CN105483065A - 一种咯伯克霍尔德氏菌及其在促进连香树生长中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种吡咯伯克霍尔德氏菌，其分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia？pyrrocinia)，菌株号为LWK2，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC？NO：M？2016007，保藏日期：2016年1月5日。本发明还公开了上述吡咯伯克霍尔德氏菌在促进连香树生长中的应用。LWK2菌株具有较强的解钾能力和生长素分泌能力；可以明显促进黄瓜种子的萌发；LWK2菌剂接种连香树实生苗，结果表明，该菌剂能明显促进连香树苗的生长。与此同时，该菌种对水稻瘟病菌、金黄壳囊孢、尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌和丝核菌等植物病原菌具有一定的拮抗效果。

Description

一种咯伯克霍尔德氏菌及其在促进连香树生长中的应用
技术领域
本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种咯伯克霍尔德氏菌及其在促进连香树生长中的应用。
背景技术
连香树(CercidiphyllumjaponicumSieb.EtZucc.)为连香树科连香树属落叶乔木，又名山白香、子母树、五居树、紫荆叶木。因其味芳香，百米可闻，越摇越香，故名“连香”(傅立国，1992)。连香树是连香树科仅有的三种植物之一，是一种古老稀有的珍贵落叶高大乔木，间断分布在中国和日本。在白垩纪和第三纪曾广泛分布于北半球，从第四纪冰川后期开始，分布区急剧缩小，现零散分布于皖、浙、赣、鄂、川、陕、甘、豫及晋东南地区，数量不多，是东亚著名的孑遗植物之一(彭培好，2000)。连香树起源古老，是第三纪古热带植物的孑遗种单科植物。其树干通直，寿命长，树冠开阔，树姿雄伟，叶型奇特美观，秀丽别致。连香树木材材质优良，是优良的造纸及家具用材。此外，连香树叶中所含的麦芽醇在香料工业中常被用于香味增强剂，其叶和果可作药用。因此，连香树是集科研、观赏、药用等多种价值为一体的重要植物资源(麦苗苗，2005)。
受全球变化和人类经济活动的影响，连香树天然种群生存环境遭受严重的破坏，使我国的连香树资源急剧减少。目前的现状是种群数量多而个体数量少，零星散生于高海拔地区或一些自然保护区的其他杂木林中，大量成片的天然林已不多见。而且林下很少有连香树幼苗、幼树。此外，连香树为雌雄异株，而自然界中现存雄株较多，雌株较少，导致结实量少。目前连香树己被列入《中国珍稀濒危植物名录》、《中国植物红皮书》和第一批《国家重点保护野生植物名录》。属我国国家二级保护稀有种。
植物在生长发育过程中，其根系不断分泌各种代谢产物，包括有机酸、氨基酸、糖类、脂肪酸、生长素、酶类等。与此同时，根表面组织的不断死亡和脱落，改良了周围土壤的理化性质，同时也丰富了土壤的有机质，这使得周围微生物含量尤为丰富，同时也构成了植物根际特有的微生态系统(胡小加，1999)。在植物根际微生物群落中，尤以细菌的种类最多，数量也最大。这些根际细菌有的对植物生长是有益的，有的是有害的，也有的是中性的(陈晓斌，2000)，国际上把那些自由生活在土壤或定殖于植物根表、根内或茎叶的一类可促进植物生长的有益菌类统称为植物根际促生细菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)(Hussain,1999；Mehnaz,1998)。PGPR一般具有固氮、溶磷、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力。
PGPR的概念最初由Kloepper等人提出(Kloepper,1978)。此后，大量的研究证实PGPR广泛地存在于植物的根围。至今，已报道的促生菌包括固氮菌属(Azospirilumsp.)、醋酸杆菌属(Acetobactersp.)、产碱杆菌属(Alcaligenessp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckiasp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)、肠杆菌属(Enterobactersp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、拉恩菌属(Rahnellasp.)、根瘤菌属(Rhizobiumsp.)、黄杆菌属(Xanthobactersp.)等(Lucy,2004)。
植物根际促生细菌对植物的促生作用可以分为直接和间接作用(李引，2012)。直接作用体现在一些根际促生细菌可以合成某些物质(如生长素可以促进植物生长)，这些物质对植物的生长发育有直接作用，另外还可以合成一些能够改变土壤中某些无效元素的形态使之有效化从而有利于植物吸收的物质，如溶解钾使之有效化、固氮作用等。植物根际促生细菌对植物的间接作用体现在一些根际促生细菌能够抑制或者减轻某些植物病害对植物的生长发育和产量的不良影响。如：PGPR能够诱导植物产生系统抗性(inducedsystemicresistance,ISR)；分泌嗜铁素消耗植物根际土壤中的铁从而阻碍病原真菌的增殖；产生脂肪酶、几丁质酶等真菌细胞壁的溶菌酶促进真菌细胞裂解；分泌抗生素抑制病原菌的繁殖和发育；激活诱导植物本身的抗御能力；与病原菌争夺植物根际的生存空间，抑制病原物的定殖和传播，提高植物整体的抗病能力。
近年来，国内外相关研究人员已从一些重要的作物如水稻(Oryzasativa)、小麦(Triticumaestirum)、玉米(Zeamays)、甘蔗(Saccharumofifcinarum)和棉花(Gossypiumhirsutum)等作物根际分离筛选出许多高效优良的促生菌株，并且部分菌株已用于商业化菌肥生产。在林业上，李永吉等人(1996)利用PGPR菌剂培育马尾松壮苗和蘸根造林试验，结果表明该菌剂具有促进苗木生长、提高苗木等级、对苗期病害具有较好的控制作用。因此，PGPR的分离筛选及菌肥开发在农业生产和造林方面发挥着重要作用。
目前，国内外未见连香树促生菌方面的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能有效促进连香树生长的咯伯克霍尔德氏菌。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述咯伯克霍尔德氏菌在促进连香树生长中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
2013年4月从山西省历山自然保护区连香树根际土壤中，筛选获得了一株促进连香树生长的吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)，菌株号为LWK2，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCCNO：M2016007，保藏日期为2016年1月5日。
CCTCCNO：M2016007菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，淡黄色，圆形、表面凸起、边缘整齐，菌落表面湿润，光滑，有光泽；菌体短杆状，革兰氏染色阴性，大小约0.4～0.6μm×0.9～1.9μm，单生双鞭毛；好氧，氧化酶反应阴性，接触酶试验阳性，3％氢氧化钾试验阳性，淀粉水解试验阴性，明胶水解阳性，硝酸还原试验阳性，甲基红试验阴性，VP阴性，吲哚阳性。
CCTCCNO：M2016007菌株16SrDNA基因序列，见SEQIDNo.1所示。
将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，LWK2菌株与Burkholderiapyrrocinia的相似度为99％。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)。
上述吡咯伯克霍尔德氏菌LWK2在促进连香树生长中的应用也在本发明的保护范围之内。CCTCCNO：M2016007菌株菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂明显促进了连香树的生长发育。
上述吡咯伯克霍尔德氏菌LWK2在促进黄瓜种子生长中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述吡咯伯克霍尔德氏菌LWK2对植物病原菌拮抗中的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述的植物病原菌为水稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)、金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)、尖孢镰刀菌(FusariumOxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和丝核菌(Rhizoctoniasp.)。
有益效果：本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌CCTCCNO：M2016007在液体振荡培养条件下，对铝硅酸钾具有较好降解效果；在液体振荡培养条件下，具有较强的生长素分泌能力；将CCTCCNO：M2016007菌悬液作用于黄瓜种子，可明显促进种子萌发和生长；将吡咯伯克霍尔德氏菌CCTCCNO：M2016007制成菌剂接种连香树实生苗，结果表明，该菌剂明显促进中国枫香实生苗的生长发育；与此同时，本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌CCTCCNO：M2016007对水稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)、金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)、尖孢镰刀菌(FusariumOxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和丝核菌(Rhizoctoniasp.)等植物病原菌具有一定的拮抗效果。因此，本发明为开发促进连香树生长的细菌肥料提供了优良的菌株资源。
附图说明
吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)，菌株号LWK2，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号为CCTCCNO：M2016007，保藏日期为2016年1月5日。
图1为LWK2对铝硅酸钾降解能力。
图2为LWK2对黄瓜种子的促生效果。
图3为LWK2菌株对水稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)、金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)、尖孢镰刀菌(FusariumOxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和丝核菌(Rhizoctoniasp.)等植物病原菌的拮抗效果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：LWK2液体解钾能力测定。
解钾能力测定培养基：蔗糖5g，MgSO4·7H2O0.5g，Na2HPO42g，铝硅酸钾2g，FeCl30.005g，pH7.0～7.5，自来水1000mL，115℃灭菌30min。
将活化后LWK2单菌落的接种于LB(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min)液体培养基中，30℃振荡培养18～24h，充分振荡使其形成均匀的菌悬液，作为种子液。取0.5mL接种至含有50mL解钾能力测定培养基的300mL锥形瓶中，接种等量LB液体培养基的解钾能力测定培养基作为空白对照。28℃，200r/min震荡培养5d。将获得的发酵液置于水浴锅浓缩至10mL左右，加入6％(体积分数)的H2O2继续蒸煮，同时不断搅拌，直到解钾细菌粘液消失为止。然后将处理后的液体过滤，收集滤液，转移到50mL容量瓶中，定容，最后用火焰分光光度法测定菌液中K+离子的质量浓度(图1)。
从图1中可看出，接种LWK2菌株发酵液中可溶性钾含量为40.56mg·L-1，是对照(19.02mg·L-1)的2倍。综上表明，LWK2菌株对铝硅酸钾具有较强的降解能力。
实施例2：LWK2产生长素能力测定。
King'sB培养基：蛋白胨20g，MgSO4·7H2O1.5g，K2HPO41.5g，甘油10mL，琼脂15g，调节pH值至7.0后，补充到1000mL。
S1比色液：称取12gFeCl3溶于300mL去离子水中，缓慢加入429.7mL浓硫酸，待冷却后定容至1L。
配制浓度分别为1、4、6、8、10、12、14、16、18、20mg/L的IAA标准溶液，并按体积比1:1与S1试剂混合，室温下避光放置30min，然后分别测定各浓度的OD530(以蒸馏水与S1试剂的1:1混合液为空白对照)值。以IAA浓度为横坐标，OD530为纵坐标作图，即得到IAA的标准曲线。
将LWK2单菌落接种于NB液体培养基中培养12h(28℃、120r/min)，用无菌水调节OD值为0.05，取0.1mL菌悬液接种到含有100mg/L的色氨酸King'sB培养液中，每个三角瓶装50mL的培养液，重复3次，以加0.1mL无菌水的培养液为空白对照，一起置于28℃、120r/min的摇床上振荡培养7d。取上述培养液2mL，12000g离心15min，每1mL上清液加1mLS1试剂，室温下避光放置30min后，测定OD530值，以空白培养基作对照。根据标准曲线计算IAA含量。
接种LWK2菌株的液体培养基中IAA含量为11.40mg/L，说明LWK2菌株具有较强的生长素分泌能力。
实施例3：LWK2对黄瓜种子促生能力测定。
黄瓜种子用10％的过氧化氢处理20min，无菌水冲洗5～6次，晾干备用。
将LWK2菌株单菌落接种于NB液体培养基中，28℃摇床培养24～36h，使菌体浓度达到109cfu/mL。将菌悬液梯度稀释至10-7，用记号笔划线将无菌培养皿皿底分为8个均等区域，依次标记CK、-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7，每个区域分别放置4～6张无菌滤纸片，中间放上无菌脱脂棉，将处理完毕的黄瓜种子放于滤纸片上，分别在皿底各区域的滤纸片中央滴加对应稀释度的LWK2菌悬液100μl，CK区域滴加等量无菌水作为对照。28℃，光照培养，观察黄瓜种子的萌发情况(图2)。
LWK2菌株对黄瓜种子萌发的影响(见表1、图2)。从表1和图2可看出，LWK2菌液明显促进了黄瓜种子的萌发。不同稀释度的LWK2菌液均可促进黄瓜种子的萌发，以10-2～10-6稀释度菌液的促进作用最为明显。其中，10-2稀释度的LWK2菌液作用黄瓜种子后，黄瓜种子的下胚轴和上胚轴长度分别比CK增长了2.50倍和1.67倍。
表1LWK2对黄瓜种子萌发的影响
注：“上”表示上胚轴长度(cm)；“下”表示下胚轴长度(cm)。
实施例4：LWK2温室盆栽试验。
将活化后的LWK2单菌落接种至含有50mLNB液体培养基的100mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养48h。取发酵液，4℃，6000r/min离心5min，菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后，用无菌生理盐水调节菌悬液至108cfu/mL制成菌剂。将上述菌剂接种至1年生连香树实生苗根际，接种量为5mL/株，10个重复，对照加等量无菌生理盐水。置于温室中，光照12h/天，适时浇水。
LWK2菌株接种30天对一年生连香树实生苗生长的影响(见表2)。从表2可看出，接种LWK2菌剂明显促进了连香树实生苗的生长。接种处理连香树实生苗的苗高、地径与CK相比均有不同程度的增长。其中，苗高和地径比CK分别增长了15.95％和23.29％。
表2LWK2菌株接种30天对连香树实生苗生长的影响
实施例5：LWK2对植物病原菌拮抗实验。
PDA培养基：马铃薯去皮后切成小块，称取200g，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用纱布过滤，加入葡萄糖20g，琼脂粉15～20g，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装，灭菌。
采用平板对峙培养法，分别将活化后的LWK2菌株和植物病原菌同时接种于PDA平板上的不同区域上，28℃恒温培养3～5d后，观察LWK2对各种植物病原菌的拮抗效果。
LWK2菌株对受试植物病原菌的拮抗效果(见图3)。由图3可知，LWK2菌株对水稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)、金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)、尖孢镰刀菌(FusariumOxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和丝核菌(Rhizoctoniasp.)等植物病原菌具有一定的拮抗效果。尤其对水稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)和水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)的拮抗作用最为明显。

Claims (5)

1.一种吡咯伯克霍尔德氏菌，其分类命名为吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapyrrocinia)，菌株号为LWK2，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCNO：M2016007，保藏日期：2016年1月5日。
2.权利要求1所述的咯伯克霍尔德氏菌在促进连香树实生苗生长中的应用。
3.权利要求1所述的咯伯克霍尔德氏菌在促进黄瓜种子生长中的应用。
4.权利要求1所述的咯伯克霍尔德氏菌对植物病原菌拮抗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物病原菌为水稻瘟病菌(Magnaporthgrisea)、金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)、尖孢镰刀菌(FusariumOxysporum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和丝核菌(Rhizoctoniasp.)。
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Application publication date: 20160413

Assignee: Zhangzhi County Henglv Agricultural Science & Technology Development Co.,Ltd.

Assignor: CHANGZHI University

Contract record no.: X2023140000015

Denomination of invention: A Burkholderia pyrrole and its application in promoting the growth of Lianxiang trees

Granted publication date: 20181109

License type: Common License

Record date: 20230706