CN102703353A - 一株防治烟草角斑病的生防菌株pa-2 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物保护技术领域，公开了一株防治烟草角斑病的生防菌株PA-2，为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，菌株已于2012年3月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCCNo.5937。用所述的生防菌株PA-2制备的生防菌液总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。所述的生防菌液可在防治烟草角斑病方面应用，是一株极具研究开发价值的菌株。

Description

一株防治烟草角斑病的生防菌株PA-2

技术领域

本发明涉及一株生防菌株PA-2，该菌株为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，能够防治烟草角斑病，属于植物保护技术领域。 

背景技术

烟草角斑病是由假单胞杆菌属丁香假单胞菌烟草致病变种[Pseudomonas syingae pv.tabaci (Wolf et Foster.)]侵染引起的，是危害严重的、具有毁灭性的烟草细菌性病害之一。目前烟草角斑病已遍布亚洲、非洲、欧洲及南北美洲各地的主产烟区，在环境条件有利于病害发生的情况下可造成烟草绝产。 

2003~2007年，我国烟草角斑病年发病面积约3.33万hm² ，每年造成的产值损失2643 ~5782万元。近年，北方烟区角斑病再度流行，并成为烟草的主要病害之一（李发新、胡玉梅等编写的《济源市王屋烟区烟草角斑病发生原因及防控对策》，中国植保导刊，2008，p31~32）。 

目前采用轮作等农业技术预防烟草角斑病的发生有相当的难度；而长期大量使用化学药剂，病原菌已产生抗药性，同时对烟叶出口和卷烟安全性带来不利影响；而且国内外尚未培育出抗角斑病的品种。 

 因此，为经济有效防治烟草角斑病，生物防治成为了最直接的途径，而筛选稳定而高效的有益微生物是保证生物防治获得成功的条件之一。 

 近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌的生存和活动，使这一防治策略发展迅速，其中生防细菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用，无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，细菌的作用是非常明显的。 

生防细菌用来防治植物病害其主要优势在于：1) 细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；2) 细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、生防和寄生、诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；3) 具有惊人的繁殖速度；4) 许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适应；5) 细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6) 有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物的产量（程亮、游春平等编写的《生防细菌的研究进展》，江西农业大学学报，2003，p732~737）。 

 综上所述，开发新的、更为高效和安全的菌株控制烟草角斑病的发生是提高烟草生产总量的需要，同时更是农业安全可持续发展的需要，符合社会发展需求。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中没有对烟草角斑病有较好的生防菌株的现状，提供一株防治烟草角斑病的单一生防菌株。 

 本发明的另一目的是提供该菌株的应用方法。 

本发明所述的假单胞杆菌，其特征在于：经鉴定该菌株（PA-2）为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，菌株已于2012年3月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No. 5937。 

所述的生防菌PA-2（保藏号为CGMCC No. 5937）菌液，通过如下方法制备：将权利要求1所述的菌种保藏号为CGMCC No. 5937的生防菌株PA-2在优化培养液中28℃ 180r/min振荡培养24h，然后用无菌水进行6倍稀释，配成浓度约为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL的菌液。 

上述生防菌液防治烟草角斑病的方法为：PA-2菌液在烟草团棵期喷施于烟草叶片上，每隔5d喷施一次，共喷施三次。 

有益效果： 

本发明是专门针对烟草角斑病开发的生防菌。由于是生防菌，完全没有因为化学农药的使用所带来的一系列问题，因此有利于烟草业的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，减少了农民的开支。

大田实验表明：该菌液能显著降低烟草角斑病的发生。培养24h的该菌液可以稀释6倍后在烟草团棵期进行喷施处理，每隔5d喷施一次，共喷施三次。不遇暴风雨天气的情况下防效可以达到58.03%，经发酵条件优化后防效可以达到69.77%。 

生物材料保藏信息 

防治烟草角斑病的生防菌株PA-2，为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，于2012年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院研究所，菌种保藏号为CGMCC No. 5937。

具体实施方式

实施例1能够防治烟草角斑病的生防细菌-铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2的筛选 

具体步骤如下：

稗草中细菌的分离：从稗草植株上用灭菌剪刀剪下约2 g放置于灭过菌的研钵中，加1 mL无菌水研磨成匀浆，将匀浆10倍系列稀释至10^- 7倍，将10^- 4至10^- 7稀释液各吸取100 μL涂于NA平板上，每浓度设 3 次重复，28℃培养2~3 d。挑取不同类型的菌落，在NA平板上划线纯化培养后，挑取单个菌落移入PDA斜面编号保存备用；也可编号保存于40%甘油中置-80℃冰箱中保存。

细菌发酵液的制备：分别挑取烟草角斑病菌和从稗草中分离到的细菌培养物分别放入装50 mL NB培养液的250 mL三角瓶中，将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中28℃下180 r/min震荡培养24h，并用无菌水配制成浓度为3×10⁸ cfu/mL的菌悬液备用。 

生防细菌的筛选：取5 mL病原菌发酵液，加入到冷却至55℃的100 mL 灭菌NA培养基中，混匀，倒入灭菌的培养皿中，冷却成平板。用移液枪吸取70 μL待测细菌菌悬液在冷却好的平板上划线，以未接菌的等量NB培养液为空白对照，实验设3次重复。28℃培养2~3d后观察，具有一定抑菌带宽度的即为所需要的菌株。 

经筛选，得到抑菌直径最大的菌株PA-2，抑菌带宽为15.3 mm，经鉴定为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。该菌株已于2012年3月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No. 5937。 

菌株PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）的形态特征是：在NA培养基上菌株生长良好，单菌落形态为圆形或近圆形，扁平状且周围不规则，中等大小，表面光滑，半透明，产生蓝绿色色素，周围产生蓝绿色晕圈，且随着培养时间的延长，培养基的蓝绿色变深，菌落表面呈现黏稠状。革兰氏染色为阴性，菌体杆状，不产生芽孢。经NB培养液震荡培养，菌液呈绿色。 

菌株PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）部分生理生化特征是：革兰氏染色为阴性，最适生长温度28℃，在4℃下不能生长，41℃生长良好。能够利用葡萄糖、柠檬酸盐，不能利用蔗糖，能够产生脓青素，具有运动性。生理生化实验结果详见表1. 

表1 菌株PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）的部分生理生化特征

注：“+”表示生长良好或成阳性；“－”表示不生长或成阴性。

上述用于菌体形态观察的液体培养基（NB培养液）组成：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0~7.2，121℃下高温蒸汽灭菌30 min。 

上述用于具体形态观察的固体培养基（NA培养基）组成：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，琼脂粉15.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0~7.2，121℃下高温蒸汽灭菌30 min。 

上述形态特征观察的实验方法参考沈萍、范秀荣等编著的《微生物学实验》，高等教育出版社，2003，第三版，p116-120；钱存柔、黄仪秀编著的《微生物学实验教程》，北京大学出版社，2008，p113-129。 

上述生理生化实验培养基配方及实验方法参考车秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。 

上述铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）是从云南采摘的稗草植株上以常规方法分离筛选得到的。 

实施例2铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）发酵条件的优化 

菌种选用铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）

具体步骤如下：

单因子实验：以NB培养液为基础培养基，选取不同单一碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖、甘露醇麦芽糖、可溶性淀粉和甘油，用量0.5%）；在碳源不变情况下，选取不同单一有机氮源（胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏和酵母膏，用量1%）、不同单一无机氮源（NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、KNO₃和NH₄NO₃，用量1%）；在较优碳源、氮源情况下，加入不同浓度的NaCl（0.1%、0.3%和0.5%）；较优碳源、氮源和NaCl中，加入不同浓度的无机氮源（0.1%、0.3%和0.5%）。测定各条件下对烟草角斑病菌的抑菌活性，并测定各单一条件的最适浓度。

培养基优化正交实验：依据单因素实验结果，选取较优碳源不同浓度（0.1%、0.3%和0.5%）、较优有机氮源不同浓度（0.5%、1%和2.0%）、较优无机氮源不同浓度（0.1%、0.3%和0.5%）、不同NaCl浓度（0.1%、0.3%和0.5%）。通过对这些条件的3种浓度组合进行4因素3水平的正交实验，测定各条件下对烟草角斑病菌的抑菌活性。 

培养条件的优化实验：采用优化后的发酵培养基，在不同培养温度（25℃、28℃、33℃、36℃和39℃）、不同培养基pH（4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0）、不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%、8%和 10%）和不同通气量（250 mL三角瓶中分别装20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL和 80 mL）条件下培养生防菌株，28℃震荡培养2~3 d后，测定各条件下对烟草角斑病菌的抑菌活性。 

经上述具体步骤后，确定生防细菌PA-2的最佳实验室发酵配方为：氮源1%（牛肉膏：蛋白胨=3：5），葡萄糖0.3%，NaCl 0.5%，KNO₃ 0.3%；最佳培养条件为：发酵温度28℃，培养基pH 7.0~7.5，接种量4%，装液量为250 mL 三角瓶中装液50 mL，180 r/min震荡培养24h。抑菌带宽度达17.6 mm。 

实施例3铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）对烟草角斑病的田间药效试验。 

菌种选用铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2（保藏号CGMCC No. 5937） 

每小区烟株15株，株距0.9 m×0.5 m。共设5个处理：A 生防菌PA-2活菌发酵液（6倍稀释液）；B生防菌PA-2优化发酵液（6倍稀释液）；C NB培养液对照（6倍稀释液）；D优化的NB培养液对照（6倍稀释液）；E药剂农用链霉素（3000倍液）。采用随机区组排列，重复3次。各处理在团棵期采用高压喷雾法进行第一次喷雾，A、B、C、D、E分别喷施各处理液，每处理喷雾2 L。两天后各处理均喷施病原菌，喷施病原菌后5d进行第一次调查，并进行第二次喷施各处理液（同第一次）。喷施5d后进行第二次进行调查，并进行第三次喷施各处理液（同第一次），喷施5d后进行第三次调查。

调查方法：每小区调查10株烟株，每株调查中下部叶片10片，以每片叶病斑面积占整个叶片面积的百分比分级，记录总叶片数、各级病叶数，计算病情指数及防治效果。 

上述调查方法参考中华人民共和国烟草病害分级标准（YC T 39-1996）进行。 

计算病情指数和防效的公式为： 

上述试验所使用的药剂农用链霉素为15~20%可湿性粉剂，由瑞田生化有限公司生产，结果如表2所示。

表2铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PA-2（保藏号CGMCC No. 5937）对烟草角斑病的田间防效 

注：A 生防菌PA-2活菌发酵液，B生防菌PA-2优化发酵液，C NB培养液对照（A的对照），D优化的NB培养液对照（B的对照），E对照药剂农用链霉素

农用链霉素防效E（1/2）：数据1是根据对照C计算，数据2是根据对照D计算。

Claims (4)

1.一株用于防治烟草角斑病的生防菌株PA-2，为铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，该菌株已于2012年3月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No. 5937。

2.权利要求1所述的菌种保藏号为CGMCC No. 5937的生防菌株PA-2在制备防治烟草角斑病的生防菌液中的应用。

3.根据权利要求2所述的生防菌液，其特征在于通过如下方法制备：将权利要求1所述的菌种保藏号为CGMCC No. 5937的生防菌株PA-2在优化后的NB培养液和最佳培养条件下进行培养，然后用无菌水进行6倍稀释，配成浓度约为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL的菌液。

4.权利要求3所述的优化后的NB培养液组分为：氮源1%（牛肉膏:蛋白胨=3:5），葡萄糖0.3%，NaCl 0.5%，KNO₃ 0.3%；最佳培养条件为：发酵温度28℃，培养基pH 7.0~7.5，接种量4%，装液量为250 mL 三角瓶中装液50 mL，180 r/min震荡培养24h。