CN118028189B

CN118028189B - 一株伯克霍尔德氏菌dhr18及其应用

Info

Publication number: CN118028189B
Application number: CN202410443471.3A
Authority: CN
Inventors: 涂敏; 蔡海滨; 罗佑红; 赵欣阳; 孟祥佳; 周燚; 曾霞
Original assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Filing date: 2024-04-12
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2044-04-12

Abstract

本发明属于微生物技术应用领域，尤其是涉及一株伯克霍尔德氏菌DHR18及其应用。本发明提供的伯克霍尔德氏菌为树木伯克霍尔德氏菌DHR18，其对橡胶树红根病、橡胶树炭疽病以及生产上多种植物病原真菌均具有拮抗活性，能产生几丁质酶、蛋白酶、铁载体和吲哚‑3‑乙酸（IAA），具有广泛的生物活性，在生防菌开发方面具有巨大的潜力。

Description

一株伯克霍尔德氏菌DHR18及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一株伯克霍尔德氏菌DHR18及其应用。

背景技术

橡胶树红根病是橡胶树危害面积最广、影响最大的根部传染性病害之一，也是造成巴西橡胶树减产的主要原因之一。该病害危害巴西橡胶树根部或根颈部，在感染红根病的橡胶树病根的表皮具有红色或枣红色菌膜，这是红根病的主要特征之一。胶树感病后叶片变小、变黄，缺乏光泽，卷缩，树冠逐渐稀疏，树干干缩或者基部出现条沟，病情严重时会整株枯死，并逐渐向四周蔓延。橡胶树红根病病原菌寄主范围广，同时病原菌在土壤里的潜伏期很长，一旦染病会直接影响胶林的生产寿命，降低橡胶树的产胶量。

目前生产上对于橡胶树红根病的防治以机械挖除和化学防治为主，但是由于化学农药造成的农药残留、环境污染、病原体抗性、防效下降等问题日益突出，人们逐渐将研究方向转向其他防治方法上。其中生物防治被认为是最具有发展潜力的重要防治方法之一。随着橡胶树红根病的发生越来越严重，对橡胶树的生长产生了巨大的危害，因此分离、筛选出对橡胶树红根病具有防治效果的生防菌是橡胶树红根病的防治的重要途径，对于橡胶产业的可持续发展具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是为了提供一株伯克霍尔德氏菌DHR18及其应用。

本发明的伯克霍尔德氏菌对植物病原真菌如橡胶树红根病菌、橡胶树胶孢炭疽病菌、尖孢炭疽病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、晚疫病菌、灰霉病菌、魔芋炭疽菌以及禾谷镰刀菌等表现出广谱的抑菌活性。同时本发明的伯克霍尔德氏菌能产生具有很强的分泌蛋白酶的能力，产生几丁质酶、蛋白酶、铁载体和吲哚-3-乙酸（IAA）的能力，还具有促进植物生长的能力。本发明结果表明该菌株具有防病促生应用前景，为橡胶树红根病、橡胶树橡胶炭疽病的防治提供了良好的生防资源，也为水稻稻瘟病、辣椒疫霉病等多种病害的防治提供参考。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一方面是，提供一株伯克霍尔德氏菌，其为树木伯克霍尔德氏菌DHR18（Burkholderia arboris DHR18），于2024年03月04日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2024389。

本发明的第二个方面是，提供上述伯克霍尔德氏菌的发酵液。

本发明的第三个方面是，提供上述伯克霍尔德氏菌的发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以上所述的伯克霍尔德氏菌，取其单菌落接种至NB培养基中，28 ℃、180 rpm摇床中培养12h后，即得。

本发明的第四个方面是，提供上述伯克霍尔德氏菌和/或所述的发酵液在制备拮抗橡胶树红根病菌Ganoderma pseudoferreum上的应用上的应用。

本发明的第五个方面是，提供所述伯克霍尔德氏菌和/或所述的发酵液在制备抑制由橡胶树红根病菌Ganoderma pseudoferreum所致病害的制剂上的应用。

本发明的第六个方面是，提供所述的伯克霍尔德氏菌和/发酵液在拮抗植物病原真菌中的应用，所述植物病原真菌为橡胶树胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、橡胶树尖孢炭疽病菌Colletotrichum acutatum、灰霉病菌Botrytis cinerea、马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、魔芋炭疽病菌Colletotrichum phomoides、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和/或禾谷镰刀菌Fusarium graminearum。

本发明的第七个方面是，提供所述的伯克霍尔德氏菌和/发酵液在制备拮抗植物病原真菌所致病害的制剂上的应用，所述植物病原真菌为橡胶树胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、橡胶树尖孢炭疽病菌Colletotrichum acutatum、灰霉病菌Botrytis cinerea、马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、魔芋炭疽病菌Colletotrichum phomoides、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和/或禾谷镰刀菌Fusarium graminearum。

本发明的第八个方面是，提供所述的伯克霍尔德氏菌和/发酵液在制备产生吲哚-3-乙酸（IAA）、蛋白酶、几丁质酶和/或铁载体制剂上的应用。

本发明的第九个方面是，提供所述的伯克霍尔德氏菌和/发酵液在制备促进植物生长的制剂上的应用。

本发明的第十个方面是，提供一种生防菌剂，包括以上所述的伯克霍尔德氏菌和/或所述的发酵液。

有益效果

与现有技术相比，本发明提供的树木伯克霍尔德氏菌DHR18（简称“菌株DHR18”）对橡胶树红根病菌、炭疽病菌以及生产上多种植物病原真菌均具有拮抗活性。此外，本发明提供的树木伯克霍尔德氏菌DHR18能产生几丁质酶、蛋白酶、铁载体和吲哚-3-乙酸类生长素（IAA）。因此，本发明提供的树木伯克霍尔德氏菌DHR18，在防治橡胶树红根病、炭疽病以及多种作物重要的真菌病害上具有较好的应用潜力。同时，本发明所述的菌株DHR18能够促进植物生长，为研发新型的微生物菌剂打下了基础，也为橡胶树红根病的防治提供了候选菌株。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1. 菌株DHR18显微镜（1000X）照片。

图2. 菌株DHR18平板照片。

图3. 菌株DHR18基于16S rRNA基因序列比对结果以Cupriavidus taiwanensisLMG 19424 AF300324为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。

图4. 菌株DHR18全基因组热图。

图5. 菌株DHR18产生胞外酶和铁载体的活性，图中，A：蛋白酶，B：产IAA，C：铁载体，D：几丁质酶。

图6. 菌株DHR18对橡胶树红根病菌的抑菌活性。

图7. 菌株DHR18对其他植物重要病害病原菌的抑菌效果。

图8. 橡胶树幼苗生长情况对比。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所用的菌种培养基如下：

NA固体培养基（g/L）：牛肉浸膏3 g，多聚蛋白胨5 g，蔗糖10 g，酵母粉1 g，琼脂粉15 g，加水溶解并定容至1000 mL，调节pH 7.0-7.2，高压灭菌（121℃，20 min）。

NB液体培养基（g/L）：牛肉浸膏3 g，多聚蛋白胨5 g，蔗糖10 g，酵母粉1 g，加水溶解并定容至1000 mL，调节pH 7.0-7.2，高压灭菌（121℃，20 min）。

PDA固体培养基（g/L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加入水溶解，最后定容至1000 mL，pH 7.0-7.2，高压灭菌（121℃，20 min）。

脱脂牛奶琼脂培养基：15 g脱脂奶粉，15 g琼脂，1000mL蒸馏水。

铁载体检测培养基（CAS）：60.5m g铬天青-S，72.9m g十六烷基三甲基溴化铵，2.645m g六水氯化铁，295.25m g二水磷酸二氢钠，1213.5m g十二水磷酸氢二钠，125m g氯化铵，37.5m g磷酸二氢钾，62.5m g氯化纳，9 g琼脂，pH值6.8±0.1,1000mL蒸馏水。

几丁质酶定性检测培养基：磷酸二氢铵0.5 g，七水合硫酸镁0.2 g，氯化钾0.2 g，1%胶体几丁质（w/v），琼脂粉20 g，去离子水1000 mL。

实施例1、伯克霍尔德氏菌 DHR18的获得

1、样品来源

2023年5月6日在中国热带农业科学院橡胶研究所儋州试验场三队胶林。

2、菌株的筛选

（1）样品采集

在离树干10㎝挖开土壤表层采集橡胶树侧根，每点采集100g根样。每块地采集3个样品，记录好采样的时间、地点和种类。采集完成的样品置于4℃保存，以用于内生菌分离。

（2）内生菌分离

橡胶树样品用流水冲洗表面30 min，用无菌纱布擦干表面水分。在超净工作台中用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分。然后依次用75%乙醇（1 min）、2% NaClO溶液（5 min）进行表面灭菌。用无菌水冲洗干净后，使用灭菌处理后的解剖刀将根段切成1-2 cm的小块组织，并呈“品”字形接种至LA培养基上，每个培养基重复5组实验。将已接种的平板置于28℃恒温培养箱中培养。当培养基上观察到明显的菌落时，用接种针或接种环将形态不同的单菌落，接种到新培养基上进行菌种纯化，纯化后菌株于4℃保存。同时，为了确保分离出的菌为橡胶树的内生菌，设置了2个对照组。一组用消毒过的未切割的枝条在平板上进行印迹涂抹；另一组用最后一次冲洗的无菌水进行平板涂布。如果2个对照组的平板均无任何微生物生长，则可以确定获得的是内生菌。

（3）细菌的保存

将菌株单菌落接种在NB液体培养基中，在28 ℃、180 rpm摇床中培养12 h后，吸取1 mL发酵液与1 mL 50 %的无菌甘油，轻轻振荡混匀，置于-80℃长期保存。

最终发现菌株DHR18表现出很强的抑制活性，抑制区直径超过10 mm，菌株DHR18的显微镜（1000X）观察照片及平板照片如图1-2所示。

菌株DHR18为短杆状，微弯曲。在培养基上生长24h 形成中等大小黄色菌落，不透明、湿润、微凸。

实施例2、菌株 DHR18的16S rRNA基因和全基因组测序

利用Omega公司Becterial DNA Kit试剂盒提取菌株SF305的基因组DNA，利用细菌16S rDNA基因引物：27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，以获得目的片段。PCR反应体系为表1所示。

表1 Ex-Taq聚合酶链式反应体系

组分	体积
		模板DNA	2.5 ng
2×PCR buffer	25 μL
		2 mM dNTPs	5 μL
引物F（10 μM）	1 μL
		引物R（10 μM）	1 μL
TaqDNA聚合酶	0.4 μL
		无菌水	补至50 μL

PCR反应基本条件为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸2 min（1 kb / min），72℃预延伸6 min，4℃保存，30个循环。反应结束后，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检验，将PCR原液送铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。测序结果如图2所示。运用DNA Star进行分析测序结果，并在NCBI网站上进行BLAST比对，确定近缘株细菌的种属，如表2所示。菌株 DHR18的16SrRNA基因如SEQ ID NO.1所示。其比对结果如表2所示。

表2菌株DHR18的16S rRNA基因测序BLAST结果

Rank	Name	Strain	Accession	Pairwise Similarity(%)	Mismatch/Total nt
						1	Burkholderia contaminans	LMG 23361	LASD01000006	99.56076	6/1366
2	Burkholderia aenigmatica	LMG 13014	LR760817	99.55979	6/1363
						3	Burkholderia orbicola	TAtl-371	MT928519	99.54338	6/1314
4	Burkholderia lata	383	CP000150	99.48755	7/1366
						5	Burkholderia cenocepacia	LMG 16656	JTDP01000003	99.41435	8/1366
6	Burkholderia arboris	R-24201	AM747630	99.41392	8/1365
						7	Burkholderia puraquae	CAMPA 1040	NBYX01000050	99.34066	9/1365
8	Burkholderia territorii	LMG 28158	LK023503	99.33969	9/1363
						9	Burkholderia cepacia	ATCC 25416	AXBO01000009	99.26794	10/1366
10	Burkholderia anthina	R-4183	AJ420880	99.26794	10/1366
						11	Burkholderia metallica	R-16017	AM747632	99.26794	10/1366
12	Burkholderia seminalis	R-24196	AM747631	99.26632	10/1363
						13	Burkholderia ambifaria	AMMD	CP000442	99.12152	12/1366
14	Burkholderia diffusa	R-15930	AM747629	99.12152	12/1366
						15	Burkholderia ubonensis	CIP 107078	EU024179	99.0099	13/1313
16	Burkholderia vietnamiensis	LMG 10929	CP009631	98.97511	14/1366
						17	Burkholderia pyrrocinia	DSM 10685	CP011503	98.97511	14/1366
18	Burkholderia stabilis	ATCC BAA-67	CP016444	98.97511	14/1366
						19	Burkholderia latens	R-5630	AM747628	98.9019	15/1366
20	Burkholderia multivorans	ATCC BAA-247	ALIW01000278	98.75549	17/1366
						21	Burkholderia stagnalis	LMG 28156	LK023502	98.68132	18/1365

基于16S rRNA基因序列比对结果以Cupriavidus taiwanensis LMG 19424AF300324为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树如图3所示，结果显示：菌株DHR18的16SrRNA基因与Burkholderia lata相似度最高，初步判定为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）属细菌。

将菌株DHR18提交武汉贝纳科技有限公司进行全基因组鉴定，用OAT软件计算的菌株全基因组生成热图，如图4所示。该菌株DHR18与树木伯克霍尔德氏菌（Burkholderia arboris）（LMG24066）模式菌株全基因组数据比较得出ANI值为99.44%，结果大于ANI同种判断的阀值96%。

通过上述检测结果，最终确定菌株DHR18为伯克霍尔德氏菌属的树木伯克霍尔德氏菌，将其命名为：树木伯克霍尔德氏菌DHR18（Burkholderia arboris DHR18），已于2024年03月04日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2024389，地址在中国武汉的武汉大学。

实施例3、菌株 DHR18的生理生化鉴定

通过生理生化测试，明确所述菌株DHR18是一株革兰氏阴性细菌。

菌株 DHR18的生理生化特征具体结果见表3和表4。

表3 菌株DHR18生理生化特性–酶活、碳源氧化

	反应底物	反应酶	检测结果
				ONPG	邻硝基苯-半乳糖苷	β-半乳糖苷酶	+
ADH	精氨酸	精氨酸双水解酶	+
				LDC	赖氨酸	赖氨酸脱羧酶	+
ODC	鸟氨酸	鸟氨酶脱羧	+
				CIT	柠檬酸钠	柠檬酸利用	-
H2S	硫代硫酸钠	H2S产生	-
				URE	尿素	尿酶	-
TDA	色氨酸	色氨酸脱氨酶	-
				IND	色氨酸	吲哚产生	-
VP	丙酮酸盐	3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇	+
				GEL	Kohn明胶	明胶酶	+
GLU	葡萄糖	发酵/氧化（4）	+
				MAN	甘露醇	发酵/氧化（4）	-
INO	肌醇	发酵/氧化（4）	-
				SOR	山梨醇	发酵/氧化（4）	-
RHA	鼠李糖	发酵/氧化（4）	-
				SAC	蔗糖	发酵/氧化（4）	-
MEL	密二糖	发酵/氧化（4）	-
				AMY	苦杏仁苷	发酵/氧化（4）	-
ARA	阿拉伯糖	发酵/氧化（4）	-

+：阳性反应； -：阴性反应

表4 菌株DHR18生理生化特性 – 利用碳源产酸

试剂条对应管/底物	检测结果	试剂条对应管/底物	检测结果
				0 对照	-	25 七叶灵	-
1 甘油	-	26 柳醇	-
				2 赤癣醇	-	27 纤维二糖	-
3 D-阿拉伯糖	-	28 麦芽糖	+
				4 L-阿拉伯糖	-	29 乳糖	-
5 核糖	-	30 蜜二糖	-
				6 D-木糖	-	31 蔗糖	+
7 L-木糖	-	32 海藻糖	+
				8 阿东醇	-	33 菊糖	-
9 β-甲基-D-木糖甙	-	34 松叁糖	-
				10 半乳糖	+	35 棉子糖	-
11 葡萄糖	+	36 淀粉	-
				12 果糖	-	37 糖原	-
13 甘露糖	-	38 木糖醇	-
				14 山梨糖	-	39 拢牛儿糖	-
15 鼠李糖	-	40 D-松二糖	+
				16 卫茅醇	-	41 D-来苏糖	-
17 肌醇	-	42 D-塔格糖	-
				18 甘露醇	-	43 D-岩糖	-
19 山梨醇	-	44 L-岩糖	-
				20 α-甲基-D-甘露糖甙	-	45 D-阿拉伯糖醇	-
21 α-甲基-D-葡萄糖甙	-	46 L-阿拉伯糖醇	-
				22 N-乙酰-葡糖胺	-	47 葡萄糖酸盐	-
23 苦杏仁甙	-	48 2-酮基-葡萄糖酸盐	-
				24 熊果甙	-	49 5-酮基-葡萄糖酸盐	-

+：阳性反应； -：阴性反应

实施例4、菌株DHR18发酵液的制备

将菌株DHR18单菌落接种至NB培养基中，28 ℃、180 rpm摇床中培养12h后，得到菌株DHR18的发酵液。之后，调整发酵液浓度为OD₆₀₀=2.0，备用。

实施例5、菌株DHR18生物学特性的测定

采用平板法测定了菌株DHR18产生蛋白酶、几丁质酶、分泌铁载体及吲哚-3-乙酸（IAA）的活性。（1）蛋白酶测定方法：将无菌的滤纸圆片放在脱脂牛奶琼脂平板中央，吸取10μL用 NB 培养了24 h的待测菌株的菌液，缓慢接种至滤纸片上。将平板置于 28℃培养箱中培养3 d，如果菌落周围能形成透明圈，该菌株就能产生蛋白酶；测量和记录透明圈的直径。（2）几丁质酶测定方法：将菌株接种至几丁质酶检测平板上，在 28℃培养箱中培养3 d后，观察菌落周围是否有透明圈出现，若有则表明该菌株能产生几丁质酶，测量和记录透明圈的直径。（3）铁载体测定方法：采用CAS平板检测铁载体的产生，将菌株接种于CAS平板中心，28℃恒温培养 3～5 d，观察菌落周围是否有橘黄色晕圈形成，若有则表明该菌株能分泌铁载体，测量和记录晕圈的直径。（4）吲哚-3-乙酸（IAA）测定法：采用比色法定量测定其的IAA产量，将菌株DHR18接种于4 mL含40 mg色氨酸的LB培养基中，以不接细菌的LB培养基为阴性对照，28℃孵育48 h后，取1.5 mL培养液，12100 rpm离心10 min。取0.5 mL上清液与1 mLsalkowski试剂混合，置于1.5 mL管中，25℃暗处孵育30 min。根据颜色变化判断IAA是否产生。Salkowski检测试剂：内含0.5 mol/L FeCl₃溶液15mL、浓H₂SO₄（比重1.84）300mL、蒸馏水500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，l mL试液需加此试剂4 mL。

结果如图5所示，表明菌株DHR18能产生几丁质酶、铁载体和吲哚-3-乙酸（IAA）的能力；同时，菌株DHR18分泌蛋白酶的能力很强，其菌落周围形成透明圈的平均直径可达66.8 mm。

实施例6、菌株DHR18对橡胶树红根病菌的拮抗活性测定

取橡胶树红根病菌（Ganoderma pseudoferreum）菌饼于PDA培养基上，待菌丝长满整个平板后，用5mm孔径打孔器在平板上打取菌块，取一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA平板中央，在菌饼等距离（20 mm）的上、左、右放入预先处理的滤纸片，滤纸片为灭菌烘干后加入30ul的供试菌株 DHR18发酵液。设置3个重复。同时，以不接菌株DHR18发酵液，只接橡胶树红根病菌菌饼的平板为对照（CK）。置于28℃的培养箱中，培养7d后观察并记录抑菌结果。

相对抑菌率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－5）×100%。

式中，各菌落直径单位为“mm”；“5”为处理菌落的初始直径。

菌株DHR18 对橡胶树红根病菌的拮抗效果图如图6所示，抑菌效果如表5所示。

表5 菌株DHR18对橡胶树红根病菌的抑菌效果

病原菌	抑菌直径（mm）	相对抑菌率（%）
			橡胶树红根病菌	14.81±1.37	83.89±3.30

结果显示，菌株DHR18表现出很强的抑制活性，抑制区直径超过10 mm，平均抑菌率为83.89%，表明菌株DHR18对橡胶树红根病菌具有显著的拮抗作用。

实施例7、菌株 DHR18的拮抗谱测定

采用滤纸片对峙培养法，将橡胶树胶孢炭疽菌（Colletotrichum siamense）、橡胶树尖孢炭疽菌（Colletotrichum australisinense）、灰霉病菌（Botrytis cinerea）、马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、魔芋炭疽病菌Colletotrichum phomoides、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）分别在PDA培养基上培养，待菌丝长满整个平板后，用5mm孔径打孔器在平板上打取菌块，取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA平板中央，在菌饼上、左、右等距离（20 mm）放入预先处理的滤纸片，滤纸片为灭菌烘干后加入30ul的供试菌株DHR18发酵液。以只接待测病原菌菌饼作为对照（CK）。每个处理3个重复，在28 ℃培养箱中进行培养，5天后观察并记录抑菌现象。结果见图7。菌株 DHR18对各个病原菌的相对抑菌率如表6所示。

表6 菌株 DHR18对8种植物病原真菌的抑菌效果

病原真菌	抑菌直径（mm）	相对抑菌率（%）
			灰霉病菌	14.12±1.15	82.22±2.78
马铃薯晚疫病菌	7.21±1.84	65.56±4.44
			辣椒疫霉病菌	3.06±0.45	55.56±3.13
魔芋炭疽菌	12.10±1.54	77.33±3.71
			稻瘟病菌	12.74±0.80	78.89±1.93
橡胶树尖孢炭疽病菌	11.45±1.08	75.78±2.61
			橡胶树胶孢炭疽病菌	9.70±1.37	71.56±3.31
禾谷镰刀菌	10.62±1.86	73.78±4.48

结果显示，菌株 DHR18对橡胶树胶孢炭疽病菌的相对抑菌率为71.56%，对橡胶树尖孢炭疽病菌的相对抑菌率为75.78%，对灰霉病菌的相对抑菌率为82.22%，对马铃薯晚疫病菌的相对抑菌率为65.56%，对辣椒疫霉病菌的相对抑菌率为55.56%，对魔芋炭疽菌的相对抑菌率为77.33%，对稻瘟病菌的相对抑菌率为78.89%，对禾谷镰刀菌的相对抑菌率为73.78%。这表明，菌株DHR18对这8种病原真菌都具有较好的拮抗作用。

实施例8、菌株DHR18促生长作用

菌株DHR18单菌落NB培养基中，28℃、180 rpm摇床中培养12h后，得发酵液。

选择同时播种、长势相似的苗长25厘米，具1篷古铜期叶片的橡胶树苗，将菌株DHR18发酵液浓度调节至10⁸CFU/mL作为原液，橡胶树苗用原液浸根30 min后移栽，对照组用无菌水处理，每个处理20棵苗。统一进行田间栽培管理。栽培25d后，将幼苗挖出，用自来水冲洗，用消毒的滤纸吸去表面的水分测定鲜重，测量株长和根长，之后将整个植株80℃烘干48h测定干重。对有关数据进行统计和分析，其结果如表7和图8所示。

表7菌株DHR18对橡胶树幼苗生长的影响

处理	株长/cm	根长/cm	鲜重/g	干重/g
					CK	29.88±0.87b	9.53±0.43b	2.99±0.07b	1.45±0.05b
DHR18	38.52±0.79a	13.40±0.29a	3.50±0.06a	2.01±0.07a

由表7可以看出，采用菌株DHR18发酵液原液浸根处理，橡胶树幼苗的株长、根长、鲜重和干重菌显著增加。说明菌株DHR18发酵液原液可以显著促进橡胶树幼苗的生长。

由此，本发明提供的树木伯克霍尔德氏菌DHR18，对橡胶树红根病菌具有显著的拮抗作用，对多种生产上重要的植物病原真菌也具有拮抗作用，具有很强的分泌蛋白酶的能力以及产生几丁质酶、铁载体和吲哚-3-乙酸（IAA）的能力，能够促进橡胶树幼苗的生长，为橡胶树红根病的生物防治提供了新资源，也为其他重要病害防治研发新型的生防菌制剂提供了可供选择的菌株。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株伯克霍尔德氏菌，其特征在于，其为树木伯克霍尔德氏菌（Burkholderia arboris ）DHR18，于2024年03月04日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M 2024389。

2.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌的发酵液，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌，取其单菌落接种至NB培养基中，28 ℃、180 rpm摇床中培养12h后，即得。

3.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液在制备拮抗橡胶树红根病菌Ganoderma pseudoferreum的制剂上的应用。

4.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液在制备抑制由橡胶树红根病菌Ganoderma pseudoferreum所致病害的制剂上的应用。

5.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液在制备拮抗植物病原真菌的制剂中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为橡胶树胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、橡胶树尖孢炭疽病菌Colletotrichum acutatum、灰霉病菌Botrytis cinerea、马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、魔芋炭疽病菌Colletotrichum phomoides、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和/或禾谷镰刀菌Fusarium graminearum。

6.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液在制备拮抗植物病原真菌所致病害的制剂上的应用，所述植物病原真菌为橡胶树胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、橡胶树尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum、灰霉病菌Botrytis cinerea、马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、魔芋炭疽病菌Colletotrichum phomoides、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和/或禾谷镰刀菌Fusarium graminearum。

7.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液在制备产生吲哚-3-乙酸、蛋白酶、几丁质酶和/或铁载体制剂上的应用。

8.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液在制备促进作物生长的制剂上的应用；所述作物为橡胶树。

9.一种生防菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌或如权利要求2所述的发酵液。