CN109207412B - 一种抗青枯病生防菌株及其应用 - Google Patents

一种抗青枯病生防菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及青枯病的防治技术，具体的说是一种抗青枯病生防菌株及其应用。抗青枯病生防菌株SY‑SF‑03属于链霉菌属(Streptomyces)中的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)已于2018年5月14日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M2018265。本发明通过东北林地筛选、分离得到一株抗青枯病菌株，经鉴定为委内瑞拉链霉菌，可以拮抗青枯病致病菌青枯雷尔氏菌，其发酵代谢产物可抑制病原菌的生长繁殖，防治青枯病的发生。

Description

一种抗青枯病生防菌株及其应用
技术领域
本发明涉及青枯病的防治技术，具体的说是一种抗青枯病生防菌株及其应用。
背景技术
细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一类毁灭性土传病害，此病菌可危害44个科300多种植物，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，该病害危害较重分布较广的寄主主要有马铃薯、番茄、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、甘茹、麻等。细菌性青枯病是危害最大，分布最广，损失最重的植物病害之一，近年来，随着全球性气候变化，气温上升，细菌性青枯病的危害逐年加重，成为一些地区农业生产主要障碍。
目前，针对青枯病的防治手段主要是提高植物的抗性，实现耕作控制、药剂防治和生物防治等，但由于青枯雷尔氏菌长期存活性和寄主范围多样性，导致至今尚无有效的化学农药和其他防治办法。早期，针对作物青枯病的防治，国内外专家在抗病品种选育、化学防治、农业措施等方面进行了大量的研究，但仍存在一些问题，如品种抗病性能低，抗性易丧失；化学防治药剂后期防效差，病菌易产生抗药性，且容易造成环境污染与作物药剂残留；强化栽培管理措施，通过调节酸碱度，结合整地施用适量的生石灰，使土壤呈微碱性，可抑制病菌生长，减少发病率。此类方法虽然在一定程度上能够达到防治效果，但其费工费时，施用要均匀，易对植株伤害；且受地域条件限制，难于大面积推广。
生物防治由于其对环境、生态和人畜的安全性而受到了国内外研究者的广泛关注，其主要是通过施用拮抗菌、有机肥或生物有机肥等措施调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性，从而抑制土传病害的发生。近年来有许多拮抗细菌如放线菌、芽胞杆菌、假单胞杆菌等被应用到农作物中防治青枯病，能有效控制植物病害的放线菌主要是链霉菌属。放线菌一方面通过寄生于植物组织内诱导产生抗生素对致病菌发挥生防作用，另一方面可以通过抗生作用、竞争作用、重寄生和捕食作用降低病原菌的致病性和侵染性，从而达到防治的效果。因此，分离和筛选原位土壤中的拮抗菌，能增强定植能力，提高防治效果。如CN107083348 A公开了一种兼具土壤改良和青枯病防治作用的复合菌剂及其制备方法。该发明菌剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌按一定比例混合复配而成，土壤中施入菌剂后通过菌种间的拮抗作用、竞争作用与土壤中的其他菌群争夺土壤中的营养成分，抑制有害菌的生长繁殖，可以起到改善土壤微生物群落结构的作用，但是微生物间的竞争作用周期较长，一旦作物青枯病发生，很难起到防治效果。此专利中由五种菌复配，生产过程复杂，操作不方便。
CN103289924 B公开了一株具有抗菌作用的链霉菌及其应用。此发明提供了一株链霉菌GIM.116，其代谢产物具有抗菌活性，其抗菌仅是对具有多重耐药性的大肠杆菌和金黄色葡萄糖球菌具有较好的抑制作用，但其代谢产物使用时，需要经乙酸乙酯有机溶剂萃取，不易于规模化生产及大面积农田推广使用。
CN102146350 B公开了防治生姜青枯病的生防菌株3YW8，为一株拟气味类香菌，属于细菌种类，对生姜青枯病防治通过竞争作用抑制病原菌的生长，专利中对生姜青枯病的防效为59.68％，防治效果不是很理想，因此,急需针对不同作物对象的该类病菌的高效生防抑制菌。
发明内容
本发明目的在于提供一种抗青枯病生防菌株及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种抗青枯病生防菌株，抗青枯病生防菌株SY-SF-03属于链霉菌属(Streptomyces)中的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)已于2018年5月14日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M2018265。
所述菌株从东北林地筛选、分离得到一株抗青枯病的拮抗菌，采用基因组提取试剂盒提取该菌的16S rRNA交由苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank中序列比对，鉴定为委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)，命名为SY-SF-03。
一种抗青枯病生防菌株的应用，所述菌株在防治抗青枯病中的应用。
一种生防菌剂，由所述抗青枯病生防菌株制备得生防菌剂。
所述抗青枯病的生防菌剂为该菌株的培养物、培养浓缩物、培养菌悬液、发酵液或发酵分离上清液。
所述发酵液的制备方法为：将所述菌活化后，以6-10％v/v接种量接种于高氏1号培养基、查氏培养基或TSB培养基中发酵培养5-10d，即得发酵液。
所述培养浓缩物为将所述发酵液经二氯甲烷、乙酸乙酯或正丁醇等有机溶剂萃取浓缩后所得物质。
进一步的说，采用平板对歭试验考察该菌株对青枯雷尔氏菌的抑制效果，平板中抑菌圈直径达到42mm，可以判断菌株SY-SF-03对青枯雷尔氏菌有较强的拮抗性能。采用高氏1号培养基对菌株SY-SF-03发酵培养7d，离心除去菌体，收集上清液，依次使用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇有机溶剂萃取，收集萃取相与萃取余相，发现发酵上清液、正丁醇萃取相、萃取余相可以抑制青枯雷尔氏菌的生长繁殖，说明菌株SY-SF-03在生长过程中，代谢产物中的成分对青枯雷尔氏菌具有抑制作用。本发明菌株SY-SF-03通过温室试验，对生姜青枯病的防治效果为87.20％，对番茄青枯病的防治效果为83.33％。
本发明所具有的优点：
本发明通过东北林地筛选、分离得到一株抗青枯病菌株，经鉴定为委内瑞拉链霉菌，可以拮抗青枯病致病菌青枯雷尔氏菌，其发酵代谢产物可抑制病原菌的生长繁殖，防治青枯病的发生。且所发现的委内瑞拉链霉菌生长快速、传代稳定，在土壤和植物体中能迅速定殖，可以提高植物抗性，对提高作物产量和提升品质具有显著作用。本发明作为生物防治青枯病的重要手段，具有使用方便、环境友好、可持续长期使用的优点。
附图说明
图1为本发明实施例的菌SY-SF-03在高氏1号培养基上单菌落。
图2为本发明实施例的菌株SY-SF-03菌落形态及菌丝、孢子形态特征，其中图2-1为菌株SY-SF-03菌落初期形态，图2-2为菌株SY-SF-03菌落末期形态，图2-3为菌株SY-SF-03菌丝形态结构；图2-4为菌株SY-SF-03的孢子结构。
图3为本发明实施例的菌株SY-SF-03对青枯雷尔氏菌的抑制效果图。
图4为本发明实施例的SY-SF-03发酵液及萃取相对青枯雷尔氏菌的抑菌活性测定，其中a:发酵液；b:二氯甲烷萃取相；c:萃取余相；d:正丁醇萃取相；e:乙酸乙酯萃取相。
具体实施例
以下实施例用于进一步详细描述本发明，但并不构成对本发明的限制，本发明的一株抗青枯病生防菌株SY-SF-03及其应用绝非仅限于这些实施例。
实施例1：生防菌SY-SF-03的筛选分离
从东北林地采集土壤10g，加入盛有100mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于150r/min的摇床上震荡30min，震荡结束后静置1h，取上清液10mL，加入90mL无菌水中，混合均匀后，依次梯度稀释10-2、10-3、10-4、10-5倍，分别取稀释液10μL涂布无菌高氏1号固体培养基平板，每个梯度涂布3个平行，于28℃恒温培养箱中培养3-7d，挑取培养基中的单菌落进行平板划线纯化，获得菌SY-SF-03单菌落，菌单菌落图1所示。
实施例2：生防菌SY-SF-03的鉴定
菌株SY-SF-03在高氏1号固体培养基培养，菌落圆形、表面凸起、边缘灰白色，基内菌丝初为浅灰色，菌丝无横隔，产红色色素后变为红色，气生菌丝白色，产孢子后颜色为深灰色，显微镜下观察孢子椭圆形或球形(图2)。提取菌株SY-SF-03的16SrRNA序列，经苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank数据库序列比对，结果表明菌株SY-SF-03属于链霉菌属(Streptomyces)中的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)，其已于2018年5月14日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M2018265。
菌株SY-SF-03 16SrRNA序列为：
CGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACCGGCTTCCGCATGGAAGCTGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATCCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGATGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCG
实施例3：生防菌SY-SF-03对青枯雷尔氏菌的抑菌效果
采用平板对峙法考察菌株SY-SF-03对青枯劳尔氏菌的抑制效果：将上述分离获得放线菌委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)接种于TSB平板中央，于28℃培养箱培养3d后，用无菌的喉头喷雾器将浓度为2×108cfu/mL的青枯雷尔氏菌菌悬液喷入TSB平板上，静置20min后，将平板倒扣于30℃培养箱培养，24h后观察并测量抑菌圈的直径。观察平板上的抑菌圈直径可达42mm，如图3所示。
实施例4：菌株SY-SF-03发酵液及萃取相抑菌活性测定
1)菌株SY-SF-03培养及其代谢产物萃取
使用接种环取平板中的菌落SY-SF-03，接种至50mL高氏1号液体培养基中，30℃，180rpm摇床中培养48h，以10％v/v的接种量转接至含有400mL高氏1号培养基的1000mL 5个三角瓶中，30℃、220rpm摇床中培养7d，离心除去菌体，收集上清液，将上清液分别用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，收集上述各不同萃取液所得萃取相，再分别使用旋转蒸发仪挥干溶剂，而后分别用10mL蒸馏水溶解，放置于4℃冰箱中保存。
2)菌株SY-SF-03发酵液及萃取相抑菌活性测定
分别取实施例4中制备好的样品(样品为不同萃取液萃取获得的萃取相以及于高氏1号液体培养基发酵获得发酵液)10μL，点样于半径为4mm的灭菌滤纸片上，然后将滤纸片放置于TSB固体培养基平板上，用无菌的喉头喷雾器，将浓度为3×108cfu/mL的青枯雷尔氏菌悬液喷入上述TSB平板上，静置10min后，将平板倒扣于30℃培养箱培养，24h后观察并测量抑菌圈的直径，将上述获得的不同萃取相以及发酵液对青枯病致病菌的抑制效果如图4所示。发酵液对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达到27.30mm，二氯甲烷与乙酸乙酯萃取相对青枯雷尔氏菌没有抑制作用，发酵液萃取余相对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径为26.25mm，正丁醇萃取相对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径为16.32mm。
实施例5:温室盆钵试验检测菌株SY-SF-03发酵液对生姜青枯病的防效
将委内瑞拉链霉菌SY-SF-03接种于高氏1号培养基，于30℃、220r/min摇床中培养7d，获得发酵液。使用链霉菌SY-SF-03发酵液浸种处理姜块30min，移栽时使用稀释50倍的上述发酵液10mL灌根处理，移栽5d后接种1.5×107CFU/mL青枯雷尔氏菌10mL；以发酵培养基与清水处理，直接接种青枯雷尔氏菌的植株为空白对照。每个处理组35株，每组重复3次，于温度25-28℃，相对湿度40％-60％的温室中生长30d，待发病后每天调查发病情况，统计发病率与病情指数。病情根据如下分级标准分级：
0：无症状；1：≤25％的叶片萎焉；2:25-50％的叶片萎焉；3:50-75％的叶片萎焉；4:75-100％的叶片萎焉。通过以下公式计算防治效果：
病情指数(％)＝[Σ(病级数×该病植株数)]/(最高病级数×总株数)×100％；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数×100％；
移栽30d后统计结果下表1所示，菌株SY-SF-03对生姜青枯病的防效达到87.20％，防效非常理想。
表1菌SY-SF-03对生姜青枯病的防治效果
Figure BDA0001861866980000051
注：同列中不同小写字母表示数值间差异显著(P<0.05)
实施例6：温室盆钵试验检测菌株SY-SF-03发酵液对番茄青枯病的防效
番茄幼苗(5-6片叶)移栽入装满基质的盆钵中，置于16/8h光周期温室内，处理组于2d后使用同实施例6中的发酵液20mL灌根，3d后接种1.5×107CFU/mL青枯雷尔氏菌10mL；以发酵培养基与清水做同样处理，直接接种青枯雷尔氏菌的植株为对照组。每个处理组25株，每组重复3次，于接种青枯雷尔氏菌30d后统计病情，病情分级0-4级：0级无症状；1级≤25％的叶片枯萎；2级25-50％的叶片枯萎；3级50-75％的叶片枯萎；4级植株死亡。通过以下公式计算防治效果：
病情指数(％)＝[Σ(病级数×该病植株数)]/(最高病级数×总株数)×100％；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数×100％。移栽30d后统计结果表2所示，菌SY-SF-03对番茄青枯病的防效达到83.33％，防效非常理想。
表2菌SY-SF-03对番茄青枯病的防治效果
Figure BDA0001861866980000061
注：同列中不同小写字母表示数值间差异显著(P<0.05)。
序列表
<110> 沈阳化工研究院有限公司
<120> 一种抗青枯病生防菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 链霉菌属SY-SF-03(Streptomyces sp.SY-SF-03)
<400> 1
cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga tgaagccctt cggggtggat 60
tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct tcactctggg acaagccctg 120
gaaacggggt ctaataccgg ataacaccgg cttccgcatg gaagctggtt gaaagctccg 180
gcggtgaagg atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc ctaccaaggc 240
gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga 360
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgaa 420
agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg 540
tcgggtgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcatc cgatacgggc aggctagagt 600
gtggtagggg agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 660
accggtggcg aaggcggatc tctgggccat tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga 720
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gttgggaact aggtgttggc 780
gacattccac gtcgtcggtg ccgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg 840
ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcagcgg agcatgtggc 900
ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac atataccgga aagcattccc 960
cccttgtggt cggtatacag gtggtgcatg gctgtcgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020
cgcaacgagc gcaacccttg tcctgtgttg ccagcatgcc cttcggggtg atggggactc 1080
acaggagacc gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc 1140
cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa tggccggtac aaagagctgc gatgccgtga 1200
ggcggagcga atctcaaaaa gccggtctca ctcgacccca tgaagtcgga gttgctagta 1260
atcgcagatc agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320
cgtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcccaac cccttgtggg agggagctgt 1380
cgaaggtggg actggcg 1397

Claims (5)

1.一种抗青枯病生防菌株，其特征在于：抗青枯病生防菌株SY-SF-03属于链霉菌属（Streptomyces）中的委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）已于2018年5月24日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC M2018265。
2.一种权利要求1所述的抗青枯病生防菌株的应用，其特征在于：所述菌株在防治生姜或番茄青枯病中的应用。
3.一种生防菌剂，其特征在于：由权利要求1所述抗青枯病生防菌株制备得生防菌剂。
4.按权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于，所述抗青枯病的生防菌剂为该菌株的培养浓缩物、培养菌悬液、发酵液或发酵分离上清液；
所述培养浓缩物为将所述发酵液经正丁醇萃取浓缩后所得物质。
5.根据权利要求4所述生防菌剂，其特征在于，所述发酵液的制备方法为：将所述菌活化后，以6-10% v/v接种量接种于高氏1号培养基、查氏培养基或TSB培养基中发酵培养5-10d，即得发酵液。
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