CN105779367A - 一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9及其应用 - Google Patents

一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb‑9及其应用。该菌株于2016年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60028，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株对植物疫霉病菌、植物枯萎病菌和/或植物炭疽病菌等具有较强的抑制生长作用；并可在大豆、辣椒、香蕉等作物体内与根际土壤中定殖繁殖；并分泌产生抗菌蛋白以及吲哚乙酸等活性物质，具有促进作物生长以及防治多种植物病害的作用，可应用于研制与制备促进作物生长、提高作物产量和防治多种植物病害的生物有机肥和生物防病制剂等农用生物制剂，在相关的农业生产上具有很好的推广应用前景。

Description

一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域。更具体地，涉及一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9及其应用。
背景技术
肥料和农药是农业生产的必需品，其中化肥和化学农药因见效快、效果好、施用简单等优点，施用化肥和化学农药是促进和确保农业增产最快、最有效、最重要的措施之一.目前我国已成为世界最大的化肥和化学农药生产国和消费国，化肥和化学农药对提高我国农产品产量、满足日益增加的人口对农产品的需求等方面做出了巨大贡献。
但是，由于过度依赖和大量单一使用化肥和化学农药，不仅导致利用率下降，且现已普遍显现土壤板结、结构破坏、酸化、耕作层变薄、有机质含量下降以及病虫害发生加重、农产品品质变劣等一系列不良影响。为扭转和克服这些不利影响，在农业生产中减量化使用化肥和化学农药，以及增施生物有机肥和生物农药等农业措施，已成为促进和确保农业持续增产增收的重要措施和发展趋势。
研究结果表明，海洋中存在有大量的海洋微生物，且海洋微生物由于所处环境特殊，具有与陆源微生物所不具有的一些特异遗传和代谢特性，不仅可适应高盐、低温、高压、寡营养等海洋特殊环境，同时生长周期短、代谢易调控、菌种易选育、可通过大规模发酵实现产业化等特点，在农业生物制剂和医药等领域开发利用中具有独特优势，具有十分重要的研究价值和广阔的应用前景，并已有许多相关专利与成功事例。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种新的来自珊瑚的海洋解淀粉芽孢杆菌CoMb-9菌株，该菌株能进入植物体内及根土壤中定殖繁殖，能分泌吲哚乙酸等活性物质，具有促进植物生长的作用，还能够防治多种植物病害。
本发明的目的是提供一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9。
本发明另一目的是提供所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9，是从珊瑚上分离得到的海洋解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株于2016年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60028，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
该菌株菌体短直杆状，革兰氏染色阳性，产生芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。
一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物，是由所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9经过发酵培养所得。
优选地，所述发酵培养所用的培养基配方为：每1000mL蒸馏水中加入牛肉膏8.0～12.0g、葡萄糖20.0～30.0g、MgSO4 0.3～1.0g、KH2PO4 0.3～1.0g；
更优选地，所述发酵培养所用的培养基配方为：每1000mL蒸馏水中加入牛肉膏10.0g、葡萄糖25.0g、MgSO4 0.5g、KH2PO4 0.5g。
优选地，所述发酵培养的条件为：培养温度15～20℃、培养基初始pH7.0～7.5、培养时间50～60h、接种量1～5%、转速160～200rpm/min、装液量120/500mL～200/500mL。
更优选地，所述发酵培养的条件为：培养温度18℃、培养基初始pH7.3、培养时间54h、接种量2%、转速180rpm/min、装液量150/500 mL。
该菌株对植物疫霉病菌（如Phytophthora sojae、P.capsici、P. infestans、P.colocasiae、P. nicotianae等）、植物枯萎病菌（如Fusarium oxysporum f.sp. cubense、F. oxysporum f.sp. niveum等）、植物炭疽病菌（如Colletotrichum musae、C.gloeosporioides等）等具有抑制生长作用；并可在大豆、辣椒、香蕉等作物体内与根际土壤中定殖繁殖；并分泌产生抗菌蛋白以及吲哚乙酸等活性物质，具有促进作物生长以及防治植物病害的作用。
因此，该菌株或其发酵物在抑制上述植物病原菌或在制备防治上述植物病原菌引起的植物病害的药剂中的应用，以及在植物疫霉病、植物枯萎病和/或植物炭疽病的防治，以及在制备防治植物疫霉病、植物枯萎病和/或植物炭疽病的药物方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。
优选地，所述植物疫霉病菌为大豆疫霉菌或辣椒疫霉菌。
优选地，所述植物枯萎病菌为香蕉枯萎病菌或西瓜枯萎病。
优选地，所述植物炭疽病为香蕉炭疽病或芒果炭疽病。
另外，上述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9及其发酵物在促进植物生长或在制备植物生长促进剂或在制备生物有机肥方面的应用，以及在制备抗菌蛋白或吲哚乙酸方面的应用，也都在本发明的保护范围之内。所述抗菌是指抗植物疫霉病菌、植物枯萎病菌和/或植物炭疽病菌。
优选地，所述应用于促进植物生长或制备植物生长促进剂是指应用于促进大豆生长或制备大豆生长促进剂。
一种抗菌蛋白，是由所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵液提取所得，所述抗菌是指抗植物疫霉病菌、植物枯萎病菌和/或植物炭疽病菌等植物病原菌物。
另外，上述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9在促进大豆、辣椒、香蕉等农作物生长方面的应用，应用方法包括以下步骤：
取菌株CoMb-9在GBE培养基中的菌株培养液（含菌量1～2×108-9cfu/mL），于大豆、辣椒、香蕉等农作物苗期喷雾于苗上或种植移栽后浇灌于苗基部，每20～30天浇灌菌株培养液一次。
上述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9在预防大豆疫病、辣椒疫病、香蕉枯萎病等植物病害方面的应用，应用方法包括以下步骤：
取菌株CoMb-9在GBE培养基中的菌株培养液（含菌量1～2×108-9cfu/mL），于大豆、辣椒、香蕉等农作物种植移栽后浇灌于苗基部，每20～30天浇灌菌株培养液一次。
本发明具有以下有益效果：
本发明的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9可在植株体内和根际土壤中定殖繁殖，定殖时间达30～40天以上。
本发明的海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9可分泌产生吲哚乙酸等活性物质，对植物具有良好的生长促进作用，可用于农业生产，具有促进植物生长、提高产量的作用。
本发明的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9可分泌产生抗菌蛋白等活性物质，对植物病原菌具有抑制作用，例如对大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、香蕉枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌等多种植物病原菌均有抑制作用，可用于农业生产上植物病害的防治。
本发明的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9可用于研制制备生物有机肥和生物农药等农用生物制剂，在农业生产上具有很好的应用前景。
附图说明
图1为CoMb-9菌株的抑菌作用图；A：疫霉病菌；B：枯萎病菌；C：炭疽病菌。
图2为菌株CoMb-9 16S rDNA、gyrA及yyaO/yyaR基因扩增结果。
图3为CoMb-9菌株16S rDNA序列系统发育树。
图4为 CoMb-9菌株基于gyrA基因序列系统发育树。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的分离鉴定
1、菌株的分离
取健康珊瑚活体，经无菌蒸馏水表面清洗后，加无菌海水碾碎，静置后取浸出液涂布于海水营养琼脂培养基平板上，25℃黑暗培养48～72小时后，挑选圆形、淡乳黄色、中间隆起、不透明、表面粗糙干燥、边缘有细齿状的单菌落，纯化后以海水NA培养基暂时保存于4℃冰箱中。
其中，所述海水营养琼脂培养基的配方：牛肉浸膏3.0 g，酵母膏1.0 g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0 g，琼脂20.0 g，陈海水1000 mL，pH值7.0-7.5；简称海水NA。
2、抗菌实验
进一步以对峙生长法测定上述所分离细菌菌株对植物病原菌的拮抗作用，从中筛选到对植物疫霉病菌（如Phytophthora sojae、P.capsici、P. infestans、P. colocasiae、P.nicotianae等）、植物枯萎病菌（如Fusarium oxysporum f.sp. cubense、F. oxysporumf.sp. niveum等）、植物炭疽病菌（如Colletotrichum musae、C. gloeosporioides等）等植物病原菌均有较强抑制作用的海洋细菌菌株（如附图1所示）。
3、鉴定
（1）该菌株的形态特征为：菌体短直杆状，革兰氏染色阳性，产生芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。
（2）该菌株的生理生化测结果如表1所示。
表1 菌株CoMb-9生理生化测试结果
注: +，表示呈阳性反应；–，表示呈阴性反应。Note: +, positive; –, negative.
（3）基因鉴定：
16S rDNA、gyrA和yyaO/yyaR等基因序列分析结果：
基因扩增结果如附图2所示。
经BLAST对比分析和MEGA 5.0构建系统发育树，如附图3、4所示。
经过上述结果，该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），命名为珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9，该菌株于2016年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60028，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2 菌株CoMb-9分泌产生的抑菌活性物质以及培养条件的优化
1、为了使菌株CoMb-9更好的分泌产生抑菌活性物质，经单因子和响应面等方法测定优化菌株的培养条件，包括培养基、培养温度、培养基初始pH、培养时间、接种量、转速、装液量等等。
2、结果
结果显示，本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9分泌产生抑制大豆疫霉菌等植物病原菌的活性物质的最佳培养基为GBE培养基，其配方为：牛肉膏10.0g、葡萄糖25.0g、MgSO4 0.5g、KH2PO40.5g、蒸馏水1000mL。
最佳培养条件为：培养温度18℃、培养基初始pH7.3、培养时间54h、接种量2%、转速180rpm/min、装液量150/500 mL。
经过上述条件优化培养后，CoMb-9菌株发酵液对大豆疫霉菌等植物病原菌的抑菌效果增加了20%以上。
3、经硫酸铵盐析等分析证明，CoMb-9菌株分泌产生的抑菌物质主要为抗菌蛋白类物质，且该抗菌蛋白类物质对热处理和紫外线照射均有较高的稳定性。
实施例3 菌株CoMb-9在大豆体内的定殖
1、本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9通过诱导对利福平的抗性，获得可在利福平浓度为500μg/mL中生长并同时可拮抗大豆疫霉病菌（Phytophthorasojae）的双抗标记CoMb-9Rif菌株，取双抗标记CoMb-9Rif菌株发酵液（浓度为1.0×107cfu/mL）均匀浇灌大豆植株根围土壤，以无菌水为对照，处理后用含利福平培养基回收大豆体内的标记菌株，并测定回收菌株对大豆疫霉菌的拮抗作用。
2、结果表明（表2），标记菌株CoMb-9Rif灌根处理后从大豆根茎叶内均可分离到标记菌株，表明该菌株可进入大豆植株体内定殖，且定殖时间可达41d以上。
表2 标记菌株灌根接种后在大豆体内定殖测定结果
注：小写字母表示相同部位在不同时间的差异显著性(P<0.05)。
实施例4 菌株CoMb-9对大豆促进生长作用
1、本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9于GBE培养基发酵，得发酵培养液。
2、取CoMb-9菌株发酵培养液（浓度约为1.0×109 cfu/mL）均匀浇灌于子叶充分展开的大豆苗根部，每5天浇灌一次，连续浇灌3次，以清水和空白培养基为对照，每个处理重复3次，处理后15天取样测定。
3、结果表明（表3），菌株发酵培养液处理的大豆株高、茎粗、鲜重、干重、根长等均比对照组有显著提高。进一步测定分析发现，菌株发酵培养液处理后的大豆植株中的叶绿含量、光合作用强度、根系活力等均比清水和培养基对照有显著增加或增强。说明本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9发酵液对大豆生长具有显著的促进生长作用。
表3 CoMb-9菌株发酵液不同处理对大豆植株生长影响测定结果
注：小写字母表示相同部位在不同时间的差异显著性(P<0.05)。
另外，进一步测定分析发现，所述CoMb-9菌株可分泌产生吲哚乙酸等活性物质。
实施例5 菌株CoMb-9对大豆疫病的防治作用
1、同实施例4，取本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的GBE培养基发酵培养液，浇灌于大豆苗根部，24h后接种大豆疫霉菌，每处理重复3次，以清水和培养基处理为对照。
2、防病结果表明（表4），CoMb-9菌株对大豆疫病具有良好的防治效果。
表4 CoMb-9菌株发酵培养液防治大豆疫病测定结果
实施例6 菌株CoMb-9对辣椒疫病的防治作用
1、取本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的GBE培养基发酵培养液，浇灌于辣椒苗根部，24h后接种辣椒疫霉菌，每处理重复3次，以清水和培养基处理为对照。
2、防病结果表明，CoMb-9菌株对辣椒疫病的防治效果与防治大豆疫病的效果相似（参见表4）。
实施例7 菌株CoMb-9对香蕉枯萎病的防治作用
1、取本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的GBE培养基发酵培养液，于香蕉移栽时浇灌于香蕉苗根部，每个月浇灌菌株发酵培养液一次，以清水处理为对照。
2、防病结果表明，CoMb-9菌株对对香蕉枯萎病有55～75%以上的防治效果。
实施例8 菌株CoMb-9对西瓜枯萎病的防治作用
1、取本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的GBE培养基发酵培养液，于西瓜移栽时浇灌于西瓜苗根部，每个月浇灌菌株发酵培养液一次，以清水处理为对照。
2、防病结果表明，CoMb-9菌株对对西瓜枯萎病有50～65%以上的防治效果。
实施例9 菌株CoMb-9对香蕉炭疽病的防治作用
1、取本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的GBE培养基发酵后除菌培养液，喷雾于采后香蕉果，待果面液体自然晾干后立即喷雾接种香蕉炭疽病菌，以清水处理为对照。
2、防病结果表明， CoMb-9菌株培养液对香蕉炭疽病有50～65%以上的防治效果。
实施例10 菌株CoMb-9对芒果炭疽病的防治作用
1、取本发明所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的GBE培养基发酵后除菌培养液，喷雾于采后芒果果，待果面液体自然晾干后立即喷雾接种芒果炭疽病菌，以清水处理为对照。
2、防病结果表明，CoMb-9菌株培养液对芒果炭疽病有55～70%以上的防治效果。

Claims (10)

1.一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9，其特征在于，该菌株于2016年4月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60028，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.根据权利要求1所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9，其特征在于，该菌株菌体短直杆状，革兰氏染色阳性，产生芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。
3.一种珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物，其特征在于，是由所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9经过发酵培养所得。
4.根据权利要求3所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物，其特征在于，所述发酵培养所用的培养基配方为：每1000mL蒸馏水中加入牛肉膏8.0～12.0g、葡萄糖20.0～30.0g、MgSO4 0.3～1.0g、KH2PO4 0.3～1.0g；所述发酵培养的条件为：培养温度15～20℃、培养基初始pH7.0～7.5、培养时间50～60h、接种量1～5%、转速160～200rpm/min、装液量120/500mL～200/500mL。
5.根据权利要求3所述的珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物，其特征在于，所述发酵培养所用的培养基配方为：每1000mL蒸馏水中加入牛肉膏10.0g、葡萄糖25.0g、MgSO4 0.5g、KH2PO4 0.5g；所述发酵培养的条件为：培养温度18℃、培养基初始pH7.3、培养时间54h、接种量2%、转速180rpm/min、装液量150/500 mL。
6.权利要求1或2所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9或权利要求4或5所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物在制备防治植物病害的药剂中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述植物病害为植物疫霉病、植物枯萎病和/或植物炭疽病。
8.权利要求1或2所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9或权利要求4或5所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物在促进植物生长或在制备植物生长促进剂或在制备生物有机肥方面的应用。
9.权利要求1或2所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9或权利要求4或5所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵物在制备抗菌蛋白或吲哚乙酸方面的应用，其特征在于，所述抗菌是指抗植物疫霉病菌、植物枯萎病菌和/或植物炭疽病菌。
10.一种抗菌蛋白，其特征在于，所述抗菌蛋白由所述珊瑚共附生海洋解淀粉芽孢杆菌菌株CoMb-9的发酵液提取所得，所述抗菌是指抗植物疫霉病菌、植物枯萎病菌和/或植物炭疽病菌。
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