CN112391312B - 一种新种链霉菌及其在防治植物卵菌病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新种链霉菌(Streptomyces sp.)A2‑16，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.19402，以及该链霉菌或其发酵产物在防治植物卵菌病害中的应用。本申请从中国马铃薯产区土壤中分离鉴定出一株链霉菌新种A2‑16，经实验证实，A2‑16菌体、无菌发酵液对马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉均有显著的抑制作用，是一株效果显著的生防菌。A2‑16无菌发酵液经100℃处理10min对致病疫霉仍有显著的抑制作用，该生防菌A2‑16对紫外辐射及高浓度盐离子耐受。该菌对马铃薯晚疫病常用的化学农药耐受，可与化学农药联合施用达到减少化学农药使用的目的。

Description

一种新种链霉菌及其在防治植物卵菌病害中的应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种链霉菌，具体涉及一种分离自马铃薯产区的新种链霉菌及其在防治植物卵菌病害中的应用。
背景技术
马铃薯是茄科茄属双子叶植物，也是全球第四大粮食作物，其地位仅次于小麦、水稻和玉米。而由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病，是马铃薯生产上最具毁灭性的病害之一。
致病疫霉归属于卵菌，可通过空气进行传播。致病疫霉在田间发病呈中心发病症状，可在较短时间内致使田间大面积发病，造成绝收。目前马铃薯晚疫病的防控主要依赖于化学农药防治，但该方法以环境污染和威胁粮食安全为代价。因此，积极开展致病疫霉的生物防治剂的挖掘与研究，尤其是来自马铃薯产区本土化的生物防治剂的挖掘，对我国马铃薯晚疫病发生区的科学防治具有十分重要的作用。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种分离自马铃薯产区的新种链霉菌及其在防治植物卵菌病害中的应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种新种链霉菌(Streptomyces sp.)A2-16，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.19402。
上述的链霉菌或其发酵产物在防治植物卵菌病害中的应用。
所述植物卵菌病害为马铃薯晚疫病。
所述马铃薯晚疫病的致病菌为致病疫霉。
本发明还提供了链霉菌(Streptomyces sp.)A2-16 CGMCC No.19402在制备抗植物卵菌病害产品中的应用。
所述植物卵菌病害为马铃薯晚疫病。
本发明还提供了一种抗植物卵菌病害产品，其活性成分包含链霉菌(Streptomyces sp.) A2-16 CGMCC No.19402或/和A2-16的发酵产物。
本发明的有益效果是：本申请从中国马铃薯产区土壤中分离鉴定出一株链霉菌新种 A2-16，经实验证实，A2-16菌体、无菌发酵液对马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉均有显著的抑制作用，是一株效果显著的生防菌。A2-16无菌发酵液经100℃处理10min对致病疫霉仍有显著的抑制作用，该生防菌A2-16对紫外辐射及高浓度盐离子耐受。另外，该菌对马铃薯晚疫病常用的化学农药耐受，可与化学农药联合施用达到减少化学农药使用的目的。本申请的这株新种链霉菌A2-16具有可作为防治马铃薯晚疫病的生防菌的极大前景，有望为马铃薯晚疫病的防治提供一种新的生防试剂，减少化学农药使用，保护环境。
附图说明
图1是致病疫霉与A2-16平板对峙实验结果。
图2是菌株A2-16在高氏1号培养基上的生长形态。
图3是菌株A2-16与相关菌株基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树。
图4是菌株A2-16无菌发酵液经50-100℃处理10min后对致病疫霉的抑制作用结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、A2-16菌株分离
2018年6月从重庆市巫溪县马铃薯栽培区的根区进行土样采集。将土样利用梯度稀释的方法涂布在高氏1号培养基上，28℃恒温暗培养15天。将致病疫霉与分离菌进行对峙培养，观察并筛选到对致病疫霉菌丝有强抑制作用的分离菌A2-16，图1是致病疫霉与A2-16平板对峙实验，结果显示A2-16对致病疫霉菌丝有强抑制作用。
进一步利用划线法进行菌株纯化，得到单菌落A2-16。菌株A2-16在高氏1号培养基上的生长形态如图2所示。
实施例2、A2-16菌株鉴定
将A2-16接种于ISP2液体培养基(酵母膏麦芽膏琼脂培养基)在28℃摇床培养3天。通过离心法收集A2-16菌体沉淀采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取A2-16基因组DNA，电泳检测正确后进行PCR扩增。引物27F序列为:AGAGTTTGATCCTGGCTCA(SEQ ID No: 1)，引物1492R序列为:GGTTACCTTGTTACTT(SEQ ID No:2)。Ex Taq为TaKaRa公司(中国，大连)产品，货号DRR001A。
PCR反应体系如下：
Figure RE-GDA0002897931170000031
PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，24个循环；72℃10min。
然后电泳检测，送测序，分析结果序列并进行拼接得到A2-16的16S rRNA序列(SEQID No:3)。
基于16S rRNA序列选择与NCBI数据库对比到种属水平上最接近的19株菌，通过MEGA 6.0软件选择NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树。系统发育树如图3所示，本实验从中国马铃薯产区重庆巫溪县的马铃薯根区土壤中分离获得的细菌样本A2-16归属于链霉菌属 (Streptomyces)，但是未鉴定到种。因此将其鉴定为链霉菌属(Streptomyces)新种。
实施例3、A2-16在不同培养基上的生长
高氏1号培养基配方：可溶性淀粉20g氯化钠0.5g,硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g,琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，PH7.4-7.6。国际链霉菌计划(ISP)所指定的7种培养基，即胰蛋白胨酵母提取物肉汤培养基(ISP-1)、酵母膏麦芽膏琼脂培养基(ISP-2)、燕麦粉琼脂培养基(ISP-3)、无机盐淀粉琼脂培养基(ISP-4)、甘油天冬酰胺琼脂培养基(ISP-5)、蛋白胨酵母提取物铁琼脂培养基(ISP-6)、酪氨酸琼脂培养基(ISP-7)。将各种培养基灭菌后倒在无菌的培养皿中(60mm直径)，培养基冷却后每皿涂布20μlA2-16孢子悬浮液(将A2-16在高氏1号固体培养上28℃预培养7天，洗下 A2-16的孢子，得到5ml孢子悬浮液)。在超净台中吹干水分，用封口膜封住。置于28℃恒温暗培养7天。结果如表1所示，A2-16在高氏1号培养基及国际链霉菌计划中的7种培养基上均能迅速生长。
表1.链霉菌A2-16在不同培养基上的生长状况
Figure RE-GDA0002897931170000032
Figure RE-GDA0002897931170000041
注：‘++’表示生长状况一般；‘+++’表示生长良好。
实施例4、A2-16在不同温度、PH、盐离子浓度及紫外辐射下的生长实验
将A2-16在高氏1号固体培养上28℃预培养7天。洗下A2-16的孢子，得到5ml孢悬液。取5份A2-16孢悬液50μl分别涂布于新的空白高氏1号培养基，然后在不同温度梯度(7℃、 17℃、27℃、37℃、47℃)培养7天。取5份A2-16孢悬液50μl分别涂布于不同PH梯度(5、7、9、12、13)下的高氏1号培养基后，在28℃培养7天。取5份A2-16孢悬液50μl分别涂布于不同NaCl盐离子梯度(m/v：1％、5％、10％、15％、20％)下的高氏1号培养基后，在 28℃培养7天。取5份A2-16孢悬液50μl分别涂布于新的空白高氏1号培养基，然后在紫外灯下分别照射不同时间(0，1，5，10，30min)后，在28℃培养7天。以上试验独立进行3 次重复。
结果如表2所示，A2-16对温度的适应性：在高氏1号培养基上，A2-16菌株在7℃和47℃不生长，在17-27℃生长良好，在37℃生长一般。A2-16对盐度的耐受性：A2-16在含1％-20％的高氏1号培养基上均能良好生长。A2-16对PH的适应性：A2-16在PH5-12的高氏1号培养基上均能良好生长。A2-16对紫外辐射的耐受性：当A2-16在紫外灯下照射0-10min后，再正常培养，依然能生长良好，表明该菌对紫外耐受。
表2.A2-16在不同温度、PH、盐离子浓度及紫外辐射下的生长实验
Figure RE-GDA0002897931170000042
注：‘-’表示不生长；‘++’表示生长状况一般；‘+++’表示生长良好。
实施例5、A2-16农药耐受性实验
选择马铃薯晚疫病化学防治常用农药恶霉灵、银法利、80％代森锰锌进行农药耐受性研究。高氏一号培养基配制好后，分别加入不同浓度化学农药，使培养基中的工作浓度为田间施用浓度的1倍及10倍(1X及10X)。恶霉灵、银法利、80％代森锰锌的田间最大施用浓度分别为50μg/L，1.7ml/L，2.7g/L。
将A2-16在高氏1号固体培养上28℃预培养7天。洗下A2-16的孢子，得到5ml孢悬液。分别取A2-16孢悬液50μl均匀涂布在含不同浓度农药的培养基上，吹干后，用封口膜封住，放置于28℃恒温培养箱培养，培养7天后记录生长状况，结果如表3所示。
从表3可知，A2-16对马铃薯晚疫病防治常用农药的耐受性：在含有上述农药的平均田间施用浓度1X和10X的高氏1号培养基上，A2-16均能良好生长。表明A2-16对这些农药耐受，可与农药共同使用达到减少化学农药使用的目的。
表3链霉菌A2-16对马铃薯晚疫病常用农药的耐受性
Figure RE-GDA0002897931170000051
注：‘-’表示不生长；‘++’表示生长状况一般；‘+++’表示生长良好；‘1X’表示该农药的田间施用的平均浓度；‘10X’表示该农药的田间施用的平均浓度的10倍。
实施例6、A2-16无菌发酵液耐热性实验
将A2-16在高氏1号固体培养上28℃预培养7天。洗下A2-16的孢子0.5ml，接种于200ml ISP2液体培养基摇床培养6天。然后用0.22μm的滤膜进行过滤得到无菌发酵液。将无菌发酵液分装成1ml每管，分别在不同温度梯度下(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、)水浴10min后取出备用。采用牛津杯法将处理后的无菌发酵液与致病疫霉(Pi88069，南京农业大学董莎萌教授惠赠)对峙培养，以未经水浴的无菌发酵液为对照，28℃培养10天后测致病疫霉的菌落直径。
结果如图4所示，在不同温度梯度下处理的A2-16无菌发酵液对致病疫霉抑菌活性与未经热处理的对照相比无显著差异，说明该拮抗菌株产生的主要抑菌活性成分具有很强的热稳定性，这将有利于其在田间有效抑制晚疫病。
将菌株A2-16于2020年01月送中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年01月17日，保藏编号为CGMCC NO.19402，分类名为链霉菌Streptomyces sp.。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 一种新种链霉菌及其在防治植物卵菌病害中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctca 19
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttactt 16
<210> 3
<211> 1418
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgtcagtct taccatgcag tcgacgatga accacttcgg tggggattag tggcgaacgg 60
gtgagtaaca cgtgggcaat ctgcccttca ctctgggaca agccctggaa acggggtcta 120
ataccggata ccactaccgc aggcatctgt ggtggttgaa agctccggcg gtgaaggatg 180
agcccgcggc ctatcagctt gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gacgggtagc 240
cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg 360
atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgaaagt gacggtacct 420
gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg 480
ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggct tgtcacgtcg ggtgtgaaag 540
cccggggctt aaccccgggt ctgcattcga tacgggctag ctagagtgtg gtaggggaga 600
tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag 660
gcggatctct gggccattac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 720
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt gggaactagg tgttggcgac attccacgtc 780
gtcggtgccg cagctaacgc attaagttcc cggcctgggg agtacggccg caaggctaaa 840
ctcaaggaaa ttgacggggg ccgcacaagc agcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac 900
gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca ccggaaagca ttagagatag tgcccccctt 960
gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttctg tgttgccagc atgcccttcg gggtgatggg 1080
gactcacagg agaccgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca 1140
tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggca ggtacaatga gctgcgatac 1200
cgtgaggtgg agcgaatctc aaaaagcctg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga 1260
ccccatgaag tcggagttgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc 1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc 1380
ccaacccctt gtgggaggga gcttcgaagg tgatctct 1418

Claims (4)

1.一种新种链霉菌(Streptomyces sp.)A2-16，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.19402。
2.权利要求1所述的链霉菌或其无菌发酵液在防治马铃薯晚疫病中的应用。
3.链霉菌(Streptomyces sp.)A2-16 CGMCC No.19402在制备抗马铃薯晚疫病产品中的应用。
4.一种抗马铃薯晚疫病产品，其特征在于：其活性成分包含链霉菌(Streptomyces sp.)A2-16 CGMCC No.19402或/和A2-16的无菌发酵液。
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