CN112410261B - 一株暹罗芽孢杆菌mc2-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株暹罗芽孢杆菌MC2‑1及其应用，属于农业微生物技术领域，本发明提供的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），菌株编号为MC2‑1，保藏编号为CGMCC No.15974，分类命名为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。该暹罗芽孢杆菌MC2‑1发酵液MC2‑1对烟草疫霉Phytophthora nicotianae具有较好的抑制作用，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发，用于烟草疫霉的防控，效果好成本低。

Description

一株暹罗芽孢杆菌MC2-1及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体的说，涉及一株暹罗芽孢杆菌MC2-1及其在防治烟草疫霉病中的应用。
背景技术
烟草是一种经济植物，在我国的主要烟草种植地区，由于长期不合理的施用化学药剂以及种植方式，使得烟草上的病害越来越严重，严重影响了烟叶的品质，最近每年造成的损失都达到上亿美元，防治面临着巨大的挑战。烟草黑胫病是烟草种植过程中非常常见的一种病害，在我国的主要烟草种植地区均有发生，某些地区甚至出现了高抗性病株，已经成为威胁烟叶生产的主要病害，现阶段对于这种病害有效的防治措施还是以化学防治为主，而化学农药在防治植物病害时，由于长期积累会造成植物农药残留、产生抗药性以及病害猖獗等问题，并会导致烟叶的质量下降，从而影响烟农经济收入水平以及烟草业的可持续性发展。
近年来，为响应烟草绿色防控的号召，避免使用大量化学农药造成的“3R”问题，发挥持续防治、保护生态环境以及对人畜低毒安全等优势，生物防治方法在植物病害治理的舞台上扮演着愈来愈关键的角色，所以探索有效的生物防治途径已经成为当前的研究热点，对烟草种植具有举足轻重的意义。相应地，针对烟草黑胫病的微生物农药研发也成为近年来烟草黑胫病防治领域的一个主要方向，但目前主要从植物及根际土壤中筛选黑胫病的生防菌，但其它来源的生防菌涉及很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一株暹罗芽孢杆菌及其对烟草疫霉的防治应用，以该暹罗芽孢杆菌为活性成分的菌剂用于烟草疫霉病的防控，效果好，成本低。
本发明技术方案如下：
本发明所提供的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，菌株编号为MC2-1；该菌株已于2018年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.15974，分类命名：暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis。
本发明提供的菌株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)MC2-1 CGMCC No.15974的生物学特性为：
LB培养基(LB Medium)培养的菌落为菌落直径1.57-6.37㎜，圆形，白色，凹透镜隆起，表面干燥有褶皱且边缘完整。菌体短杆状，5.33-12.47μm，有芽孢，革兰氏阴性菌，淀粉水解实验阳性，油脂水解实验阴性，石蕊牛奶实验阴性，明胶液化阳性，尿素实验阳性；发酵葡萄糖既阳性；吲哚实验阴性，柠檬酸盐实验阴性，甲基红阴性，硫化氢实验阴性。
本发明提供的菌株暹罗芽孢杆菌MC2-1是从美洲大蠊消化道筛分而来的。
暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)MC2-1的制备方法：将暹罗芽孢杆菌MC2-1菌液接种于NYBD培养基上，在温度36℃、pH值为6的条件下培养；MC2-1的最适碳源为麦芽糖，最适氮源为酵母。
本发明的另一个目的在于提供了暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)MC2-1的应用，该菌株可用于制备防治烟草疫霉病生物药剂，或制备抑制烟草疫霉病病原菌生长制剂，或制备真菌抑制剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的暹罗芽孢杆菌MC2-1发酵液MC2-1对烟草疫霉Phytophthoranicotianae具有较好的抑制作用，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发，用于烟草疫霉病的防控，效果好成本低。
附图说明
图1是不同培养基对拮抗细菌生长的影响；
图2是不同碳源对菌株生长速度的影响；
图3是不同氮源对菌株生长的影响；
图4是接种量对菌株生长的影响；
图5是装液量对菌株生长速度的影响；
图6是pH对菌株生长速度的影响；
图7是转速对菌株生长速度的影响；
图8是温度对菌株生长的影响；
图9是时间对菌株生长的影响；
图10是光照对菌株生长的影响；
图11是菌株进化树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1暹罗芽孢杆菌MC2-1的分离筛选与发酵培养
一、分离筛选
美洲大蠊是山东第一医科大学病媒生物与虫媒病实验室饲养的品系，已在实验室内连续传代饲养15年。在分离暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis时，首先将美洲大蠊成虫体表以75％酒精漂洗3次，每次2分钟，再用无菌水漂洗3次后解剖，获得完整的美洲小蠊消化道。
1.灭菌：所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30分钟。
2.研磨：将美洲大蠊消化道剪碎后放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒充分研磨。
3.梯度稀释：取研磨后的汁液1ml，放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-1稀释度的菌液，再从10-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-2稀释度的菌液，以此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的菌液。
4.培养基的配置：细菌的分离常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)，纯化常用LB培养基。
NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；pH 7.0，121℃灭菌20min。
倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。
5.涂布：将稀释菌液10-4、10-5、10-6、10-7分别涂布于平板上，每个梯度涂3皿，并在皿底做上标记。
6.培养：倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。
7.菌的纯化：在无菌条件下用挑针将NA培养基上长出的单菌落挑取于LB培养基上划线培养；纯化3-4次可得纯化后的单菌落。
二、菌种发酵培养
将暹罗芽孢杆菌MC2-1菌液接种于NYBD培养基上，在温度36℃、pH值为6、转速180r/min、装液量30ml、接种量4％-6％、时间60h、光照20h的条件下培养，获得暹罗芽孢杆菌MC2-1发酵液用于以下实施例。
优化实验分析
1.培养基优选
采用YSP、NYBD、NA、LB和CM五种培养基对菌株进行培养。如图1可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1在NYBD培养基上生长速度最快，OD值为2.23，其次是YSP培养基，OD值为1.93。
2.不同碳源对菌株生长速度的影响
采用麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉等五种碳源对菌株进行培养。图2可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1的最适碳源为麦芽糖，菌液OD值2.558。
3.不同氮源对菌株生长的影响
采用氯化铵、酵母、硝酸铵、甘氨酸、蛋白胨五种氮源对菌株进行培养。图3可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1在酵母浸粉上的生长速度最快。
4.接种量对菌株生长的影响
采用2％、4％、6％、8％、10％五种接菌量来筛选最适接菌量。图4可知，当暹罗芽孢杆菌MC2-1种子液与液体发酵培养基的体积百分比为2％-4％时OD值随接种量的增加而增加；体积百分比为4％-6％时，OD值的变化差异较小；，体积百分比为6％-8％时，OD值随着接种量的增加而增加；体积百分比为8％-10％时，OD值随着接种量的增加而增加，因此选定暹罗芽孢杆菌MC2-1体积百分比为4％-6％为最适接种量。
5.装液量对菌株生长速度的影响
菌株培养装液量设置了5个处理，分别为30ml、60ml、90ml、120ml、150ml。图5可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1最适装液量为30ml。
6.pH对菌株生长速度的影响
菌株培养pH设置7个处理，分别为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10。图6可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1最适生长pH值是6。
7.转速对菌株生长速度的影响
菌株培养转速设置了5个处理，分别为120r/min、150r/min、180r/min、210r/min、240r/min图7可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1在转速为180r/min时细菌生长速度最快。
8.温度对菌株生长的影响
菌株培养温度设置就6个处理，分别为20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃。图8可知，暹罗芽孢杆菌MC2-1在最适生长温度36℃。
9.时间对菌株生长的影响
菌株培养时间如图9所示，培养时间增加，暹罗芽孢杆菌MC2-1生长量增大，在60h时生长速度达到最大值。继续延长时间摇床培养，细菌生长速度开始减慢，OD值下降。
10.光照对菌株生长的影响
菌株培养光照时长如图10所示，暹罗芽孢杆菌MC2-1光照培养20h，细菌生长速度最快，生长量最多。
实施例2暹罗芽孢杆菌MC2-1发酵液对烟草疫霉病原菌的抑制作用
OA平板对峙培养实验结果表明，MC2-1对烟草疫霉Phytophthora nicotianae的抑制率为63％。
表1
Figure BDA0002816019630000051
实施例3暹罗芽孢杆菌MC2-1发酵液对烟草疫霉室内防治效果
MC2-1发酵液大田灌根，对烟草疫霉病的平均防效可达64％。
表2 MC2-1对黑胫病的防治效果
Figure BDA0002816019630000052
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一株保藏编号为CGMCC No.15974的暹罗芽孢杆菌MC2-1在制备防治烟草疫霉生物药剂中的应用。
2.一株保藏编号为CGMCC No.15974的暹罗芽孢杆菌MC2-1在制备抑制烟草疫霉病原菌生长制剂中的应用。
3.一种烟草疫霉抑制剂，其特征是，包含保藏编号为CGMCC No.15974的暹罗芽孢杆菌MC2-1。
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