活菌浓度为1×10¹¹CFU/g，NMB17冻干菌剂有效活菌浓度为1×10¹¹CFU/g，pf27冻干菌剂有效活菌浓度为1×10⁹CFU/g。

5、复合微生物菌剂的制备

将步骤3获得的NMB1冻干菌剂1.2g、NMB3冻干菌剂1.5g、NMB4冻干菌剂1.5g、XXB-24冻干菌剂2.5g、NMB17冻干菌剂2.0g、pf27冻干菌剂1.0g和2L水混匀，即得到本发明的复合微生物菌剂，并将其命名为中科303。

实施例3、复合微生物菌剂的田间试验

一、田间试验方法

复合菌剂处理组(中科303)：在烟草幼苗移栽前，用2L实施例2制备的复合微生物菌剂对烟草幼苗进行蘸根处理，处理时间为30min，处理后进行移栽。

对照组(CK)：在烟草幼苗移栽前，用2L水对烟草幼苗进行蘸根处理，处理时间为30min，处理后进行移栽。

每个处理三个生物学重复，每个生物学重复移栽60棵烟草幼苗。在田间复合菌剂处理组和对照组的每个生物学重复间隔排列。

二、复合微生物菌剂中科303对烟草病情的抑制作用

1、田间病菌定量分析

分别取烤烟期的对照组和复合菌剂处理组的烟草根际微生物的土壤，利用试剂盒Power Soil DNAextraction kit(MoBio,Carlsbad,CA,USA)提取根际土壤的DNA。分析复合菌剂处理组和对照组的烟草根际土壤中主要土传病害的病菌含量。烟草主要土传病害及细菌16S定量和测序引物如表1所示。

表1、烟草主要土传病害及细菌16S定量和测序引物

土壤中各病菌含量的定量PCR检测结果如图1所示。结果表明：与对照组相比，复合菌剂处理组的烟草根际土壤中青枯病病菌、根腐病病菌、软腐病病菌、黑胫病病菌、赤霉病病菌和根黑腐病病菌含量均显著下降(图1)。复合菌剂处理后，青枯病病菌含量下降了约60％，根腐病病菌含量下降了约25％，软腐病病菌含量下降了约68％，黑胫病病菌含量下降了约5％，赤霉病病菌含量下降了约62％，根黑腐病病菌含量下降了约7％。说明此复合微生物菌剂可有效抑制土传病原菌生长，防治烟草土壤多种土传病害。

2、烟草发病率统计

分别对烤烟期的对照组和复合菌剂处理组的烟草青枯病发病率进行统计。按照烟草行业标准，青枯病发病等级分级标准如下：0级为全株无病症；1级为茎部偶有褪绿斑，或病侧二分之一以下叶片凋萎；3级为茎部有黑色条斑，但不超过茎高二分之一，或病侧二分之一至三分之二叶片凋萎；5级为茎部黑色条斑超过茎高二分之一，但未到茎顶部，或病侧三分之二以下叶片凋萎；7级为茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎，9级为病株基本枯死。将发病等级为1-9级的植株定义为青枯病发病植株，统计青枯病发病株数，并按照如下公式计算青枯病发病率：青枯病发病率＝(青枯病发病株数/调查总株数)×100％。

结果表明：复合菌剂处理组烟草的青枯病发病率仅为25％，而对照组烟草的青枯病发病率高达61.17％(表2)，相比对照组烟草的青枯病发病率，复合菌剂处理组烟草的青枯病发病率显著下降。说明复合微生物菌剂可降低烟草青枯病发病率，对植物土传病害有明显的抑制作用。

表2、青枯病发病率统计

	正常株数	死亡株数	发病率
				对照组	69	111	61.7％
复合菌剂处理组	135	45	25.0％

三、复合微生物菌剂中科303对烟草生长促生作用

观察幼苗期和烤烟期的对照组和复合菌剂处理组的烟草生长情况，统计对照组和复合菌剂处理组的烟草产量，并分析上等烟、中等烟和下低次烟的比例(烟草分级标准参考文献“闫克玉，赵献章。烟叶分级[M]。北京：中国农业出版社，2003:11-69”中的方法)。

结果表明：在幼苗期，复合菌剂处理组的烟草生长长势明显优于对照组的烟草(图2A和图2B)。对烟草的生长状况持续观察，当烟草生长到烤烟期时，复合菌剂处理组的烟草生长长势也显著优于对照组(图2C，图2D)。复合菌剂处理组的主要农艺性状包括株高、叶数，茎围以及上、中、下部叶片面积均优于对照组(表3)。产量统计结果表明：复合菌剂处理组的三个生物学重复的平均烟草产量结果达到94.68kg/亩，但是，对照组的平均烟草产量仅为88.89kg/亩(表4)。复合微生物菌剂对不同等级的烟叶质量也均有提高，亩收入约增值200元。说明复合微生物菌剂可促进烟草生长，增加烟草产量和收入。

表3、烟草种植区复合菌剂处理组和对照组的农艺性状比较

性状	对照组	复合菌剂处理组
			株高(cm)	98.67	101
叶数(片)	15.83	19
			茎围(cm)	8.38	8.9
下部叶片面积(cm<sup>2</sup>)	360.8	386.22
			中部叶片面积(cm<sup>2</sup>)	1332.64	1349.08
上部叶片面积(cm<sup>2</sup>)	563.54	591.94

表4、烟草种植区复合菌剂处理组和对照组的经济性状比较

项目	对照组	复合菌剂处理组
			亩产量(公斤/亩)	88.89	94.68
上等烟比例(％)	49.85	58.17
			中等烟比例(％)	27.78	39.39
下低次烟比例(％)	10.76	14.04
			均价(元/公斤)	23.96	24.45
亩产值(元/亩)	2129.80	2314.93

综合上述结果可以看出：本发明的复合微生物菌剂不仅对植物烟草的土传病害有明显的抑制效果，有效提高了烟草的抗病能力，而且对烟草的生长有明显的促生作用。对多种土传病害复合侵染的田块起到了很好的抗病增产效果。

实施例4、复合微生物菌剂中科303对其他作物的促生作用

一、实验方法

将中杂9号番茄种子(中蔬种业科技(北京)有限公司生产)、蔬菜品种四季快菜1号种子(国家蔬菜工程技术研发中心)、黄瓜科作物品种京新秋瓜种子(国家蔬菜工程技术研发中心)催芽。然后将催芽后种子均匀铺在灭菌的蛭石泥炭土基质(蛭石和泥炭土按照1:1的比例混匀，121℃高压灭菌20min)中，在26℃，12h:12h光照：黑暗条件下培养种子萌发，待种子萌发生长到两片真叶时，分别移栽到均匀添加复合微生物菌剂中科303(使用浓度为每kg蛭石泥炭土基质混合物添加50mL OD值为1的菌液，菌液使用终浓度在1×10⁶CFU/mL)和对照(不添加任何菌剂)的营养穴中，番茄、快菜和黄瓜苗移栽到育苗穴盘中(穴盘规格上口直径9厘米，下口直径6厘米，高度8厘米)，放置在温室中生长(条件：光照时间12h，温度26℃，相对湿度50％)。继续放置上述条件下培养，每个培养盆中移栽1株幼苗，每个处理27个重复。移栽40天后统计每株番茄、快菜和黄瓜的植株鲜重，并计算生物量增加。生物量增加(％)＝(处理组植株鲜重–对照组植株鲜重)/对照组植株鲜重×100％。

二、促生效果统计

结果如图3所示。复合微生物菌剂处理后对番茄(图3A)、快菜(图3C)和黄瓜(图3E)幼苗能够产生明显的促生效果，与对照组相比，复合微生物菌剂处理后番茄植株的生物量增加294.81％，快菜植株的生物量增加了142.22％，黄瓜植株的生物量增加了77.64％。

实施例5、复合微生物菌剂中科303对植物病毒病害的预防作用

供试番茄植株：实施例4中实验组番茄幼苗(复合微生物菌剂中科303处理)和对照组番茄幼苗(未经任何菌剂处理)。

一、实验方法

1、TYLCV病毒的接种

将番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)侵染性克隆农杆菌菌株接种5mL液体LB抗性培养基，28℃摇菌培养活化，OD600为1.0时4000rpm离心10min富集菌体后，将农杆菌均匀划线涂布在LB抗性平板上，28℃培养24h。接种的番茄幼苗株高为15-20cm，3-5片叶。接种时用无菌牙签刮取平板上菌落，在距番茄根部2-3cm处用牙签划破茎表皮，将含有TYLCV侵染性克隆的农杆菌涂抹接种在茎韧皮部破损处，破损伤口约1cm。接种后植株于16h光照/8h黑暗，25℃环境下培养观察取样。

2、TYLCV病毒的检测

接种20天后，用植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)提取接种植株的基因组DNA，用TYLCV特异引物通过PCR鉴定感病植株。同时以为未接种病毒植株作为阴性对照。TYLCV病毒检测的引物序列如表5所示。

表5、TYLCV病毒检测的引物

二、植物双生病毒防治效果统计

接种14天后，发现复合微生物菌剂处理的番茄的病症明显低于对照组，对照组的叶片颜色表现出更为明显的黄化，叶形也更加卷曲(图4A)。通过qRT-PCR方法检测实验组和对照组番茄叶片中的TYLCV的积累量，结果显示，在经过复合微生物菌剂处理的番茄叶片中TYLCV的积累量有了非常显著的下降(图4B)，约下降2.5倍，与叶片的症状程度相符。说明本发明的复合微生物菌剂可有效抑制病毒在感病植物中的积累。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种复合微生物菌剂及其在防治多种植物病害中的应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1436

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

ggggggctat aatgcaagtc gagcgatgga ttaagagctt gctcttatga agttagcggc 60

ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccataagact gggataactc cgggaaaccg 120

gggctaatac cggataacat tttgaactgc atggttcgaa attgaaaggc ggcttcggct 180

gtcacttatg gatggacccg cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240

caacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300

gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360

acgccgcgtg agtgatgaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag 420

tgctagttga ataagctggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggaattatt gggcgtaaag 540

cgcgcgcagg tggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggctcaaccg tggagggtca 600

ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggaaagtgga attccatgtg tagcggtgaa 660

atgcgtagag atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtaactgaca 720

ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780

acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt gctgaagtta acgcattaag 840

cactccgcct ggggagtacg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960

atcctctgaa aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac aggtggtgca 1020

tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080

tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200

caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc 1260

tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320

atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1380

gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta acctttatga gccagccgcc taagta 1436

<210>2

<211>1433

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

cggctataat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac 60

gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc 120

taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca 180

cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac 240

gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360

cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc 420

gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gtgtccggaa ttattgggcg taaagggctc 540

gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600

aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720

gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780

gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960

tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080

cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140

ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200

ggaagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260

tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320

catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380

tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag tga 1433

<210>3

<211>1400

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

ggcgaactga ttagaagctt gcttctatga cgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg 60

ggcaacctgc ctgtaagact gggataactt cgggaaaccg aagctaatac cggataggat 120

cttctccttc atgggagatg attgaaagat ggtttcggct atcacttaca gatgggcccg 180

cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgca tagccgacct 240

gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 300

gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 360

gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttagg gaagaacaag tacgagagta actgctcgta 420

ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480

gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa 540

gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 600

tgcagaagag aaaagcggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 660

caccagtggc gaaggcggct ttttggtctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 720

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 780

agggtttccg ccctttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 840

tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aactctagag 960

atagagcgtt ccccttcggg ggacagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca 1080

tttagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaaagg 1200

gctgcaagac cgcgaggtca agccaatccc ataaaaccat tctcagttcg gattgtaggc 1260

tgcaactcgc ctacatgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1380

gtcggtggag taaccgtaag 1400

<210>4

<211>1418

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

cttaccatgc agtcgaacgg cagcacgggt gcttgcacct ggtggcgagt ggcgaacggg 60

tgagtaatac atcggaacat gtcctgtagt gggggatagc ccggcgaaag ccggattaat 120

accgcatacg atctttggat gaaagcgggg gaccttcggg cctcgcgcta tagggttggc 180

cgatggctga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat cagtagctgg 240

tctgagagga cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300

gcagtgggga attttggaca atgggcgaaa gcctgatcca gcaatgccgc gtgtgtgaag 360

aaggccttcg ggttgtaaag cacttttgtc cggaaagaaa tccttggttc taatatagcc 420

gggggatgac ggtaccggaa gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480

tacgtagggt gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggtttgc 540

taagaccgat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg cattggtgac tggcaggcta 600

gagtatggca gaggggggta gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag agatgtggag 660

gaataccgat ggcgaaggca gccccctggg ccaatactga cgctcatgca cgaaagcgtg 720

gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactagttgt 780

tggggattca tttccttagt aacgtagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg 840

gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg 900

attaattcga tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catggtcgga atcctgctga 960

gaggtgggag tgctcgaaag agaaccggcg cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1020

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttgctacg 1080

caagagcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1140

tcctcatggc ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggaa cagagggttg 1200

ccaacccgcg agggggagct aatcccagaa aaccgatcgt agtccggatt gcactctgca 1260

actcgagtgc atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1320

gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggtttta ccagaagtgg 1380

ctagtctaac cgcaaggagg acggtcacca cgtagatc 1418

Claims

1.一种复合微生物菌剂，其活性成分为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia、嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans和荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens；

所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia、所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans、所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的CFU比为（10-15）：（1-2）：（10-20）：（200-300）：（150-250）：1；

所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis NMB1 CGMCC No.15434；

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens NMB3 CGMCC No.15437；

所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NMB4CGMCC No.15436；

所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia为吡咯伯克霍尔德菌BurkholderiapyrrociniaXXB-24 CGMCC No.17252；

所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans为嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans NMB17 CGMCC No. 15435；

所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens pf27 CGMCC No. 14105。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.2×10¹⁰CFU所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.5×10⁹CFU所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.5×10¹⁰CFU所述巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有2.5×10¹¹CFU所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有2.0×10¹¹CFU所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans；每2升所述复合微生物菌剂中至少含有1.0×10⁹CFU所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。

3.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：将苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂、吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂、嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂、荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens菌剂和水混匀，得到所述复合微生物菌剂；

所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens菌剂、所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂、所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂、所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂、所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂和所述水的配比为（1-1.5）g：（1-2）g：（1-2）g：（2-3）g：（1.5-2.5）g：（0.5-1.5）g：2L；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：每克所述苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis；

每克所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；

每克所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium；

每克所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia；

每克所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU所述嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans；

每克所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂中含有10⁹-10¹¹CFU所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens；

或，所述苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂、所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens菌剂、所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium菌剂、所述吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia菌剂、所述嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans菌剂、所述荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens菌剂和所述水的配比为1.2g：1.5g：1.5g：2.5g：2.0g：1.0g：2L。

5.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、吡咯伯克霍尔德菌Burkholderia pyrrocinia、嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans和荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens在制备复合微生物菌剂中的应用；

6.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂或按照权利要求3或4所述的方法制备得到的复合微生物菌剂在如下（1）-（7）中任一种中的应用：

（1）防治植物土传病害；

（2）抑制土传病原菌生长；

（3）降低植物发病率；

（4）促进植物生长；

（5）提高植物产量；

（6）防治植物病毒病害；

（7）抑制病毒在植物体内积累。

7.一种产品，其活性成分为权利要求1或2所述的复合微生物菌剂或按照权利要求3或4所述方法制备得到的复合微生物菌剂；

所述产品的功能为如下（1）-（7）中任一种：

（1）防治植物土传病害；

（2）抑制土传病原菌生长；

（3）降低植物发病率；

（4）促进植物生长；

（5）提高植物产量；

（6）防治植物病毒病害；

（7）抑制病毒在植物体内积累。

8.一种防治植物土传病害和/或降低植物发病率和/或促进植物生长和/或提高植物产量和/或防治植物病毒病害和/或抑制病毒在植物体内积累的方法，包括用权利要求1或2所述的复合微生物菌剂或按照权利要求3或4所述方法制备得到的复合微生物菌剂处理植物的步骤。