CN114651689A

CN114651689A - 一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法

Info

Publication number: CN114651689A
Application number: CN202210263588.4A
Authority: CN
Inventors: 张冲; 庄伟建; 陈华; 蔡铁城; 杨强; 熊发前; 陈玉婷; 楚盼盼
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-03-17
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明公开了一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，包括如下步骤：将种植田块进行整地起垄，按照规格种植花生种质；选择青枯菌进行培养和摇菌，获得接种用青枯菌悬液；对初花期的花生种质材料采用剪叶接种法接种花生青枯病菌；接种后25天，记录接种花生青枯菌后发病等级的植株数目，计算病情指数，判断花生品种对花生青枯病的抗性等级。本发明的花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，其鉴定结果准确可靠且重复性较高，可真实反映田间的青枯病抗性，可显著区分不同花生品种对青枯病的抗感差异，可一次性对多个待测品种的花生进行大批量的鉴定，实现规模化花生青枯病的抗病性鉴定。

Description

一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法

技术领域

本发明属于植物青枯病抗性鉴定领域，具体涉及一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法。

背景技术

花生是我国重要的油料和经济作物，在我国国民生产中占有重要地位。我国是花生生产大国，2018年花生播种面积达4620千公顷，年总产量1733.20万吨，占全国油料年产量的50%。2018年我国进口食用油籽9448.9万吨，同比减少7.4%，进口食用植物油达808.7万吨，同比增长8.9%。据国务院发展研究中心专家预测，至2025年我国植物油自给率将降至25%。因此，花生生产关乎国计民生。

青枯病是一种在世界范围内广泛发生并严重危害植物的土传性细菌病害。青枯病菌的寄主范围较广，能够侵染54个科的450余种植物。青枯病通常会造成发病地区的花生减产10%～30%，严重时可导致绝收，从而造成重大的经济损失，除了影响花生的品质和产量外还会增加黄曲霉毒素的污染。到目前为止，仍然无有效的方法来控制花生青枯病的发生，生产上只能依靠轮作、与其他作物间套作以及生物防治来暂时防治青枯病的发生，其抗病育种是最有效的防治手段，选育抗青枯病品种是目前提高花生产量的最有效直接的方法，抗病育种需要抗病资源为育种材料，不同育种材料抗青枯病的能力差异很大，理想的田间抗性鉴定方法则成为选育和推广抗病品种的的前提条件，目前花生资源的抗性鉴定与筛选技术主要依靠菌液浸种接种鉴定，但由于受自然条件、气候因素的影响有时会不准确。现有的高通量的花生种质资源田间抗性鉴定主要依靠自然病圃鉴定，田间自然病圃因花生苗健壮程度不一、发病不均匀以及发病率不高等原因，经常造成鉴定结果不准确，因此探寻一种适合田间人工接种的抗病鉴定方法对于高通量鉴定花生种质的青枯病抗性至关重要。

发明内容

本发明所要解决的是现有花生品种抗青枯病田间自然病圃鉴定方法存在结果不准确、发病不均匀、重复性不好的缺陷，进而提供一种鉴定准确性和重复性较好的花生品种抗青枯病田间人工接种鉴定方法。

为实现上述目的采用以下技术方案：

一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，包括如下步骤:

（1）培育接种用花生苗：选择土壤肥沃的黄壤土田块，犁地耙平后在起畦之前均匀撒每亩施基肥10 kg和复合肥40 kg，采用起垄栽培方式并且等行距种植，周围设置保护行，单粒播种，两行畦，畦宽0.9 m，株行距0.45 m×0.16 m，根据出苗情况进行补苗，齐苗后每亩施尿素10 kg，种植三个重复，每个重复种50株，30株接菌使用，其余20株作为对照，定期供水灌溉保持土壤湿润，生长30~35天至初花期。

（2）接种体制备：将-80℃保存的强致病力青枯菌菌株 Rs-P.362200-060707-2-2在TTC培养基上28℃培养48 h活化，挑取挑取形状不规则，带粘性，周围白色，中央浅粉红色的菌落于SPA液体培养基中在28℃下220 rpm摇瓶震荡培养24 h，离心收集沉淀用无菌水稀释菌液浓度至10⁸~10⁹cfu/mL，制备接种用青枯菌菌液。

（3）接种方法：用无菌剪刀蘸取菌悬液，在花生植株倒数第二张完全展开的叶片的4片小叶的1/2处垂直于中脉剪2/3的半片叶，不要伤到中脉，同样的方法将倒数第三张叶片接种。设3个重复，每个重复接种30株。

（4）调查方法：接种后25天调查发病情况，病情等级分为0~5级6个级别，分别是：0级：所剪小叶片切口褪绿变黄，未剪叶片未脱落保持绿色，植株完好未见凋萎；1级：找不到所剪小叶片所在的叶片，植株完好未见凋萎；2级：所剪叶片所在主茎或侧枝出现（全部或部分）叶片凋萎褪绿；3级：未剪侧枝叶片出现凋萎褪绿，但茎杆呈绿色；4级：整株凋萎死亡，所有枝条呈黄绿色；5级：整个植株干枯死亡；按照级别计算病情指数，病情指数=（∑各级症状代表值×株数/最高级症状代表值×总株数）×100；

（5）抗性等级划分：根据花生植株的病情指数计算所得的最终得分，花生抗青枯病抗性评价标准：高抗（HR）：病情指数0～10；抗病（R）：病情指数11～30；中抗（MR）：病情指数31～50；中感或低抗（MS或LS）：病情指数51～70；感病（S）：病情指数71～90；高感（HS）：病情指数91～100。根据病情指数评价抗性水平分为高抗、抗病、中抗、中感、感病、高感青枯病。

上述一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法在花生品种抗性筛选中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明方法可以准确鉴定初花期花生青枯病的抗性。目前生产上采用的花生田间抗病鉴定方法是通过种植在抗病鉴定圃上调查发病情况，经常会出现不同材料因种子活力出苗不齐整，病圃中病菌分布不均匀造成抗病结果不准确；本发明通过保证种子出苗率的前提下，人工进行青枯菌的接种，可操作性强，可以保证发病均匀可靠，数据统计准确性高，可以高通量的筛选花生抗青枯病的种质资源，有利于提高抗病材料的筛选效率。为研究花生青枯病的抗性机理和抗病种质的筛选奠定基础。

附图说明

图1为实施例1田间人工接种花生抗、感对照品种在接种后25天的表型（抗病等级划分为0~5级6个等级，高感对照品种新会小粒，高抗对照品种粤油92）。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的具体技术方案，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1：

（1）整地：分别选择土壤肥沃的黄壤土田块，在种植材料之前喷洒乙草胺对种植田块进行封闭除草，每亩撒施10公斤基肥和40公斤复合肥（N:P:K=1:1:1）进行犁地耙平，进行开沟、起垄和作畦，畦宽0.9 m，沟深0.25 m。

（2）播种：在2017年春季种植接种鉴定的花生品种，参试品种有：闽花8号、闽花6号、仲恺花1号、仲恺花12号，蒲花56、湛红2号、桂花红166、湛油75、琼花1号、桂花黑1号、贺油145、龙花166、仲恺花826、桂花20，以抗病对照品种粤油92，感病品种新会小粒为对照。两行畦，株距0.16 m，单粒播种，每个材料种植9 m，周围设置保护行，根据出苗情况进行补苗，种植三个重复，每个重复种50株，30株接菌使用，其余20株作为对照，定期供水灌溉保持土壤湿润，生长中注意中耕除草。

（3）强致病力青枯菌的培养：将-80℃保存的强致病力青枯菌菌株Rs-P.362200-060707-2-2在TTC培养基（蛋白胨10 g，酶水解酪素1 g，葡萄糖5 g，琼脂15 g，蒸馏水定容1L，pH 7.2，加入0.5%的2,3,5-三苯基四唑化氯）上28℃培养48 h活化，挑取挑取形状不规则，带粘性，周围白色，中央浅粉红色的菌落于SPA液体培养基（蔗糖 20g，蛋白胨 5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，MgSO₄ 0.25 g，pH 7.2）中在28℃下220 rpm摇瓶震荡培养24 h，离心收集沉淀用无菌水稀释菌液浓度至10⁹cfu/mL，制备接种用青枯菌菌液。

（3）人工剪叶接种：采用剪叶法接种初花期的花生植株，用无菌剪刀蘸取菌悬液，在花生植株倒数第二张完全展开的叶片的4片小叶的1/2处垂直于中脉剪2/3的半片叶，不要伤到中脉，每剪一片叶片蘸一次菌液，同样的方法将倒数第三张叶片接种。设3个重复，每个重复接种30株。

（4）病情调查方法：接种后25天调查发病情况，病情等级分为0~5级6个级别，分别是：0级：所剪小叶片切口褪绿变黄，未剪叶片未脱落保持绿色，植株完好未见凋萎；1级：找不到所剪小叶片所在的叶片，植株完好未见凋萎；2级：所剪叶片所在主茎或侧枝出现（全部或部分）叶片凋萎褪绿；3级：未剪侧枝叶片出现凋萎褪绿，但茎杆呈绿色；4级：整株凋萎死亡，所有枝条呈黄绿色；5级：整个植株干枯死亡。

按照级别计算病情指数，病情指数=（∑各级症状代表值×株数/最高级症状代表值×总株数）×100。

（5）抗性等级划分：根据花生植株的病情指数计算所得的最终得分, 其评价标准是：高抗（HR）：病情指数0～10；抗病（R）：病情指数11～30；中抗（MR）：病情指数31～50；中感（MS）：病情指数51～70；感病（S）：病情指数71～90；高感（HS）：病情指数91～100。根据病情指数评价抗性水平分为高抗、抗病、中抗、中感、感病、高感青枯病。

2017年春对参试的14个花生品种种植三个重复，每个材料接种30株，进行准确的抗青枯病鉴定，按照剪叶接种法进行抗病鉴定，接种25天后进行调查病情，并记录。如闽花8号的植株感染等级0级16株，1级11株，2级3株，3级0株，4级0株，5级0株，所有抗病鉴定的花生家系均按照该方法进行记录，具体按照花生抗青枯病病情指数（DI）计算公式，分别计算不同家系的病情指数（DI），如闽花8号重复I的DI=（16×0+11×1+3×2+0×3+0×4+0×5）/（30×5）×100 =11.33，依次类推，计算不同花生品种的病情指数（见表1）。

表1 不同花生品种田间人工剪叶接种青枯病抗性鉴定结果

从表1可得知，运用本实施例的鉴定方法，接种后25天调查结果显示抗病对照粤油92病情指数平均值为9.33，表现为高抗青枯病；感病对照品种新会小粒的病情指数平均值为93.33，表现为高感青枯病；参试品种中大部分品种按照此实施例都能准确反映其抗青枯病水平，抗性鉴定结果准确，且重复性较好，与生产实践中的抗病表型基本一致，准确度达到87.5%。

采用CN202010866982.8专利中枝条扦插青枯菌鉴定方法对上述参试品种进行青枯病鉴定鉴定，从表2中可得知，按照该发明的要点5天后调查病情，参试的16个花生品种，其中有6个闽花6号、仲恺花12号、琼花1号、仲恺花826、桂花20和对照品种新会小粒可以充分反映其抗病水平，和生产上品种的青枯病抗性一致，而有10个品种通过该鉴定方法未能和生产上的品种抗病性一致，抗性鉴定结果不能够充分反映这些品种的抗病性。

表2 不同花生品种枝条扦插接种青枯病抗性鉴定结果

与现有技术相比，本发明采用人工剪叶法接种青枯菌进行抗病鉴定，通过保证土壤水肥和种子出苗率一致的前提下，人工剪叶进行青枯菌的接种，可操作性强，可以保证发病均匀可靠，数据统计准确性高，可以高通量的筛选花生抗青枯病的种质资源。虽然现有技术也能部分反映品种的青枯病抗性，但从整体上来讲，本发明可以设计多个重复性实验，根据病情指数以具体数据的表现形式较为精细划分抗病等级，可以准确直观的表现其抗病性，在生产上能够合理有效的使用该方法。

需要说明的是，本发明的实施例是为更好的显示权利要求书中的实施步骤所做的举例，并非对本发明方法的限定。对于本领域的研究人员来讲，在上述说明的基础上做出其它不同形式的修改或者变动，都处于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）培育接种用花生苗：选择土壤肥沃的黄壤土田块，犁地耙平后在起畦之前每亩均匀撒施基肥10 kg和复合肥40 kg，采用起垄栽培方式并且等行距种植，周围设置保护行，单粒播种，两行畦，畦宽0.9 m，株行距0.45 m×0.16 m，根据出苗情况进行补苗，齐苗后每亩施尿素10 kg，种植三个重复，每个重复种50株；

（2）接种体制备：将-80℃保存的强致病力青枯菌菌株 Rs-P.362200-060707-2-2在TTC培养基上28℃培养48 h活化，挑取活性的克隆于SPA培养基220 rpm摇瓶震荡培养24 h，制备接种用青枯菌菌液；

（3）接种方法：对初花期的花生种质材料采用剪叶法接种处理，用无菌剪刀蘸取菌悬液，在花生植株倒数第二张完全展开的叶片的4片小叶的1/2处垂直于中脉剪2/3的半片叶，不要伤到中脉，同样的方法将第三张叶片接种，设3个重复，每个重复接种30株，用无菌水做对照；

（4）调查方法：接种后25天，记录接种花生青枯菌后发病等级的植株数目，计算病情指数，病情等级分为0~5级6个级别，按照级别计算病情指数，病情指数=（∑各级症状代表值×株数/最高级症状代表值×总株数）×100；

（5）抗性等级划分：根据花生植株的病情指数计算所得的最终得分, 评价将花生种质资源分为高抗、抗病、中抗、中感、感病、高感青枯病。

2.根据权利要求1所述的一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述的花生田间种植时间为4月初，生长30~35天。

3.根据权利要求1所述的一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的克隆在TTC固体培养基上强致病力的菌落为中间粉红色，周围白色，形状不规则的菌落，制备接种用青枯菌的菌液浓度控制在10⁸~10⁹cfu/mL。

4.根据权利要求1所述的一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中所述的0~5级标准是：0级：所剪小叶片切口褪绿变黄，未剪叶片未脱落保持绿色，植株完好未见凋萎；1级：找不到所剪小叶片所在的叶片，植株完好未见凋萎；2级：所剪叶片所在主茎或侧枝出现全部或部分叶片凋萎褪绿；3级：未剪侧枝叶片出现凋萎褪绿，但茎杆呈绿色；4级：整株凋萎死亡，所有枝条呈黄绿色；5级：整个植株干枯死亡。

5.根据权利要求1所述的一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法，其特征在于：步骤(5)中的花生抗青枯病抗性评价标准：高抗HR：病情指数0～10；抗病R ：病情指数11～30；中抗MR：病情指数31～50；中感或低抗MS或LS：病情指数51～70；感病S：病情指数71～90；高感HS：病情指数91～100。

6.如权利要求1所述一种花生青枯病田间初花期接种鉴定方法在花生品种抗性筛选中的应用。