CN109825455B - 一种甲基营养型芽孢杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药的技术领域，涉及一株对亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病具有高效拮抗活性的甲基营养型芽孢杆菌及田间应用，具体为一种甲基营养型芽孢杆菌及应用。本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，保藏编号为：CGMCC NO：16842，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明首次筛选到对亚洲镰刀菌均具有高效抑制活性的生防细菌，并在大田小区试验中对小麦赤霉病获得较好的防治效果。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明属于生物农药的技术领域，涉及一株对亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病具有高效拮抗活性的甲基营养型芽孢杆菌及田间应用，具体为一种甲基营养型芽孢杆菌及应用。

背景技术

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)既可以生活于根际土壤中，又可以定殖于植物内部。该菌能抑制多种植物病原菌，防止多种病害，如烟草青枯病、黄瓜炭疽病和灰霉病、水稻白叶枯病；也分泌木聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶、抗真菌脂肽表面活性剂等，具有拮抗真菌效应。甲基营养型芽孢杆菌对人畜无不良影响，无致病性，且对环境无害，是一种新型的生防菌。

赤霉病在我国主要发生在长江中下游冬麦区、东北春麦区东部及华南冬麦区，近年来随着气候和耕作制度的变化，流行区域不断扩大，目前已经扩大到黄淮海麦区。我国麦类赤霉病(Fusarium scab)主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和亚洲镰刀菌(F.asiaticum)引起的，是影响小麦产量的一个主要因素，其中，黄河流域以北地区以禾谷镰刀菌为主，长江中下游地区以亚洲镰刀菌为主(Zhang Jingbo,2007；Yang L,2008；ZhangHao,2012；罗文等，2016；张林等，2017)。感病后的麦穗不仅籽粒皱缩，品质下降，而且病菌产生的多种单端孢霉烯族毒素可破坏人和动物的免疫系统，还有致癌、致畸的作用，严重威胁人畜的健康安全。

目前有不少关于甲基营养型芽孢杆菌的发明专利申请，比如甲基营养型芽孢杆菌及其应用(CN107267412A)、一种甲基营养型芽孢杆菌YB-F7及其在防治植物病害中的应用(CN105543132A)和甲基营养型芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用(CN104342393A)，分别对多种植物病原菌，如草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、立枯丝核菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病菌等具有拮抗作用。但目前还没有甲基营养型芽孢杆菌防治亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病的相关专利。

发明内容

本发明针对目前亚洲镰刀菌引起的麦类赤霉病，提供一株甲基营养型芽孢杆菌及其在防治亚洲镰刀菌方面的应用。

本发明技术方案如下：

一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),保藏编号为：CGMCCNO：16842，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏日期：2018年11月30日，菌种的分类命名是甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus，参据微生物(株)：KNK-1。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌命名为KNK-1。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌用于防治镰刀菌引起的小麦赤霉病，所述的镰刀菌是亚洲镰刀菌。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌的应用，在防治亚洲镰刀菌引起的麦类病害时，方法是在植物生长过程中即扬花期喷雾处理；所述喷雾为该甲基营养型芽孢杆菌的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的生物农药制剂。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌用于制备防治镰刀菌引起的植物病害的生物制剂，剂型包括可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

本发明的所述的生物制剂可湿性粉剂制备方法如下：

(1)将KNK-1接种到LB培养液中，30℃180rpm/min培养24h，得到种子液，浓度为10⁸cfu/mL；

(2)用60升的机械搅拌不锈钢发酵罐六连罐对菌株KNK-1进行发酵：发酵培养基为糖蜜培养基，每1L糖蜜培养基含有：100mL糖蜜、1g氯化钠、3g尿素；装液量为40L，接种量为6％，温度30℃，搅拌速度为300rpm/min，通气量3L/min，发酵时间2天，生物量达1.50×10⁹cfu/mL，得到发酵液；

(3)成品粉剂制备：向发酵好的KNK-1发酵液中加入10％载体硅藻土(含0.5％葡萄糖)，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，24h后室温干燥，加入4％稳定剂羧甲基纤维素钠、7％分散剂聚乙烯醇、3.5％湿润剂吐温80、0.5％黄原胶混合，气流粉碎机粉碎，过325目筛，获得KNK-1可湿性粉剂，以上百分含量均为质量百分含量。

本发明的有益效果在于，本发明筛选到一株对亚洲镰刀菌有高效抑制效果的生防菌，通过大田小区试验取得较好的防治效果。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌发酵制得的细菌可湿性粉剂作为防治亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病的生防药剂。该粉剂可用于小麦花期针对小麦穗部喷施，可操作性强，制剂的性质和稳定性好，活菌数量高达3.00×10⁹cfu/g，能用于防治小麦赤霉病。

本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌不仅在平板培养时可高效抑制亚洲镰刀菌，而且在大田实验中防治效果高达75.82％。作为小麦赤霉病的高效生防菌，可开发新的生物农药或生物菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

附图说明

图1为亚洲镰刀菌P2纯培养对照图和KNK-1对亚洲镰刀菌P2的抑菌培养图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步说明，可以用于以下典型实验方案达到发明内容的目的，本发明的保护范围并不限于此，凡依照本发明公开的16s序列均属于本发明的保护范围。

实施例1：菌的分离与鉴定

1.1菌的分离

(1)在超净工作台中，将新采集的小麦病穗放在100mL的无菌水中震荡冲洗30min，充分悬浮，制成菌悬液。

(2)将菌悬液用无菌水梯度稀释后，从每个浓度的菌悬液稀释液中取100uL涂布到LB培养基平板上，放于30℃恒温培养48h，然后挑取平板上形态、大小、颜色不同的单菌落到LB平板上划线纯化，编号。

(3)取纯化的不同编号的菌株在LB液体培养基中30℃180rpm/min培养24h后，分别取2mL发酵液混合到15mL PDA培养基中，倒平板，凝固后，在平板的中心位置接种亚洲镰刀菌进行抑制共培养，将得到的对亚洲镰刀菌拮抗能力强的一株菌命名为KNK-1。

1.2菌株鉴定

(1)16S rDNA测序

提取KNK-1的基因组DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物，将其回收并进行测序，得到的序列如SEQUENCE LISTING所示，具体见序列表。

(2)将测序得到的序列提交到Gen-Bank，进行同源性比较，菌株KNK-1与Bacillusmethylotrophicus同源性为99.99％，初步判定该菌为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。因此，将菌株KNK-1鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。该菌株已于2018年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO：16842，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；菌种的分类命名是甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus，参据微生物(株)：KNK-1。

实施例2：甲基营养型芽孢杆菌KNK-1对亚洲镰刀菌的拮抗作用(共培养法)

(1)取纯化的不同编号的菌株在LB液体培养基中30℃180rpm/min培养24h后，分别取2mL发酵液混合到15mL PDA培养基中，倒平板，凝固，备用。

(2)用直径为2.5cm的打孔器在培养好的病原真菌亚洲镰刀菌P2菌落边缘打孔获得菌片，备用。

(3)用无菌挑针将上述P2菌片挑入(1)中的PDA平板中心位置，同时设只接种亚洲镰刀菌菌片的PDA平板为对照组，30℃培养4-6天，观察P2的生长菌落速度和菌落半径大小。各设3个重复，结果如表1所示。

表1培养6天KNK-1对亚洲镰刀菌P2的抑制作用

病原菌	菌落半径(cm)
		亚洲镰刀菌(Fusarium asiaticum)	0

参见图1，KNK-1对亚洲镰刀菌P2的抑菌培养试验的对照效果展示，其中左图是亚洲镰刀菌P2的PDA平板纯培养对照，右图是将KNK-1的发酵液混合到PDA培养基中，倒平板，凝固后在PDA平板中心位置接种P2，30℃恒温培养6d。

通过表1和图1，说明甲基营养型芽孢杆菌KNK-1对亚洲镰刀菌P2有很好的抑制效果。

实施例3：KNK-1发酵液对大田小麦赤霉病的防治效果检测

(1)将KNK-1接种到LB培养液中，30℃180rpm/min培养24h，得到种子液，浓度约为10⁸cfu/mL；

(2)用60升的机械搅拌不锈钢发酵罐六连罐对菌株KNK-1进行发酵：发酵培养基为糖蜜培养基(1L)：100mL糖蜜、1g氯化钠、3g尿素。装液量为40L，接种量为6％，温度30℃，搅拌速度为300rpm/min，通气量3L/min，发酵时间2天，生物量达1.50×10⁹cfu/mL，得到发酵液；将发酵液稀释400倍，备用；

(3)第一次在宁麦13品种小麦的扬花初期进行喷雾，每亩施用60L发酵液稀释液。同时以清水喷雾的小区为对照。每个处理设3个小区作为重复，并于7天后进行第二次用药。

于第2次施药后14d、21d分别调查病情，每处理五点取样，每点100穗，记录病穗数和病级，并计算防效(注：每一药剂共调查1500穗)。小麦赤霉病分5级：0级，不发病；1级，病小穗占全穗的1/4以下；2级，病小穗占全穗的1/4～1/2；3级，病小穗占全穗的1/2～3/4；4级，病小穗占全穗的3/4以上。

病情指数＝∑(病穗数×病级)×100/调查总穗数×4

防效＝(CK病指-处理病指)/CK病指×100

表2药后14天、21天各处理防效

注：同一列中大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平的差异显著性，字母相同则表示差异不显著。

结果如表2所示，甲基营养型芽孢杆菌KNK-1在大田条件下能很好防治亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病。

实施例4：KNK-1可湿性粉剂对大田小麦赤霉病的防治效果检测

(1)将KNK-1接种到LB培养液中，30℃180rpm/min培养24h，得到种子液，浓度约为10⁸cfu/mL；

(2)用60升的机械搅拌不锈钢发酵罐六连罐对菌株KNK-1进行发酵：发酵培养基为糖蜜培养基(1L)：100mL糖蜜、1g氯化钠、3g尿素。装液量为40L，接种量为6％，温度30℃，搅拌速度为300rpm/min，通气量3L/min，发酵时间2天，生物量达1.50×10⁹cfu/mL，得到发酵液；

(3)成品粉剂制备：向发酵好的KNK-1发酵液中加入10％载体硅藻土(含0.5％葡萄糖)，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，24h后室温干燥，加入4％稳定剂羧甲基纤维素钠、7％分散剂聚乙烯醇、3.5％湿润剂吐温80、0.5％黄原胶混合，气流粉碎机粉碎，过325目筛，获得KNK-1可湿性粉剂，以上百分含量均为质量百分含量。

(4)第一次在宁麦13品种小麦的扬花初期进行喷施KNK-1可湿性粉剂800倍液，每亩施用60L。同时以清水喷雾的小区为对照。每个处理设3个小区作为重复，并于7天后进行第二次用药。

于第2次施药后14d、21d分别调查病情，每处理五点取样，每点100穗，记录病穗数和病级，并计算防效(注：每一药剂共调查1500穗)。小麦赤霉病分5级：0级，不发病；1级，病小穗占全穗的1/4以下；2级，病小穗占全穗的1/4～1/2；3级，病小穗占全穗的1/2～3/4；4级，病小穗占全穗的3/4以上。

病情指数＝∑(病穗数×病级)×100/调查总穗数×4

防效＝(CK病指-处理病指)/CK病指×100

表3药后14天、21天各处理防效

注：同一列中大、小写字母分别表示在0.01、0.05水平的差异显著性，字母相同则表示差异不显著。

结果如表3所示，甲基营养型芽孢杆菌KNK-1可湿性粉剂在大田条件下能很好防治亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病。

序列表

<110> 山东省科学院生态研究所

<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌及应用

<130> 18-1-1516

<141>

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1466

<212> DNA

<213> KNK-1

<400> 2

accccgttgt cgggggtgcc taatacatgc aagtcgagcg gacaggatgg gagcttgctc 60

cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120

aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa 180

aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240

aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420

ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540

ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600

aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660

acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720

ggtctgtaac tgacgctgac gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780

gtagtccacg cccgtaaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840

tgcagctaac gcattagtca ctctgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900

gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960

aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggatgtcc ccttcggggg 1020

cagagagaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080

ccgcaacgag cgcaaccctt gatgttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga 1140

ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200

ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc 1260

caatcccaca aatctgtttt cagttcggat cgcagttttc aaattgaatg cgtgaaactg 1320

gaatcgcttg taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgtttccggg ccttcctccc 1380

accgcccgtc acaaccggag aatttgtaac gcccgaagtc cagaggtaac cttcgggagc 1440

cagccgccga agggggatct ttgata 1466

Claims (6)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），其特征在于，保藏编号为：CGMCC NO：16842，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

2.一种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌在防治镰刀菌引起的小麦赤霉病中的应用，其特征在于，所述的镰刀菌是亚洲镰刀菌。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在防治亚洲镰刀菌引起的麦类病害时，方法是在植物生长过程中的扬花期喷雾处理。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述喷雾由该甲基营养型芽孢杆菌制备的菌悬液或发酵液或代谢产物或制备的生物农药制剂得到。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生物农药制剂，剂型包括可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的生物制剂可湿性粉剂制备方法如下：

（1）将如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌接种到LB培养液中，30℃ 180rpm/min培养24h，得到种子液，浓度为10⁸cfu/mL；

（2）用60升的机械搅拌不锈钢发酵罐六连罐对甲基营养型芽孢杆菌进行发酵：发酵培养基为糖蜜培养基，每1L糖蜜培养基含有：100mL糖蜜、1g氯化钠、3g尿素；装液量为40L，接种量为6%，温度30℃，搅拌速度为300rpm/min，通气量3L/min，发酵时间2天，生物量达1.50×10⁹cfu/mL，得到发酵液；

（3）成品粉剂制备：向发酵好的甲基营养型芽孢杆菌发酵液中加入10%载体硅藻土，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，24h后室温干燥，加入4%稳定剂羧甲基纤维素钠、7%分散剂聚乙烯醇、3.5%湿润剂吐温80、0.5%黄原胶混合，气流粉碎机粉碎，过325目筛，获得甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，以上百分含量均为质量百分含量。

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