CN101407805A - 瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，该方法包括以下过程：在室温下，取斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，取孢子悬液置于平皿中开启磁力搅拌器，置紫外灯下照射诱变，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于含有氯化锂的PDA培养基，从中获得产素水平高于出发菌株的突变菌株，选取纯的初筛菌株转接于液体发酵培养基中选取遗传性状稳定的高产菌株。本发明的优点在于采用的诱变设备简单、方法易行、操作安全，复合诱变效果要比单一一种诱变剂的处理效果要好，依此方法诱变的到的诱变菌株，同出发菌株相比，拮抗性能提高2.5－5.0倍。
Description
一、技术领域：
本发明属于微生物诱变育种技术领域，特别涉及一种瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其采用紫外线和氯化锂复合诱变选育瑞拉菌素高产菌株的方法，依次方法可以有效地提高瑞拉菌素的产量。
二、背景技术：
自从20世纪40年代有机氯和有机汞农药问世以后，人们在与农业害虫、病害及杂草的斗争过程中，主要是依靠化学农药这一现代化武器。但是，随着化学农药的品种和产量急增，施用范围日益扩大，农药残留污染而造成世界性公害引起人们的忧虑。随着人类环保意识的增强，生物农药已深受人们青睐。成为当今农药开发的热点。大多数生物农药具有选择性强、对人畜及天敌较安全、不易产生抗性、生产工艺较简单、开发费用较低等特性。在生物农药中微生物源农药是目前应用最广、发展最快的一类。为了保护环境和促进农业可持续发展，开发微生物农药具有广阔的前景和深远的意义。
委内瑞拉链霉菌是一种链霉菌属放线菌。其发酵产物可提取瑞拉菌素，是一种氨基糖苷类的抗生素，对植物真菌病害有明显抑制作用，该菌株的发酵产物对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌等有强拮抗作用，大田试验证明：“瑞拉菌素”对水稻稻瘟病的防治效果可达到69.8％-95.08％。
瑞拉菌素产生菌是一种公知的菌种，是通过对土壤中放线菌资源进行研究，采用通用的分离筛选方法分离筛选出来的。经过二十多年的研究，已在瑞拉菌素的生物活性、理化性质、菌株鉴定、抑菌谱、发酵工艺、分离纯化、分子结构等方面取得很大进展。但至今还未实现工业化生产，主要原因是瑞拉菌素产生菌原始菌株的产素水平很低，产素品质较差，生产成本相对较高，从而阻碍了瑞拉菌素的工业化进程。应用高效简便的诱变选育技术是加快瑞拉菌素的工业化进程的关键。
紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简便等优点，是抗生素产生菌选育的一种主要方法，在实验中应用得非常普遍。但采用紫外线和其他诱变因子一起进行复合诱变选育，往往会取得更理想的诱变效果。氯化锂是无机诱变剂，做为转录阻滞剂参与蛋白质的合成，通过顺式作用元件作用于DNA，使之形成基因增强子或者启动多拷贝基因，从而产生诱变效应。经过前处理进入细胞，与DNA分子结合，吸收紫外线的能量后，增强紫外线的诱变效果。孙嘉龙等采用紫外线及氯化锂对产Monacolin K红曲菌株进行复合诱变，得到的正突变菌株Monacolin K的产量比出发菌株提高3.3倍。袁琳等采用紫外线及氯化锂对产四环素菌株进行复合诱变选育，得到的正突变菌株的活性产物产量较出发菌株提高37％。而把紫外线及氯化锂复合式诱变法应用于瑞拉菌素产生菌的选育方面，则未见相关专利和文献报道。
三、发明内容：
本发明的目的是提供一种瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，利用该方法可以有效提高瑞拉菌素的产量。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种瑞拉菌素高产菌株的的复合诱变选育方法，其特征在于包括如下步骤：在室温下，取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，照射1min后打开皿盖并开启磁力搅拌器，距15W紫外灯30cm处照射诱变。然后将诱变后的孢子悬液在红灯下系列梯度稀释到10-5和10-6涂布于含有氯化锂的高氏一号培养基平板中，28℃避光培养7d，选取生长良好的单菌株采用双向培养法进行初筛，初筛所得正突变菌株转接于液体发酵培养基中置于28℃，150r/min条件下发酵72h，对发酵液进行预处理，后采用生长速率法对初筛菌株进行复筛，以获得遗传性状稳定的高产突变菌株。
上述工艺包括：
(1)孢子悬液的制备
室温下，用无菌生理盐水洗下斜面孢子并用接种环轻刮斜面表面，将菌悬液加到盛玻璃株的无菌生理盐水中，放入摇床200r/min，28℃，培养2h，使孢子充分分散和活化，后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝体，用无菌水将孢子悬液稀释到108个/mL，即制成诱变用的出发菌株孢子悬液。
(2)复合诱变处理
取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，开启磁力搅拌器，距15W紫外灯30cm处，照射梯度时间设不同梯度。设致死率在75％到85％的照射时间为最佳诱变剂量。将在最佳紫外线照射时间段处理后的孢子悬液在红光下系列梯度稀释到10-5和10-6，涂于含有氯化锂的PDA平板，其中氯化锂的浓度梯度设为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％，每个稀释梯度对应的每个氯化锂浓度梯度做3个重复，将等量未处理的孢子悬液涂平板作对照，28℃避光培养7d。
(3)初筛
用打孔器制备稻瘟病菌菌饼，并将其接种在PDA平板中间，四个角点对称接待测突变株，距离PDA平板中央为3cm。每个菌株重复五次，将接好的平皿放置于28℃恒温箱中培养3d后，测量各突变菌株的抑菌带宽度，计算正突变率。将筛选出来的正突变菌株移至斜面保存待复筛。
(4)发酵培养基
所述液体发酵培养基的组成及含量为：黄豆饼粉20g，葡萄糖10g，淀粉15g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙2.5g，水定容至1L，pH8.0。
(5)摇瓶发酵培养
将初筛所得的各高效正突变菌株以单菌落接种于装有10mL发酵培养液的50mL三角瓶中，以出发菌株为对照，置于28℃，150r/min条件下发酵72h。
(6)发酵液预处理
用1mol/L草酸调节发酵原液的pH，边加草酸边搅拌，并用pH计测量发酵液的pH值。至pH为3.5，静置0.5h后再调pH至3.5，再静置30min后5000r/min离心30min，弃沉淀，取上清液过滤，收集滤液。
(7)复筛
采用生长速率法，取不同初筛菌株的发酵预处理液1mL加入到9mLPDA中制备平板，同时制备1mL出发菌株的发酵预处理液加9mL PDA的平板作为对照，在制好的平板中间接种稻瘟病菌菌饼，每种处理重复五次。28℃培养3d，最后测定稻瘟病菌落直径，计算抑制菌丝生长的半致死浓度及相对毒力，后用诱变菌株和出发菌株的抑制效果作比较。
(8)遗传稳定性实验
挑取经筛选的对稻瘟病菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传7代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液进行预处理，采用生长速率法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
本发明采用紫外线和氯化锂复合诱变瑞拉菌素产生菌，采用的诱变设备简单、方法易行、操作安全，紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简便等优点，是抗生素产生菌选育的一种主要方法，在实验中应用得非常普遍。采用紫外线和其他诱变因子一起进行复合诱变选育，往往会取得更理想的诱变效果。氯化锂是无机诱变剂，做为转录阻滞剂参与蛋白质的合成，通过顺式作用元件作用于DNA，使之形成基因增强子或者启动多拷贝基因，从而产生诱变效应。本发明依此方法诱变的到的突变菌株RL-2-51及RL-2-76，同出发菌株相比，拮抗性能提高2.5～5.0倍。
四、附图说明：
图1为本发明的工艺流程图；
图2为复合诱变对菌株的诱变效果；
图3为诱变后突变株菌落形态；
五、具体实施方式
本发明所采用的菌株瑞拉菌素产生菌是一种公知的菌种，是通过对土壤中放线菌资源进行研究，采用通用的分离筛选方法分离筛选出来的，属于委内瑞拉链霉菌属，其发酵产物可提取瑞拉菌素，是一种氨基糖苷类的抗生素，对植物真菌病害有明显抑制作用，该菌株的发酵产物对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌等有强拮抗作用，大田试验证明：“瑞拉菌素”对水稻稻瘟病的防治效果可达到69.8％-95.08％。
表1复合诱变处理对菌株的初筛结果
*经DPS统计学软件Duncan多重比较，显著水平P＝0.0001.
表2高产菌株的复筛结果
以下实施例将对本发明作进一步说明。
实施例1：
配制PDA及发酵培养基，为下一步实验做准备。
制备孢子悬液制备：将培养7天的斜面菌株，用ml无菌生理盐水洗下孢子并用接种环轻刮斜面表面，将菌悬液加到盛玻璃株的无菌生理盐水中，放入摇床200r/min，28℃，培养2h，使孢子充分分散和活化，后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝体，用无菌水将孢子悬液稀释到108个/mL，即制成诱变用的出发菌株孢子悬液。
3.诱变
a：紫外线处理：操作在红光下进行，提前0.5h开紫外灯，使光源稳定。取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，照射1min后打开皿盖并开启磁力搅拌器，距15W紫外灯30cm处，照射时间分别为15s、30s、45s、60s、75s和90s。将诱变后的孢子悬液在红灯下系列梯度稀释到10-5和10-6，涂于PDA平板，每个时间段、每个浓度涂3个平板。在诱变之前，先取0.1mL菌悬液涂平板作为对照，28℃避光培养7d，计算致死率。
b：最适紫外线处理时间的确定：选择致死率为75％-85％的时间段作为最佳诱变处理剂量。
c：紫外线和氯化锂复合诱变处理：将在最佳紫外线照射时间段处理后的孢子悬液在红灯下系列梯度稀释到10-5和10-6，涂于含有氯化锂的PDA平板，其中氯化锂的浓度梯度设为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％，每个稀释梯度对应的每个氯化锂浓度梯度做3个重复，将等量未处理的孢子悬液涂平板作对照，28℃避光培养7d。
4.初筛：采用双向培养法，用打孔器制备稻瘟病菌菌饼，并将其接种在PDA平板中间，四个角点对称接待测突变株，距离PDA平板中央为3cm。每个菌株重复五次，将接好的平皿放置于28℃恒温箱中培养3d后，测量各突变菌株的抑菌带宽度，计算正突变率。将筛选出来的正突变菌株移至斜面保存待复筛。
5.摇瓶发酵培养：将初筛所得的各高效正突变菌株以单菌落接种于装有10mL发酵培养液的50mL三角瓶中，以出发菌株为对照，置于28℃，150r/min条件下发酵72h。
6.发酵液预处理：用1mol/L草酸调节发酵原液的pH，边加草酸边搅拌，并用pH计测量发酵液的pH值。至pH为3.5，静置0.5h后再调pH至3.5，再静置30min后5000r/min离心30min，弃沉淀，取上清液过滤，收集滤液。
7.复筛：采用生长速率法，取不同初筛菌株的发酵预处理液1mL加入到9mL PDA中制备平板，同时制备1mL出发菌株的发酵预处理液加9mLPDA的平板作为对照，在制好的平板中间接种稻瘟病菌菌饼，每种处理重复五次。28℃培养3d，最后测定稻瘟病菌落直径，计算抑菌效果，后用诱变菌株和出发菌株的抑制效果作比较。
8.遗传稳定性实验：挑取经筛选的对稻瘟病菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传7代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液进行预处理，采用生长速率法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。
突变菌株正突变率为10％～30％，所筛选突变菌株拮抗性能比出发菌株拮抗性能提高3～5倍。
实施例2：
1.配制高氏一号(拮抗筛选)及发酵培养基，为下一步实验做准备。
2.制备孢子悬液制备：将培养6天的斜面菌株，用5ml无菌生理盐水洗下孢子并用接种
环轻刮斜面表面，将菌悬液加到盛玻璃株的无菌生理盐水中，放入摇床200r/min，28℃，培养6h，使孢子充分分散和活化，后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝体，用无菌水将孢子悬液稀释到106个/mL，即制成诱变用的出发菌株孢子悬液。
3.诱变
a：紫外线处理：操作在红光下进行，提前0.5h开紫外灯，使光源稳定。取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，照射1min后打开皿盖并开启磁力搅拌器，距15W紫外灯30cm处，照射时间分别为20s、40s、60s、80s、100s和120s。将诱变后的孢子悬液在红光下系列梯度稀释到10-5和10-6，涂于高氏一号平板，每个时间段、每个浓度涂3个平板。在诱变之前，先取0.1mL菌悬液涂平板作为对照，28℃避光培养7d，计算致死率。
b：最适紫外线处理时间的确定：选择致死率为90％的时间段作为最佳诱变处理剂量。
c：紫外线和氯化锂复合诱变处理：将在最佳紫外线照射时间段处理后的孢子悬液在红灯下系列梯度稀释到10-5和10-6，涂于含有氯化锂的高氏一号平板，其中氯化锂的浓度梯度设为0.2％、0.4％、0.6％和0.8％，每个稀释梯度对应的每个氯化锂浓度梯度做5个重复，将等量未处理的孢子悬液涂平板作对照，28℃避光培养7d。
4.初筛：采用双向培养法，用打孔器制备稻瘟病菌菌饼，并将其接种在高氏一号平板中间，四个角点对称接待测突变株，距离高氏一号平板中央为3cm。每个菌株重复五次，将接好的平皿放置于28℃恒温箱中培养3d后，测量各突变菌株的抑菌带宽度，计算正突变率。将筛选出来的正突变菌株移至斜面保存待复筛。
5.摇瓶发酵培养：将初筛所得的各高效正突变菌株以单菌落接种于装有10mL发酵培养液的50mL三角瓶中，以出发菌株为对照，置于28℃，150r/min条件下发酵96h。
6.发酵液预处理：用1mol/L草酸调节发酵原液的pH，边加草酸边搅拌，并用pH计测量发酵液的pH值。至pH为3.5，静置0.5h后再调pH至3.5，再静置30min后5000r/min离心30min，弃沉淀，取上清液过滤，收集滤液。
7.复筛：取不同初筛菌株的发酵预处理液用0.22um微孔滤膜过滤，用牛津杯测定其抑菌活性，每个牛津杯加0.2ml发酵液，指示菌为稻瘟病菌。
8.遗传稳定性实验：挑取经筛选的对稻瘟病菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传10代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液进行预处理，采用牛津杯法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。
突变菌株正突变率为8％～15％，所筛选突变菌株拮抗性能比出发菌株拮抗性能提高2.5～4.5倍。
实施例3：
1.配制高氏一号(拮抗筛选)及发酵培养基，为下一步实验做准备。
2.制备孢子悬液制备：将培养6天的斜面菌株，用5ml无菌生理盐水洗下孢子并用接种
环轻刮斜面表面，将菌悬液加到盛玻璃株的无菌水中，放入摇床150r/min，30℃，培养4h，使孢子充分分散和活化，后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝体，用无菌水将孢子悬液稀释到106个/mL，即制成诱变用的出发菌株孢子悬液。
3.诱变
a：紫外线处理：操作在红光下进行，取孢子悬液10mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，开启磁力搅拌器，距15W紫外灯20cm处，照射时间分别为20s、40s、60s、80s、100s和120s。将诱变后的孢子悬液在红光下系列梯度稀释到10-6，涂于高氏一号平板，每个时间段、每个浓度涂3个平板。在诱变之前，先取0.2mL菌悬液涂平板作为对照，30℃避光培养7d，计算致死率。
b：最适紫外线处理时间的确定：选择致死率为90％以上的时间段作为最佳诱变处理剂量。
c：紫外线和氯化锂复合诱变处理：将在最佳紫外线照射时间段处理后的孢子悬液在红光下系列梯度稀释到10-6，涂于含有氯化锂的高氏一号平板，其中氯化锂的浓度梯度设为0.2％、0.4％、0.6％和0.8％，每个稀释梯度对应的每个氯化锂浓度梯度做3个重复，将等量未处理的孢子悬液涂平板作对照，30℃避光培养7d。
4.初筛：用打孔器制备稻瘟病菌菌饼，并将其接种在平板中间，四个角点对称接待测突变株，距离平板中央为3cm。每个菌株重复三次，将接好的平皿放置于30℃恒温箱中培养3d后，测量各突变菌株的抑菌带宽度，计算正突变率。将筛选出来的正突变菌株移至斜面保存待复筛。
5.摇瓶发酵培养：将初筛所得的各高效正突变菌株以单菌落接种于装有10mL发酵培养液的50mL三角瓶中，以出发菌株为对照，置于30℃，200r/min条件下发酵72h。
6.发酵液预处理：用1mol/L草酸调节发酵原液的pH，边加草酸边搅拌，并用pH计测量发酵液的pH值。至pH为4.0，静置0.5h后再调pH至4.0，再静置30min后5000r/min离心30min，弃沉淀，取上清液过滤，收集滤液。
7.复筛：取不同初筛菌株的发酵预处理液用0.22um微孔滤膜过滤，用牛津杯测定其抑菌活性，每个牛津杯加0.2ml发酵液，指示菌为稻瘟病菌。
8.遗传稳定性实验：挑取经筛选的对稻瘟病菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传20代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液进行预处理，采用生长速率法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。
突变菌株正突变率为7％～18％，所筛选突变菌株拮抗性能比出发菌株拮抗性能提高2～4倍。
Claims (10)
1、一种瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于包括如下步骤：在室温下，取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，照射1min后打开皿盖并开启磁力搅拌器，距15W紫外灯30cm处照射诱变，然后将诱变后的孢子悬液在红灯下系列梯度稀释到10-5和10-6涂布于含有氯化锂的PDA培养基平板中，28℃避光培养7d，选取生长良好的单菌株采用双向培养法进行初筛，初筛所得正突变菌株转接于液体发酵培养基中置于28℃，150r/min条件下发酵72h，对发酵液进行预处理，后采用生长速率法对初筛菌株进行复筛，以获得遗传性状稳定的高产突变菌株。
2、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：所述孢子悬浮液是按下述方法配制而成：将培养7天的委内瑞拉链霉菌的斜面孢子，用5ml无菌生理盐水洗下孢子并用接种环轻刮斜面表面，将菌悬液加到盛玻璃株的无菌生理盐水中，放入摇床200r/min，28℃，培养2h，使孢子充分分散和活化，后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝体，用无菌水制成106～108个/ml的孢子悬浮液。
3、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：紫外线照射诱变时操作在红灯下进行，提前0.5h开紫外灯，使光源稳定，且照射时间分别设为15s、30s、45s、60s、75s和90s六个梯度。
4、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：含有氯化锂的PDA平板，其中氯化锂的浓度梯度设为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％。
5、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：所述生长良好的单菌落为菌落直径大，产孢量大的单菌株。
6、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法法，其特征在于：所述液体发酵培养基的组成及含量为：黄豆饼粉20g，葡萄糖10g，淀粉15g，磷酸氢二钾0.5g，碳酸钙2.5g，水定容至1L，pH8.0。
7、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：初筛采用双向培养法的工艺步骤为：用打孔器制备稻瘟病菌菌饼，并将其接种在PDA平板中间，四个角点对称接待测突变株，距离PDA平板中央为3cm，每个菌株重复三次，将接好的平皿放置于28℃恒温箱中培养3d后，测量各突变菌株的抑菌带宽度，计算正突变率，将筛选出来的正突变菌株移至斜面保存待复筛。
8、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：对发酵液进行预处理的工艺步骤为：用1mol/L草酸调节发酵液的pH，边加草酸边搅拌，并用pH计测量发酵液的pH值。至pH为3.5，静置0.5h后再调pH至3.5，再静置30min后5000r/min离心30min，弃沉淀，取上清液过滤，收集滤液。
9、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：复筛采用生长速率法，工艺步骤为：取不同初筛突变菌株的发酵预处理液1mL加入到9mL PDA中制备平板，同时制备1mL无菌水加9mL PDA的平板作为对照，在制好的平板中间接种稻瘟病菌菌饼，每种处理重复3次，28℃培养3d，最后测定稻瘟病菌落直径，计算抑菌效果。
10、根据权利要求1所述的瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于：遗传稳定性实验是挑取经筛选的对稻瘟病菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传7代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液进行预处理，采用生长速率法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。
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2008
- 2008-11-25 CN CNA2008102323933A patent/CN101407805A/zh active Pending
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