CN112553109B - 一株铜绿假单胞菌y12及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株铜绿假单胞菌Y12及其应用，属于农业微生物技术领域，本发明提供的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），菌株编号为Y12，保藏编号为CGMCC No.15977，分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。该铜绿假单胞菌Y12发酵液Y12对烟草赤星病菌Alternaria alternata具有较好的抑制作用，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发，用于烟草赤星病菌的防控，效果好成本低。

Description

一株铜绿假单胞菌Y12及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体的说，涉及一株铜绿假单胞菌Y12及其在防治烟草赤星病中的应用。
背景技术
烟草赤星病是在烟草成熟期发生的一种真菌性叶斑类病害,不但会影响烤烟产量、产值,还会影响烟叶的评吸质量。在我国,烟草赤星病在烟草产区发生较普遍,一般烟田发病率为5％～10％,重病田达10％～20％,严重发病田甚至可达50％以上,是烟草生产上威胁最大的病害之一。目前烟草生产中化学防治是防治烟草赤星病的重要措施,缺点是容易引起病原菌产生耐药性、造成农药残留和污染环境.随着对烟草及烟草制品安全性要求的提高,减少化学农药使用、生产绿色产品已经成为农业生产中新的发展方向。因此,生物防治越来越引起烟草界的关注。
筛选烟草赤星病菌拮抗菌是实施生物防治的一项重要工作,也是国内外科研工作者研究的热点,对于解决烟草生产中农药残留及环境保护方面都具有重要意义。相应地，针对烟草赤星病的微生物农药研发也成为近年来烟草赤星病领域的一个主要方向，但目前主要从植物及根际土壤中筛选赤星病的生防菌，但其它来源的生防菌涉及很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一株铜绿假单胞菌及其对烟草赤星病菌的防治应用，以该铜绿假单胞菌为活性成分的菌剂用于烟草赤星病菌的防控，效果好，成本低。
本发明技术方案如下：
本发明所提供的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，菌株编号为Y12；该菌株已于2018年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCCNo.15977，分类命名：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。
本发明提供的菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Y12 CGMCCNo.15977的生物学特性为：
LB培养基(LB Medium)培养的菌落为菌落直径2-7mm，不规则，由黄褐色渐变为褐绿色，扁平，产色素，表面光滑湿润。菌体椭球形，0.42-1.13μm，无芽孢，革兰氏阴性菌，淀粉水解实验阴性，油脂水解实验阳性，石蕊牛奶实验阴性，明胶液化阳性，尿素实验阴性；发酵葡萄糖既阴性；吲哚实验阳性，柠檬酸盐实验阳性，甲基红阴性，硫化氢实验阴性。
本发明提供的菌株铜绿假单胞菌Y12是从美洲大蠊消化道筛分而来的。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Y12的制备方法：将铜绿假单胞菌Y12菌液接种于NYBD培养基上，在温度28℃、pH值为7的条件下培养；Y12的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母。
本发明的另一个目的在于提供了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Y12的应用，该菌株可用于制备防治烟草赤星病菌生物药剂，或制备抑制烟草赤星病病原菌生长制剂，或制备真菌抑制剂。
本发明的有益效果：
本发明提供的铜绿假单胞菌Y12发酵液Y12对烟草赤星病菌Alternariaalternata具有较好的抑制作用，可将其作为活体菌剂和代谢产物的剂型加工开发，用于烟草赤星病菌的防控，效果好成本低。
附图说明
图1是不同培养基对拮抗细菌生长的影响；
图2是不同碳源对菌株生长速度的影响；
图3是不同氮源对菌株生长的影响；
图4是接种量对菌株生长的影响；
图5是装液量对菌株生长速度的影响；
图6是pH对菌株生长速度的影响；
图7是转速对菌株生长速度的影响；
图8是温度对菌株生长的影响；
图9是时间对菌株生长的影响；
图10是光照对菌株生长的影响；
图11是菌株进化树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1铜绿假单胞菌Y12的分离筛选与发酵培养
一、分离筛选
美洲大蠊是山东第一医科大学病媒生物与虫媒病实验室饲养的品系，已在实验室内连续传代饲养15年。在分离铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa时，首先将美洲大蠊成虫体表以75％酒精漂洗3次，每次2分钟，再用无菌水漂洗3次后解剖，获得完整的美洲小蠊消化道。
1.灭菌：所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30分钟。
2.研磨：将美洲大蠊消化道剪碎后放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒充分研磨。
3.梯度稀释：取研磨后的汁液1ml，放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-1稀释度的菌液，再从10-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-2稀释度的菌液，以此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的菌液。
4.培养基的配置：细菌的分离常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)，纯化常用LB培养基。
NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；pH 7.0，121℃灭菌20min。
倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。
5.涂布：将稀释菌液10-4、10-5、10-6、10-7分别涂布于平板上，每个梯度涂3皿，并在皿底做上标记。
6.培养：倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。
7.菌的纯化：在无菌条件下用挑针将NA培养基上长出的单菌落挑取于LB培养基上划线培养；纯化3-4次可得纯化后的单菌落。
二、菌种发酵培养
将铜绿假单胞菌Y12菌液接种于NYBD培养基上，在温度28℃、pH值为7、转速220r/min、装液量20ml、接种量0.1％、时间60h、光照8h的条件下培养，获得铜绿假单胞菌Y12发酵液用于以下实施例。
优化实验分析
1.培养基优选
采用YSP、NYBD、NA、LB和CM五种培养基对菌株进行培养。如图1可知，铜绿假单胞菌Y12在NYBD培养基上生长速度最快，OD值为2.25，其次是YSP培养基，OD值为2.03。
2.不同碳源对菌株生长速度的影响
采用麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉等五种碳源对菌株进行培养。图2可知，铜绿假单胞菌Y12的最适碳源为葡萄糖，菌液OD值2.07。
3.不同氮源对菌株生长的影响
采用氯化铵、酵母、硝酸铵、甘氨酸、蛋白胨五种氮源对菌株进行培养。图3可知，铜绿假单胞菌Y12在酵母浸粉上的生长速度最快。
4.接种量对菌株生长的影响
采用0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、2.5％、3％进行接菌。图4可知，接菌量为0.1％时，Y12细菌的生长速度最快。
5.装液量对菌株生长速度的影响
菌株培养装液量设置了5个处理，分别为20ml、40ml、80ml、120ml、160ml。图5可知，铜绿假单胞菌Y12最适装液量为20ml。
6.pH对菌株生长速度的影响
菌株培养pH设置7个处理，分别为pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10。图6可知，铜绿假单胞菌Y12最适生长pH值是7。
7.转速对菌株生长速度的影响
菌株培养转速设置了5个处理，分别为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min。图7可知，铜绿假单胞菌Y12在转速为220r/min时细菌生长速度最快。
8.温度对菌株生长的影响
菌株培养温度设置就6个处理，分别为16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃。图8可知，铜绿假单胞菌Y12在最适生长温度28℃。
9.时间对菌株生长的影响
菌株培养时间如图9所示，培养时间增加，铜绿假单胞菌Y12生长量增大，在60h时生长速度达到最大值。继续延长时间摇床培养，细菌生长速度开始减慢，OD值下降。
10.光照对菌株生长的影响
菌株培养光照时长如图10所示，铜绿假单胞菌Y12光照培养8h，细菌生长速度最快，生长量最多。
实施例2铜绿假单胞菌Y12发酵液对烟草赤星病菌的抑制作用
OA平板对峙培养实验结果表明，Y12对烟草赤星病菌Alternaria alternata的抑制率为54％
表1
Figure BDA0002826624050000051
实施例3铜绿假单胞菌Y12发酵液对烟草赤星病菌室内防治效果。
表2 Y12对烟草赤星病菌的防治效果
Figure BDA0002826624050000052
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一株铜绿假单胞菌Y12，其特征在于：所述铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa），菌株编号为Y12，保藏编号为CGMCC No.15977，分类命名为铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa。
2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌Y12的制备方法，其特征在于：将铜绿假单胞菌Y12菌液接种于NYBD培养基上，在温度28℃、pH值为7的条件下培养；Y12的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母。
3.权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌Y12在制备防治烟草赤星病菌生物药剂中的应用。
4.权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌Y12在制备抑制烟草赤星病菌生长制剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的铜绿假单胞菌Y12在制备真菌抑制剂中的应用，其特征在于：所述的真菌为烟草赤星病。
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