CN112662585B

CN112662585B - 一株萎缩芽孢杆菌dx-9及其应用

Info

Publication number: CN112662585B
Application number: CN202110030643.0A
Authority: CN
Inventors: 仲乃琴; 赵盼; 曹晶晶; 汪志琴; 杨敬
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: AU2021100996A4; CN112662585A

Abstract

本发明属于马铃薯疮痂病病防治技术领域。本发明公开了一株萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX‑9，其保藏编号为CGMCC NO.21600。本发明提供的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX‑9，培养简单、周期短、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，能够有效分解土壤中的难溶性磷，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌的生长，在马铃薯疮痂病的生物防治中具有非常广泛的应用前景。

Description

一株萎缩芽孢杆菌DX-9及其应用

技术领域

本发明属于马铃薯疮痂病病防治技术领域。

背景技术

中国的磷矿资源储量丰富，但可开发利用的储量却很小，仅占总储量的1/8 左右，中国70％的磷矿开采都用于生产含磷肥料，开发利用的强度逐年增加。资源的不合理使用加速了国内磷矿石资源的枯竭，长期以来，由于化学肥料的不合理使用，带来了一系列的土壤问题，土壤中大部分的磷处于固定的无效磷状态，难以被植物直接利用，微生物是土壤生态系统的重要组成部分，微生物的种类和数量对土壤磷的转化和有效性影响巨大，一些微生物可以通过溶解不溶性磷酸盐来提高植物的有效磷库，被称为解磷菌，解磷菌种类繁多，根据种类，可分为细菌、真菌、放线菌等，目前研究的解磷菌细菌居多，解磷菌的应用可以有效提高土壤中无效磷的含量，对于肥料的高效利用和作物的生长发育均有不可忽视的作用。

马铃薯土传病害是影响马铃薯品质的限制性因素之一，通过微生物菌剂来防控这一病害成为新的研究方向，因此，寻求绿色环保的微生物菌剂来提高肥料利用率，降低土传病害的发生，改善土壤生态环境是当前农业肥料利用过程中急需解决的问题之一。

本发明生产一株具有解磷抗病功能的萎缩芽孢杆菌及其发酵工艺，能够分解土壤中难溶性磷，促进作物生长发育，抑制马铃薯疮痂病，改善土壤生态环境。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9，其保藏编号为CGMCC NO.21600。

本发明所提供的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.21600，保藏日期为：2021 年1月7日，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号。

本发明的第二目的是提供萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9在防治马铃薯疮痂病菌剂中的应用。

本发明提供的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9，培养简单、周期短、无生态毒性、可利用的碳源种类丰富，能够有效分解土壤中的难溶性磷，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌的生长，在马铃薯疮痂病的生物防治中具有非常广泛的应用前景，有利于农业的无公害生产和农业可持续发展。

附图说明：

图1是萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9筛选结果图。

图2是萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9解磷结果图。

图3是萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9抑菌结果图。

图4是萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9马铃薯疮痂病防治效果盆栽结果图。

图5是萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9耐盐结果图。

图6是萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9pH敏感性测定结果图。

具体实施方式：

如无特殊说明，下列实施例中待测菌株均指萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)DX-9。

如无特殊说明，下列实施例中的活化均指萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9在马铃薯固体培养基上扩大培养三次。

实施例1

菌种的分离与鉴定

1.培养基：

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose agar,PDA)培养基(g/L)：马铃薯200 g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然。

2.菌株来源：

萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9分离自甘肃定西马铃薯土壤。取1g 土样放入50ml离心管中，加入10ml无菌水震荡均匀，于37℃、200rpm的摇床上振荡30min，静置至澄清。在超净工作台中将制备好的土壤悬浮液进行梯度稀释，分别取100μL 10-3、10-4、10-5倍稀释液在LB固体培养基上进行涂布，重复3次，37℃培养24h。24h后在超净工作台中挑取形态不同的菌落分别划线纯化，37℃培养24h，重复纯化3次。将得到的纯的单菌落转移到试管斜面培养基中，放入4℃冰箱保存备用。

3.筛选结果：

分离得到如图1所示，菌株分类特性：呈椭圆状，大小为0.5～1.0μm×2.0～4.0 μm，可运动，好氧生长，芽孢椭圆形、中生、不膨大，无荚膜，无芽孢壁，周生鞭毛，能运动，单个成对排列。不形成芽孢。革兰氏阳性。可在低氧压的植物组织中生长，菌落轻微凸起。在碳水化合物培养基上常呈微黄色，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

4.细菌菌株鉴定方法：

采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以待测菌株基因组DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R扩增目的片段，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR原液送博迈德生物工程股份有限公司测序。16srRNA基因序列分析，经过序列对比鉴定，菌株DX-9以JXM 9070 为标准菌株的萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)，测序如序列表中SEQ ID NO.1 所示。

萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)菌株DX-9已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.21600，保藏日期为：2021年1月7日，保藏单位简称为CGMCC，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2

菌株生理生化分析

采用梅里埃API 20NE非发酵G-杆菌鉴定试剂盒试验菌株DX-9生理生化指标。萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9能利用柠檬酸盐，能利用葡萄糖、蔗糖，不能利用鼠李糖。详细结果如下表：

表生理生化性质分析

Table Analysis of Physiological and Biochemical Properties

注：+：阳性反应；-：阴性反应

实施例3

菌株解磷能力试验结果

解磷培养基(g/L)：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸钾0.3g，硫酸亚铁0.03g，磷酸三钙5.0g，琼脂15g。

在解磷培养基上滴6μL点接菌株DX-9，生长5天之后有解磷圈产生(如图2所示)，菌落轻微凸起，污白色，着色均匀，不透明，解磷圈大小为8mm。证明该菌株具有解磷能力，即将植物不能吸收的无效磷转化成植物可以吸收的有效磷。

实施例4

菌株对疮痂链霉菌抑制效果

马铃薯疮痂病病原菌4.1765在马铃薯培养基上28℃培养3天；用0.2ml无菌水刮取孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原体悬液，要求100ul体积涂布平板时菌丝生长后可以铺满平板表面。

取活化后的菌株DX-9于50ml马铃薯液体培养基，37℃，摇床培养2-5天。发酵液经12,000r/min离心1min钟后，弃上清，沉淀悬浮于同体积的无菌水中，制备细胞悬液。

将试验马铃薯疮痂病病原菌4.1765涂布于不同平板上(PDA)，在平板上局部点接6ul菌株DX-9，28℃培养，3天以后观察。得到如图3所示的实验结果：萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9能有效抑制试验马铃薯疮痂病病原菌 4.1765生长。抑菌圈直径达20mm。

实施例5

菌株耐盐测试试验

基础培养基为LB液体培养基，向LB固体培养基中加入NaCl调节盐浓度为1％、3％、5％、9％、11％，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。

将活化后的待测菌株DX-9分别接种于五种不同盐浓度的LB液体培养基上，以不接种菌的培养基为空白对照，放入37℃的恒温培养箱中培养24h观察菌株DX-9的生长情况。测定OD值。结果如下，随着NaCl浓度的升高，菌株 DX-9的浓度逐渐降低，但是当浓度达到11％时，还能正常生长。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐盐性，适合作为微生物盐碱地改良剂。

实施例6

菌株对不同pH敏感性测定

基础培养基LB液体培养基，分别调节pH值为3、5、6、7、8、9、11。将活化后的待测菌株DX-9接种于六种pH值的敏感性测定培养基上，放入37℃的恒温培养箱中培养24h，观察待测菌株DX-9的生长情况。若菌株DX-9能够正常生长，说明该菌株DX-9能够耐受该pH；反之，则说明该菌株DX-9不能耐受该pH。测定其浓度OD值，结果如下，当pH小于5以及大于9，菌株DX-9生长明显受到抑制，pH为9还能继续正常生长。证明该菌株可以在盐碱地改良中应用，具有耐碱性，适合作为微生物盐碱地改良剂。

实施例7

菌株对马铃薯疮痂病防治盆栽试验

将马铃薯品种夏波蒂组培苗移栽至蛭石的花盆(直径17cm)中，生长10d 后选取长势一致的幼苗，采用灌根法接种100mL疮痂链霉菌孢子悬液液(1×10⁶ CFU/mL)于花盆中；再生长10d后接入100mL萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) 菌株DX-9的发酵液(1×10⁶CFU/mL)，对照组不加生防菌，并以未接种任何菌剂的处理为空白对照，每个处理重复3次。待马铃薯收获后，依据疮痂病病害分级标准，分别统计发病率、病情指数和防治效果。统计结果显示，只有病原菌处理的马铃薯发病率达到92.31％，达到75％，而DX-9处理之后的马铃薯发病率为71.43％，病情指数为19.64％，菌株DX-9对马铃薯疮痂病的防效达到74％。马铃薯疮痂病发病统计：

分级标准：

0级：薯皮健康，无病斑

1级：发病病斑面积为0-1/6

2级：发病病斑面积为1/6-1/3

3级：发病病斑面积为1/3-1/2

4级：发病病斑面积为1/2以上

统计表

病薯级别	CK(水)	病原菌(4.1765)	病原菌(4.1765+DX-9)
				0级	13	1	4
1级	0	0	9
				2级	0	2	1
3级	0	5	0
				4级	0	5	0
总薯数	13	13	14
				总薯重	186.31g	150.24g	180.14g
总病薯数	0	12	10
				总病薯重	0g	147.77g	155.64g
发病率	0	92.31％	71.43％
				病情指数	0	75％	19.64％
防效	0	55.36％	74％

发病率(％)＝发病块茎数/调查总块茎数×100

病情指数＝"(各病级块茎数×该病级数代表值)/(调查个体总和×最高病级数)×100

本发明提供的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9，培养简单、周期短、无生态毒性、耐盐碱、可利用的碳源种类丰富，能够有效分解土壤中的难溶性磷，同时能够有效抑制马铃薯疮痂病病原菌的生长，在马铃薯疮痂病的生物防治中具有非常广泛的应用前景。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)菌株DX-9及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1395

<212> DNA

<213> 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)

<400> 1

aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60

aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 120

acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac 180

ctcgcggtct cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240

ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300

agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360

cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 420

aggggaagcc ctatctctag gggtgtcaga ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480

ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540

tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa 600

ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc 660

taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc 720

cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac 780

tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg 840

ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa 900

cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 960

aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020

ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080

cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1140

gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccatt acctcaccaa 1200

ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg aagccacctt ttatgtttga 1260

accatgcggt tcaaacaagc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccagtct 1320

tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc 1380

ccatcttccg ctcga 1395

Claims

1.一株萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9，其保藏编号为CGMCC NO.21600。

2.萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9在制备防治马铃薯疮痂病菌剂中的应用。

3.萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9在制备解磷菌剂中的应用。

4.萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)DX-9在制备微生物盐碱地改良剂中的应用。