CN113186137B - 一种贝莱斯芽孢杆菌suno-18s-36株的发酵方法 - Google Patents
一种贝莱斯芽孢杆菌suno-18s-36株的发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO‑18S‑36株的发酵方法，涉及微生物领域。该发酵方法，采用如下培养基：葡萄糖4～10g/L、玉米浆5～20g/L、酵母粉5～25g/L、蚕蛹粉5～10g/L、碳酸钙0～10g/L、葡萄糖酸钙0～30g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、硫酸锰0～0.1g/L、磷酸钙0～10g/L，pH7.0～7.5。本发明发酵方法中涉及的微生物具有解磷、降解农药残留的功能，对病原菌具有拮抗作用，采用本发明发酵方法，可以在较短的时间内，得到高活菌含量、高芽孢率、高抑菌活性物质的发酵液。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体地说是涉及一种贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的发酵方法。
背景技术
现有技术中，有人报道贝莱斯芽孢杆菌在秸秆降解及污水氨氮降解方面的应用，也有人报道在铝毒土壤修复、缓解铝毒胁迫以及提高植物抗铝毒胁迫能力中应用，还有人报道能防治花生根腐病的贝莱斯芽孢杆菌。但是，现有技术中，缺乏能够同时解磷、可降解农药残留、对植物病原菌具有拮抗作用的微生物，更缺乏该类微生物高效、高活菌含量的发酵方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，该微生物具有解磷、降解农药残留的功能，对病原菌具有拮抗作用，采用本发明发酵方法，可以在较短的时间内，得到高活菌含量、高芽孢率、高抑菌活性物质的发酵液。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，采用如下培养基：葡萄糖4～10g/L、玉米浆5～20g/L、酵母粉5～25g/L、蚕蛹粉5～10g/L、碳酸钙0～10g/L、葡萄糖酸钙0～30g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、硫酸锰0～0.1g/L、磷酸钙0～10g/L，pH7.0～7.5。
在本发明中，所述培养基含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5。
在本发明中，先采用基础培养基进行发酵，在发酵过程中流加补料培养基；所述基础培养基中含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆4～6g/L、酵母粉7～9g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5；所述补料培养基添加后，发酵液中玉米浆、酵母粉、硫酸锰的总浓度分别为：玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L。
在本发明中，发酵过程中控制：通气比为(0.8～1.2):1、温度28℃～32℃、转速200～300rpm、罐压0.03～0.08MPa，发酵时间为30～60小时。
在本发明中，当发酵液中的溶氧>14.5％时，流加补料培养基；当发酵液中的溶氧≤14.5％时，停止补料。
在本发明中，培养后的发酵液在30～50℃进行加热处理。
在本发明中，发酵液在30～40℃加热3～6min、然后在40～50℃加热5～15min。
有益效果：采用本发明的培养基和培养工艺，可以得到高活菌含量、高芽孢率、高抑菌活性物质的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36的发酵液。由于芽孢抗逆性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，因此高芽孢率将显著提高贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36菌剂或菌肥的稳定性，这有利于后续以贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36发酵液为原料的菌剂或菌肥的加工制备，为贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36的产业化奠定坚实的基础。
附图说明
图1SUNO-18S-36株显微镜(1000X)观察照片。
图2SUNO-18S-36株的菌落形态。
具体实施方式
本发明中培养基使用的溶剂为水。通气比是指每分钟通气量(m3)与发酵液体积(m3)之比。接种量是接入的种子液的体积与培养基体积的比例。
本发明中贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的活化方法：从贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至LB液体培养基摇瓶中(250mL摇瓶装液量50ml)，在30℃、150r/min下培养24h后，LB培养基变浑浊。取菌液至LB固体培养基中划线培养24h～36h，即得到活化后的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株。
各实施例中的种子液均按照如下方法制备：500mL种子摇瓶中LB液态培养基的装液量为100ml。挑取活化后的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株接种于种子摇瓶中，将种子摇瓶在30℃、150r/min下培养24h，得到种子液。
发酵液中活菌含量采用稀释涂平板法，具体见行业标准NY/T 2321-2013中相关内容。
发酵液中芽孢率的测定方法，包括如下步骤：
(1)取发酵结束时的发酵液，分装在250mL无菌三角烧瓶中，每瓶30mL，6瓶备用。
(2)恒温水浴锅(带震荡)设置温度(80±1)℃，待温度稳定后，备用。
(3)上述6个三角烧瓶，取3个三角烧瓶常温下震荡20min，稀释涂平板测定活菌含量。取平均值记为VCK。
(4)另外3个三角烧瓶，置于80℃的水浴锅中恒温震荡20min(震荡频率与常温下的对照处理时相同)后，立马取出，自来水降温至室温后，稀释涂平板检测活菌含量，取平均值记为V处理。
(5)采用如下公式计算芽孢率：芽孢率：＝V处理/VCK×100％。
本申请中发酵液抑菌活性物质含量测定方法：
(1)实验室保藏的西瓜枯萎病病原菌(F.oxysporum)在PDA斜面培养基上28℃活化24h(28℃培养)；再划线接种PDA平板培养基，28℃恒温培养，直至长出孢子。
(2)用无菌生理盐水洗下孢子，得西瓜枯萎病病原菌孢子液，血球板计数后，冰箱冷藏备用。
(3)SUNO-18S-36株待测发酵液离心后，取上清液，过0.22um的无菌滤膜，得到的无菌清液备用。
(4)将西瓜枯萎病原菌孢子液用PDA液体培养基稀释，制备1×105个/mL的西瓜枯萎病原菌孢子的悬浮液；
(5)取无菌试管15只(一组试管)，排成一排，每管中加入2mL浓度为1×105个/mL的枯萎病病原菌孢子悬浮液。
(6)在第1管中加入2mL待测发酵原液处理后所得的无菌清液，混匀后，吸取2mL混合液到第2管中，如此连续，稀释至第14管，混匀后从第14管中吸取2mL弃去。第15管作为对照。在稀释过程中，每次吸取2mL到下一个试管后，要换掉移液管。
(7)此时，从第1管开始到第14管，与原发酵无菌清液对比，分别稀释了21、22、23……214倍。
(8)上述实验，重复3组。
(9)将混合好的试管塞好塞子，置于28℃的恒温箱中培养36h。
若检查对照管中西瓜枯萎病病原菌生长情况良好，那么，以肉眼观察，稀释倍数最大的管无菌体生长，该最大的稀释倍数即为发酵液无菌清液的MIC(最小抑菌含量)，也将该最大的稀释倍数对应的稀释液中抑菌活性物质的量定义为1个活性单位(1U)。原发酵液无菌清液的抑菌活性物质含量＝最大的稀释倍数×1U，单位为U/ml。
实施例1菌株筛选及鉴定
一.菌株的分离、筛选
1.材料与方法
1.1样品
一般田块番茄地病株2株、根际土壤样品3个；
一般田块西瓜地病株2株、根际土壤样品3个；
盐渍化田块地番茄病株3株、根际土壤样品5个；
合计样品18个。
1.2培养基
LB液体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，用水溶解后定容至1L，调节pH至7.0，得到LB液体培养基。在上述LB液体培养基中加入15g琼脂粉，得到LB固体培养基。
PDA液体培养基：在去皮的已切成小块的200g土豆中，加入800mL水后加热至沸腾，维持20～30min，用纱布趁热过滤，滤液用水补足体积至1000mL，得PDA液体培养基。在上述PDA液体培养基中加入15g琼脂粉，得到PDA固体培养基。
解磷平板培养基：葡萄糖10g、磷酸钙5g、氯化钠0.3g、硫酸铵0.5g、琼脂粉15g，用水溶解后定容至1L，调节pH至7.0～7.5。
1.3菌株分离
病株处理：将各病株的发病部位用无菌刀截取1cm长的茎秆2段，无菌水冲洗表皮后，放入装有100mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(里面预装有无菌玻璃珠10个)，恒温摇床30℃、100rpm，震荡2h。
根际土壤样品：每个土壤样品混匀后取1g，放入装有100mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(里面预装有无菌玻璃珠10个)，恒温摇床30℃、100rpm，震荡2h。
取各病株和土壤样品震荡处理后所得上清液，连续梯度稀释，分别在LB固体培养基和PDA固体培养基平板上均匀涂布，在恒温30℃培养箱中培养24～36h后，挑取生长繁殖快的单菌落，再分别进行划线分离纯化培养2代，挑取纯化后的单菌落，斜面培养后编号，保藏于冰箱中备用。
1.4菌株复筛
1.4.1解磷菌筛选
将保藏于冰箱中的菌株，活化后分别点接在解磷平板培养基上(每个平板点接2个细菌或1个真菌)，在恒温30℃培养箱中培养48～72h后，观察是否有解磷透明圈出现。
1.4.2对植物病原菌的拮抗筛选
将1.4.1中在解磷培养基上有透明圈的菌株，进行植物病原菌的拮抗筛选。
1.4.2.1具有解磷功能的微生物样品制备
将具有解磷功能的细菌接种至LB液体培养基，在30℃、150rpm摇床上培养24h得菌悬液，将直径5mm的无菌滤纸片，吸附该菌悬液后，置于无菌空白平皿中晾干。备用。
将具有解磷功能的真菌接种至PDA固体培养基，在28℃下培养至菌丝覆盖整个平板，选择长势良好、菌丝覆盖均匀的平板，用无菌打孔器打直径(d)为5mm的圆形菌块，备用。
1.4.2.2对细菌性病原菌的拮抗作用
采用抑菌圈法，考察具有解磷功能的细菌对番茄青枯病病原菌、大白菜软腐病病原菌的拮抗作用，具体方法如下：病原菌菌悬液稀释涂LB固体培养基后，放置1.4.2.1中吸附了待测菌菌悬液的滤纸片，在恒温30℃培养箱中培养36h后，观察是否有抑菌圈出现。
采用平板培养法，考察具有解磷功能的真菌对番茄青枯病病原菌、大白菜软腐病病原菌的拮抗作用，具体方法如下：病原菌菌悬液稀释涂LB固体培养基后，中间放入一个1.4.2.1中已制备好的菌块，置于恒温培养箱中28℃下培养，观察是否有抑菌圈出现。
1.4.2.3对真菌性病原菌的拮抗作用
用平板对峙培养法，考察具有解磷功能的细菌/真菌对西瓜枯萎病病原菌的拮抗作用，具体方法如下：
制备PDA固体培养基，在一边点接西瓜枯萎病病原菌：
(1)如果考察具有解磷作用的细菌的拮抗作用，则在另外一边放置1.4.2.1中吸附了待测细菌菌悬液的滤纸片，在恒温30℃培养箱中培养48h后，观察是否有拮抗作用产生。
(2)如果考察具有解磷功能的真菌的拮抗作用，则在另外一边放置1.4.2.1中已制备好的菌块，置于恒温培养箱中28℃下培养，观察是否有拮抗作用产生。
2.结果
2.1菌株分离结果
一共分离得到122株菌株，其中细菌78株，真菌44株。给上述菌株进行编号，来源于病株的，以P开头进行标记；来源于土壤的，以S开头进行标记。
2.2解磷菌筛选结果
上述122株菌，通过第一步的解磷平板培养基筛选，得到14株有透明圈的菌株，即具有解磷功能的微生物。其中，细菌有：P-4、P-7、P-19、S-07、S-11、S-15、S-22、S-25、S-33、S-36、S-45。真菌有：P-37、S-58、S-62。
2.3植物病原菌的拮抗筛选结果
将具有解磷功能的14株微生物菌株，通过与植物病原菌进行拮抗试验。结果表明，绝大部分菌株对番茄青枯病病原菌、大白菜软腐病病原菌、西瓜枯萎病病原菌表现为无拮抗作用或拮抗作用较弱或只对个别病原菌有拮抗作用，只有S-36菌株对上述3种病原菌皆有拮抗作用，特别是对番茄青枯病、西瓜枯萎病病原菌、西瓜枯萎病病原菌的拮抗作用明显。将S-36菌株命名为SUNO-18S-36株。
由实验结果可知，SUNO-18S-36株不仅对植物病原菌的抑菌作用明显，而且能将土壤中难溶的磷盐转化为植物易吸收的可溶性磷的能力。这不仅增加了土壤肥力，而且还改善了土壤结构和环境。在农业上非常具有开发前景。
二.SUNO-18S-36株的鉴定
染色：按本领域常规方法对SUNO-18S-36株进行革兰氏染色，结果表明，该菌株为革兰氏阳性细菌。
形态特征：在LB平板培养基上30℃培养2天，观察菌落形态、颜色。取菌体涂片，染色后观察菌体形态。结果为：菌落白色、不透明，前期菌落较水润，后期皱褶。菌体为直或近直的杆状，只含有一个芽孢，具运动性。如图1和图2。
PCR扩增SUNO-18S-36株的16S rDNA序列。测序结果如SEQ ID NO:1所示。经BLAST分析发现，SUNO-18S-36株的16S rDNA序列与Bacillus velezensis CR-502株相似度达到99.85528％，因此SUNO-18S-36株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株进行保藏。
保藏信息如下：
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36
Bacillus velezensis SUNO-18S-36。
保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学。
保藏日期：2021年1月18日。
保藏编号为：CCTCC NO：M 2021099。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的性质
一.对酸碱性和盐度的耐受性
1.材料与方法
1.1SUNO-18S-36株的活化：从贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株斜面中，用无菌接种针挑取部分菌苔至装有LB液体培养基的摇瓶中(250mL摇瓶装液量50mL)，在30℃、150r/min下培养24h后，LB培养基变浑浊，待用。
1.2以LB培养基为基础培养基，分别用盐酸或NaOH水溶液调节pH为：3、4、5、6、7(对照)、8、9、10、11，在250mL三角瓶中装入上述pH的培养基50mL，每个pH试验3个重复。将各pH的培养基灭菌后，冷却至室温，若pH因灭菌发生变化，通过加酸或加碱，调整pH至接近灭菌前的数值，并记录实测pH值。在灭菌后并调节好pH的三角瓶中，加入本实施例标题1.1中已培养好的菌液1mL/瓶，在30℃、150r/min下培养36h后，观察培养基是否变浑浊，并划线接LB固体培养基，在恒温30℃培养箱中培养24～36h，观察是否有活菌长出。
1.3以去除了氯化钠的LB固体培养基为基础培养基，分别配制氯化钠质量百分含量为0％、1％(对照)、4％、8％、9％、10％、10.5％、11％的固体培养基。在含有各浓度氯化钠的LB固体培养基上，分别划线接种SUNO-18S-36株，在恒温30℃培养箱中培养，观察是否有活菌长出。
2.结果与讨论
培养结果见表1和表2。
表1 不同pH对SUNO-18S-36株生长的影响
| 设计pH值 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7(对照) | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 灭菌、调整后实测pH | 3.03 | 3.98 | 5.09 | 6.02 | 7.03 | 7.95 | 9.06 | 10.03 | 11.0 |
| 培养液是否浑浊 | - | + | ++ | +++ | +++ | +++ | ++ | + | - |
| 平板是否有菌长出 | - | + | ++ | +++ | +++ | +++ | ++ | + | - |
表2 不同盐度对SUNO-18S-36株生长的影响
备注：表1和表2中“+”表示有菌长出，+数量越多表示长得越好；“—”表示无生长。
由表1可知，贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株对酸碱的耐受范围较宽，可以在pH4～pH10之间生长。
由表2可知，培养24h，只有盐含量为9％及以下的平板能观察到活菌长出，当培养时间延长到96h时，盐含量为10％和10.5％的平板也能观察到活菌长出。但11％的还是观察不到活菌长出。由此可见，该贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株最高可以耐受10.5％的盐度，耐盐度非常高。
重盐碱地一般含盐量超过0.6％且pH值在9.5以上，出苗率低于50％。贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株可以在pH4～pH10之间生长，最高可以耐受10.5％的盐度，由此可见，该贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株可以在重盐碱地存活并发挥作用。
此外，由于贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的pH和盐度的耐受范围广，可以在高盐的污水处理中应用，通过曝气来净化水质，降低污染。
二.制备贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的液体菌剂
发酵培养基含有：蛋白胨12g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖50g/L、NaCl 12g/L、MgCl20.46g/L、KH2PO4 0.7g/L、CaCO3 3g/L，pH7.2。
将发酵培养基置于发酵罐中，发酵罐体积50L，装液量35L，灭菌。
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株种子液，按照接种量1％(V/V)接入发酵罐中，在通气量1:1(通气量＝V通气体积/min：V装液量)、搅拌转速150r/min、30℃下培养36h，得到液体菌剂。液体菌剂中活菌含量为15×108cfu/mL。
在发酵罐培养过程中，发酵培养条件可以根据菌株的发酵特性进行适当调节，为控制其代谢过程，可以在菌株不同的生长阶段采用不同的通气量和搅拌转速，得到活菌含量为1×107～2×109cfu/mL的液体菌液。
三.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的解磷能力测定
解磷液体培养基：取葡萄糖10g、磷酸钙5g、氯化钠0.3g和硫酸铵0.5g，加水定容至1L，调节pH至7.0。250mL三角瓶中解磷液体培养基的装液量为50mL，每个三角瓶中接种SUNO-18S-36株种子液2mL，在30℃、搅拌转速为150r/min的条件下，分别培养72h、96h取发酵液进行离心，取上清液，采用硝酸-高氯酸进行消解后(GB 11893)，通过钼锑抗比色法测定上清液中磷的含量，3次重复，计算平均值。以不接菌的培养基为对照(CK)。
通过如下公式计算解磷率：解磷率＝上清液中磷含量(mg/L)/总磷含量(mg/L)×100％。
总磷的测定方法按照GB 11893进行。
结果见表3。
表3 贝莱斯芽孢杆菌解无机磷能力测定
由该表可知，与对照相比，贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的解磷率最高能达到62.98％，而对照组解磷率只有2.07～2.14％，因此SUNO-18S-36株解磷效果显著。
由此可见，贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株可提高难溶性磷盐的溶解度，从而增加土壤中有效磷的含量，这不仅有利于减少磷肥的使用量，而且还能充分利用土壤中的磷元素，达到改良土壤的目的。
四.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株对农药残留的降解作用
1.化学农药：
(1)2.5％高效氯氟氰菊酯乳油；
(2)50％多菌灵悬浮剂；
(3)41％草甘膦异丙胺盐水剂。
2.试验方法：
根据上述三种药剂田间使用时的稀释浓度，向LB液体培养基中添加上述化学农药，控制终浓度分别如下：2.5％高效氯氟氰菊酯乳油：25ppm；50％多菌灵悬浮剂：500ppm；41％草甘膦异丙胺盐水剂：4000ppm(酸含量)。
每个250ml三角瓶分别加入添加了农药的培养基，装液量为50ml，含有每种农药的培养基分别设置5个重复。在各三角瓶中，分别接种本实施例标题二制备的贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株发酵液(15×108cfu/mL)1mL；以不接菌液的含化学农药的LB液体培养基(各农药的终浓度同上)作为空白对照，设5个重复。接菌后连续培养4天，每天取培养液离心，取上清液，通过HPLC测定化学农药有效成分的含量。
化学农药降解率采用如下公式计算：降解率＝(1-C1/Co)×100％。
式中：C1：接种活菌培养之后的化学农药有效成分含量；C0：空白对照培养之后的化学农药有效成分含量。
3.结果与讨论
结果见如下表4。
表4 SUNO-18S-36株培养不同时间时培养基中的化学农药含量
由表4结果可知，培养4天后，2.5％高效氯氟氰菊酯乳油的有效成分降解率可达94.65％、50％多菌灵悬浮剂的有效成分降解率可达92.96％，降解效果非常明显。对41％草甘膦异丙胺盐水剂的有效成分降解率稍低，只有27.12％。
由该数据可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株对上述3种化学农药皆能降解，特别是对高效氯氟氰菊酯和多菌灵，效果显著。因此在田间使用贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株，可以明显降低上述3种化学农药的残留，从而减少土壤、农产品中的农药残留，有利于农业的健康、绿色发展，有利于提高食品安全，有利于保障人民身体健康。
五.贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株发酵液对西瓜枯萎病病原菌的抑制作用
利用平板对峙培养法测定贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株对西瓜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用，包括如下步骤：
(1)制备PDA平板。
(2)西瓜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)在PDA平板上接种后，28℃培养至菌丝覆盖整个平板，选择长势良好、菌丝覆盖均匀的平板，用无菌打孔器打直径(d)为5mm的圆形菌块，备用。
(3)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株在LB固体平板上活化后，收集菌体配成1.5×108cfu/mL的菌悬液，然后吸取2mL菌悬液与冷却至45℃左右(不烫手)的PDA培养基(100mL)混匀，立即铺平板，冷却凝固后备用。
(4)在步骤(3)制备的含有SUNO-18S-36株的固体平板中间放入一个步骤(2)中的菌块，置于恒温培养箱中28℃下培养3天，测定病原菌菌落直径，设3次重复，取平均值(D处理)。以无贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36菌液添加的固体平板中间放入一个病原菌菌块作为对照，置于恒温培养箱中28℃下培养3天，测定病原菌菌落直径，3次重复，取平均值(DCK)。
(5)抑制率：(DCK─D处理)/DCK×100％，其中，D处理为含贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36菌液的固体平板上的病原菌菌落直径平均值，DCK为对照的病原菌菌落直径平均值。
具体结果如下表5。
表5 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株对病原菌的抑制作用
由表5数据可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株对西瓜枯萎病病原菌具有良好的抑制作用，具有开发成防治植物病害菌剂的潜力。
实施例3考察不同培养基配方对发酵活菌含量及芽孢率的影响
配制发酵培养基A、B和C。
发酵培养基A含有：蛋白胨12g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖50g/L、氯化钠12g/L、氯化镁0.46g/L、磷酸二氢钾0.7g/L和碳酸钙3g/L，pH7.2。50升发酵罐中装液量70％。
发酵培养基B含有：花生饼粉15g/L、玉米淀粉20g/L、葡萄糖10g/L、碳酸钙2g/L、硫酸铵0.5g/L和七水硫酸镁0.2g/L，pH7.2。50升发酵罐中装液量70％。
发酵培养基C含有：葡萄糖5g/L、玉米浆15g/L、酵母粉12g/L、蚕蛹粉7.5g/L、碳酸钙7.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸钙5g/L，pH7.2。50升发酵罐中装液量70％。
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的种子液，按照接种量为1％分别接入上述装有各培养基的50升发酵罐中，培养条件为：通气比为1：1、搅拌转速为250r/min、罐压0.05MPa、培养温度30℃。
培养时间达到18h以后，每隔6小时，测定发酵液中的的活菌含量、芽孢率。结果见下表6。
表6不同发酵培养基对活菌含量、芽孢率的影响
由表6可知，发酵培养基C在36h的活菌含量达到最高，为61.5×108cfu/mL，随着时间的延长，芽孢率逐步升高，活菌含量逐渐下降。发酵培养基A和发酵培养基B，分别在48h和42h活菌含量达到最高，分别为16.0×108cfu/mL和48.9×108cfu/mL。芽孢率也是随着发酵时间的延长而上升。活菌含量达到最高后，随着时间的延长逐渐下降。由表6的发酵结果可知，发酵培养基C要优于发酵培养基A和B。
实施例4不同金属离子/盐对培养基芽孢形成的影响比较
在发酵培养基C的基础上，通过摇瓶考察了不同金属离子/盐对芽孢形成的影响。
基础培养基的成分及含量：葡萄糖5g/L、玉米浆15g/L，酵母粉12g/L，蚕蛹粉7.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸钙5g/L，pH7.2。
发酵培养基C：在基础培养基中添加终浓度为7.5g/L的碳酸钙。
发酵培养基D：在基础培养基中添加终浓度为15g/L的葡萄糖酸钙。
发酵培养基E：在基础培养基中添加终浓度为0.075g/L的硫酸锰。
发酵培养基F：在基础培养基中添加终浓度为7.5g/L的碳酸钙和0.075g/L的硫酸锰。
发酵培养基G：在基础培养基中添加终浓度为15g/L的葡萄糖酸钙和0.075g/L的硫酸锰。
将发酵培养基C-G分别装入500ml三角瓶中，每个三角瓶中的装液量均为100mL。将种子液按照接种量为1％接入各发酵培养基中，分别培养36h和48h，采用稀释涂平板法(按照行业标准NY/T 2321-2013中活菌测定方法及计算规则)测定活菌含量，按照本发明中的方法测定芽孢率。
结果如表7。
表7金属离子/盐对活菌含量和芽孢率的影响
表7结果表明，五种盐的不同组合，培养36h、48h时，活菌含量差别不大。培养48h后，C、D、E发酵培养基的芽孢率差别不大，F和G发酵培养基的芽孢率明显高于C、D、E。特别是G发酵培养基组合的芽孢率，高达91.34％。即：葡萄糖酸钙和硫酸锰组合后对芽孢形成的效果明显高于单独的葡萄糖酸钙和硫酸锰，也明显高于碳酸钙与硫酸锰的组合。
实施例5不同培养方法对发酵结果的影响
1.培养方法1
发酵培养基含有：葡萄糖5g/L、玉米浆15g/L、酵母粉12g/L、蚕蛹粉7.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、葡萄糖酸钙15g/L、硫酸锰0.075g/L、磷酸钙5g/L，pH7.2。50L发酵罐中，发酵培养基的装液量为70％。
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的种子液，按照接种量为1％接入发酵培养基中，培养条件为：通气比为1：1、搅拌转速为250r/min、罐压0.05MPa、培养温度30℃，培养时间为54小时。
2.培养方法2
在50L发酵罐中按照装液量为60％装入前期基础培养基。前期基础培养基含有：葡萄糖5g/L、玉米浆5g/L、酵母粉8g/L、蚕蛹粉7.5g/L、葡萄糖酸钙15g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸钙5g/L，pH7.2。
将350mL贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36的种子液，接入发酵罐中。
发酵过程中，控制通气比为1：1、搅拌转速为250r/min、罐压0.05MPa、培养温度30℃。在发酵时间达到18h时，流加补料培养基，2h内补料完毕。发酵时间为54小时。
补料培养基体积为5L。补料培养基是含有：玉米浆75g/L、酵母粉36g/L、硫酸锰0.525g/L的水溶液。
3.培养方法3
在50L发酵罐中按照装液量为60％装入前期基础培养基。前期基础培养基含有：葡萄糖5g/L、玉米浆5g/L、酵母粉8g/L、蚕蛹粉7.5g/L、葡萄糖酸钙15g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸钙5g/L，pH7.2。
准备接种前，控制发酵罐温度为30℃、搅拌转速250r/min、通气比为1：1，罐压0.05MPa，稳定后，标定溶氧(DO)为100％。将350mL贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的种子液，接入发酵罐中。
发酵过程中，控制通气比为1：1、搅拌转速为250r/min、罐压0.05MPa、培养温度30℃。贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株培养过程中，当DO>14.5％时，自动流加补料培养基，当DO≤14.5％时，停止补料。一直到补料培养基消耗完毕。补料结束后，维持发酵条件直至发酵时间为54小时，发酵结束。
补料培养基的体积为5L，补料培养基是含有：玉米浆75g/L、酵母粉36g/L、硫酸锰0.525g/L的水溶液。
4.培养方法4
将培养方法3中的补料条件改为当DO>30％时，自动流加补料培养基，当DO≤30％时，停止补料，其他不变。
8.各种培养方法的效果检测
在发酵时间达到18h以后，每隔6h取发酵液，检测活菌含量、芽孢率和抑菌活性物质含量。具体结果见表8。
表8不同培养方法对发酵结果的影响
培养方法1与其他方法比较，差异在于：培养方法1是一次性将所有培养基全部投料，而另外3个方法是将培养基分为2部分，一部分作为基础培养基，另一部分作为补料培养基。由表8结果可知，采用补料的方式(培养方法2、3、4)来培养贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36-18S-36株，其效果(活菌含量、芽孢率、活性物质含量)明显优于不补料的培养方法(培养方法1)。
培养方法2和培养方法3、4的差异为：补料的判断依据不一样。培养方法2是在培养18h后，持续不断地流加补料培养基。而另外2个方法则根据DO的反弹来判断补料时机。由表8结果可知，采用根据DO来判断补料时机(培养方法3、4)的效果(活菌含量、芽孢率、活性物质含量)明显优于固定补料方式(培养方法2)。
培养方法3和培养方法4的差异为：DO反弹的设定值不一样。培养方法3设定DO＝14.5％为是否补料的时机点，而培养方法4则设定DO＝30％来判断。由表8结果可知，由于培养方法4设置的DO＝30％偏高，因此菌体处于饥饿状态的时间较长，这影响了菌体的代谢繁殖，因此培养方法4的发酵液中最高活菌含量为36h的367×108cfu/mL，低于培养方法3在36h的433×108cfu/mL，略高于培养方法2在36h时的活菌含量335×108cfu/mL。也影响了活性物质的代谢产生。由于培养方法4中的菌体处于饥饿状态的时间多于培养方法3，这也导致在36h和42h，培养方法3的芽孢率略高于方法4。但在48h以后，上述2个方式的芽孢率相差不大。
实施例6不同后处理方法对芽孢率的影响
采用实施例5中的培养方法3，培养到36h时，通过如下方式处理发酵液：将发酵液导入蛇管中，在蛇管内37℃下加热5min，然后45℃加热10min，测定活菌含量和芽孢率。以不经过蛇管加热的发酵液为对照。结果见表9。
表9发酵液不同处理方式对活菌的影响
由表9可知，通过蛇管对发酵液急速升温处理，可以明显提高发酵液中的芽孢率，发酵液中的芽孢含量由330×108cfu/mL升高到416×108cfu/mL，其芽孢率从72.05％提高到95.63％，效果明显。在芽孢率要求不低于95％的情况下，该工艺能明显缩短发酵时间，减少能耗。
采用上述优化的培养工艺，可以得到一个较优的结果。得到高活菌含量、高芽孢率的发酵液。该工艺有利于以贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36为有效成分的菌剂的进一步开发。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏农（广德）生物科技有限公司
<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌SUNO-18S-36株的发酵方法
<130> 202106032
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<213> 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SUNO-18S-36株
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tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
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aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
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tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aagggacaga ggt 1433
Claims (6)
1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的发酵方法，其特征在于，采用如下培养基：葡萄糖4～10g/L、玉米浆5～20g/L、酵母粉5～25g/L、蚕蛹粉5～10g/L、碳酸钙0～10g/L、葡萄糖酸钙0～30g/L、七水硫酸镁0.1～1g/L、硫酸锰0～0.1g/L、磷酸钙0～10g/L，pH7.0～7.5，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SUNO-18S-36株的保藏号为CCTCC NO：M 2021099。
2.根据权利要求1所述发酵方法，其特征在于所述培养基含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5。
3.根据权利要求1或2所述发酵方法，其特征在于先采用基础培养基进行发酵，在发酵过程中流加补料培养基；所述基础培养基中含有葡萄糖4～6g/L、玉米浆4～6g/L、酵母粉7～9g/L、蚕蛹粉6.5～8.5g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、葡萄糖酸钙14～16g/L、磷酸钙4～6g/L，pH7.0～7.5；所述补料培养基添加后，发酵液中玉米浆、酵母粉、硫酸锰的总浓度分别为：玉米浆14～16g/L、酵母粉11～13g/L、硫酸锰0.05～0.08g/L。
4.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于发酵过程中控制：通气比为（0.8～1.2）:1、温度28℃～32℃、转速200～300rpm、罐压0.03～0.08MPa，发酵时间为30～60小时。
5.根据权利要求4所述发酵方法，其特征在于当发酵液中的溶氧>14.5%时，流加补料培养基；当发酵液中的溶氧≤14.5%时，停止补料。
6.根据权利要求5所述发酵方法，其特征在于培养36小时后的发酵液在37℃加热处理5分钟，然后在45℃加热处理10分钟。
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