CN108707570A - 一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用 - Google Patents
一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用,属于微生物脱氮技术领域,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2018271。本发明将所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14接种到高氨氮废水中,添加碳源后进行脱氮培养。本发明提供的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14能够对高氨氮废水进行快速脱氮,当初始氨氮浓度为1200mg/L时,终脱氨率约为75%,最高氨氮去除速率约为17.86mg/h,脱氮时间为5~7d。
Description
技术领域
本发明属于微生物脱氮技术领域,尤其涉及一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用。
背景技术
水体中过量的氮磷元素会导致水体藻类等生物异常增殖,引起水体富营养化现象和水质恶化。氨氮废水主要来源于化肥、焦化、石化、制药、食品、垃圾填埋场等,大量氨氮废水排入水体不仅引起水体富营养化、造成水体黑臭,给水处理的难度和成本加大,甚至对人群及生物产生毒害作用,针对氨氮废水的处理工艺(2014年前)有生物法、物化法的各种处理工艺等。
相比于传统的化学脱氮技术,生物脱氮技术由于其具有运行成本小、无二次污染和处理效果好等优势,已成为脱氮技术发展的主要趋势。然而目前,生物脱氮技术中所用的微生物菌种种类少,脱氮时间长,不能耐受高浓度的氨氮废水。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M2018271。
本发明提供了所述的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14在高氨氮废水快速脱氮中的应用。
优选的,将所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14接种到高氨氮废水中,形成脱氮培养体系,进行脱氮培养;所述高氨氮废水中的氨氮的浓度大于500mg/L。
优选的,所述脱氮培养体系中碳氮比C/N为(1~13)∶1。
优选的,所述碳源为柠檬酸钠。
优选的,所述高氨氮废水中的氨氮浓度为500~2000mg/L。
优选的,所述高氨氮废水中的氨氮浓度为700~1300mg/L。
优选的,所述脱氮培养时间为3~8d。
优选的,所述脱氮培养时间为5~7d。
优选的,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14在高氨氮废水中的接种体积为1~10%;所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14菌液的OD600为0.2~0.8。
本发明的有益效果:本发明提供的具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M2018271。本发明提供的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14能够对高氨氮废水进行快速脱氮,当初始氨氮浓度为1200mg/L时,终脱氨率约为75%,最高氨氮去除速率约为17.86mg/h,脱氮时间为5~7d。
生物保藏说明:
本发明提供的具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌AlcaligenesfaecalisWT14,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2018271,保藏日期2018年5月14日。
附图说明
图1为异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14电镜扫描观察(x10000)图;
图2为异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14的16S rDNA系统发育树;
图3为不同接菌浓度对Alcaligenes faecalisWT14脱氮效力的影响图;
图4为初始氨氮浓度为100mg/L时异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14的脱氮效果图;
图5为初始氨氮浓度为750mg/L时异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14的脱氮效果图;
图6为初始氨氮浓度为1200mg/L时异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14的脱氮效果图。
具体实施方式
本发明提供了一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌AlcaligenesfaecalisWT14,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2018271。
在本发明中,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14来源于中国科学院长沙农业环镜观测研究站狐尾藻人工湿地底泥,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14存在生物硝化作用,能够耐受高浓度的氨氮(500~2000mg/L),脱氮效果好,脱氮时间短。本发明中所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14 16srDNA系统发育树如图2所示,菌株Alcaligenes faecalisWT14的16S rDNA与Alcaligenes faecalisWT14、Alcaligenesaquatilis等的相似性达到100%。本发明中所述系统发育树通过以下方法获得:将测序获得的16S rDNA序列通过BLAST检索与GenBank中的核酸序列进行同源性比对,采用MEGA 4.0软件构建系统发育树。
本发明中所述的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14通过以下方法筛选获得:从中国科学院长沙农业环镜观测研究站狐尾藻人工湿地中采集底泥后,将所述底泥置于富集培养基中进行富集培养,将富集培养获得的菌种进行分离纯化获得纯菌;从所述获得的纯菌中筛选生长最迅速、硝酸盐和亚硝酸盐产生最快的菌株获得所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14。
本发明提供了所述的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14在高氨氮废水快速脱氮中的应用。在本发明中,所述应用优选的为将所述异养硝化菌AlcaligenesfaecalisWT14接种到高氨氮废水中,添加碳源后进行脱氮培养。
在本发明中,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14在接种前优选的进行活化培养,本发明中,所述活化优选的为将所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14菌株接种于LB液体培养基中,29~31℃,140~160rpm恒温震荡培养2~4d。在本发明中,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14活化培养后优选的进行离心去培养基,用无菌水调节菌液的OD600为0.2~0.8,更优选为0.3~0.5。本发明在调节菌液OD600后,将所述菌液接种到高氨氮废水中。在本发明中,所述异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14在高氨氮废水中的接种体积优选为1~10%,更优选为3~7%,最优选为5%。在本发明中,所述高氨氮废水中的氨氮浓度优选为500~2000mg/L,更优选为700~1300mg/L。在本发明中,添加碳源后进行脱氮培养。本发明对所述碳源的种类没有特殊限定,优选的选择无机碳源,在本发明具体为实施过程中,所述碳源优选为柠檬酸钠。在本发明中,所述所述脱氮培养体系中碳氮比C/N优选为(1~13)∶1,更优选为(8~12)∶1,最优选为9∶1。本发明中所述脱氮培养时间优选为3~8d,更优选为5~7d。
下面结合实施例对本发明提供的一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌及其应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14的分离筛选和鉴定实验用培养基:
LB培养基:酵母粉5g/L;酶蛋白胨10g/L;NaCl 10g/L。
液体氨化培养基:(NH4)2SO4 0.382g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O0.05g/L、K2HPO40.2g/L、NaCl 0.12g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L、FeSO4 0.01g/L、pH7.2。
固体氨化培养基:液体氨化培养基+琼脂15-20g/L。
菌种的分离筛选:
取中国科学院长沙农业环镜观测研究站狐尾藻人工湿地底泥10g置于100ml富集培养基中,放于30℃、150rpm/min摇床中培养,每3h测定培养液OD600绘制生长曲线,在细菌生在稳定期初期转接10ml培养液至90ml富集培养基中继续培养,在连续转接5次后,稀释富集液涂布与氨化固体培养基进行分离纯化,将得到的纯菌株接种于100ml液体氨化培养基中,30℃、150rpm/min振荡培养,每天使用Griess试剂和二苯胺硫酸试剂进行亚硝酸盐和硝酸盐定性检测。选择硝化反应阳性的菌株,进行分离纯化,所述分离纯化采用三区连续划线法涂布平板培养(培养条件:30℃,培养3~7天),发现有菌落长成,挑取长势较好的菌落,完成分离纯化。
硝态氮、亚硝态氮定性检测方法:无菌吸取培养液0.2mL于1.5mL离心管中,加入Griess溶液I,II各1滴,盖上离心管盖(如果暴露在空气中,Griess试剂在没有HNO2情况下也会缓慢呈显淡红色),如果溶液显红色(粉红或深红)就说明培养液中有HNO2存在,氨氧化细菌硝化反应呈阳性;如果溶液不显红色,则加入2滴二苯胺-硫酸试剂,生成蓝色沉淀,则说明硝化反应呈阳性,如果仍不显色,则说明无硝化反应。
将分离纯化获得的菌株通过OD600进行生长曲线测定,挑选一株生长最迅速、硝酸盐和亚硝酸盐产生最快的菌株进行形态观察、生化鉴定和16srDNA发育系统树的构建。
细菌形态的观察
将培养液稀释涂布于固体氨化培养基上,待生长后观察其形态,并挑取菌苔于载玻片上,通过透射电镜观察细菌形态。结果如图1所示,菌体为短杆状。
生化鉴定
将纯化后的细菌接入氨化培养基后,在第一天取300μl培养液放入1.5L灭菌EP管中,再往EP管中加入200μl Griess试剂A液(A液:对氨基苯磺酸0.5g+10%稀醋酸150ml)和B液(α-萘胺0.1g+蒸馏水20ml+10%稀醋酸150ml),培养液液变为粉红色,即表明有亚硝态氮产生,结果为阳性,表示存在生物硝化作用。
16srDNA发育系统树的构建
用细菌通用DNA提取试剂盒提取细菌DNA作为模板,以细菌通用引物8F/1392r序列进行常规PCR扩增和16rDNA序列测序。
将测定的16S rDNA序列通过BLAST检索与GenBank中的核酸序列进行同源性比对,采用MEGA 4.0软件构建系统发育树,如图2所示,筛选到的菌株的16S rDNA与Alcaligenesfaecalis、Alcaligenes aquatilis等的相似性达到100%。结合菌株的形态学及生理生化试验结果,可确定为粪产碱杆菌属Alcaligenes faecalisWT14。
实施例2
不同接菌浓度下氨氮去除效力分析
将分离出的菌株接种于100mlLB液体培养基中,在30℃,150rpm的恒温震荡摇床上活化培养3d后,在无菌条件下将菌液转移到灭菌的离心管中离心,弃去上清液,如此反复三次,将收集到的菌体用无菌水反复冲洗三次,得到纯净的菌体,将其重新悬浮于无菌水中,使其OD600为0.3,再将菌体悬浮液按照1%和5%的接种量接种到100mL的液体氨化培养基中在30℃、150rpm的恒温震荡培养箱里培养7d,分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7d取样检测培养液氨氮、硝氮、亚硝氮浓度变化。设置同等条件下不加菌液培养基作为空白对照。
不同接菌浓度对Alcaligenes faecalisWT14脱氮效力的影响见图3,由图3可以看出1%组相比于5%组约有0.5d-1d的延滞期,并从第1d开始氨氮急剧消耗,到第2d浓度基本趋于0,而5%组延滞期几乎不存在,氨氮约在1.5d消耗完。总氮下降趋势和氨氮几乎相同,符合前期假设,但两组总氮终浓度均维持在20mg/L左右,可能是菌体和转化的其他类型氮。
亚硝态氮和硝态氮出现时间,升高趋势几乎一致,并和氨氮和总氮刚好成反向关系,同时两组最终存在未转化的亚硝态氮约4mg/L,硝态氮约6mg/L。由此可以看出适当的接菌浓度能够减少Alcaligenes faecalis WT14的延滞期,增加其对环境的适应力。
实施例3
取中国科学院长沙农业环镜观测研究站临近猪场排出的养殖废水,4000rpm/min离心5min去除杂质,121℃20min高温灭菌,然后按照总体积5%接种量接入养殖废水中,以柠檬酸钠作为碳源调节碳氮比为:原液、4∶1、7∶1、10∶1、13∶1,分别在0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7d取样检测培养液氨氮、硝氮、亚硝氮、总氮浓度变化。其中氨氮、硝氮、亚硝氮直接用AA3连续流动分析仪(品牌:SEAL,产地:德国),总氮测定方法:用碱性过硫酸钾(配制方法:15g氢氧化钠+40g过硫酸钾,放入一升双水)消煮半小时,冷却,加入1:9盐酸1ml,定容后,上连续流动分析仪。
Alcaligenes faecalisWT14在不同氨氮浓度脱氨效果见图4~6所示,由图可知,当初始氨氮浓度约为100mg/L时,Alcaligenes faecalisWT14的氨氮去除率几乎达到100%,最高氨氮去除速率约为2.74mg/h。当初始氨氮浓度为750mg/L左右时,出现了约1天的停滞期,终脱氨率约为81%,最高氨氮去除速率约为11.83mg/h。当初始氨氮浓度为1200mg/L时,出现了约2天左右的停滞期,终脱氨率约为75%,最高氨氮去除速率约为17.86mg/h。此结果说明Alcaligenes faecalisWT14在高氨氮浓度培养基中仍具备较高的氨氮去除能力,随着初始氨氮浓度的升高氨氮去除速率显著增加,而氨氮去除率的降低可能是由于后期碳源不足,不能供应Alcaligenes faecalisWT14的消耗所致。氨氮浓度快速下降证实Alcaligenes faecalisWT14是能进行快速生物硝化作用的菌株,基于物质平衡理论,产生的亚硝态氮、硝态氮量与氨氮和总氮的去除的量有较大的差异,也能说明该菌种能快速对硝化作用产生的亚硝态氮、硝态氮进行反硝化作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一株具有对高氨氮废水快速脱氮功能的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14,其特征在于,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2018271。
2.权利要求1中所述的异养硝化菌Alcaligenes faecalisWT14在高氨氮废水快速脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,将所述异养硝化菌AlcaligenesfaecalisWT14接种到高氨氮废水中,添加碳源后形成脱氮培养体系,进行脱氮培养;所述高氨氮废水中的氨氮的浓度大于500mg/L。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述脱氮培养体系中碳氮C/N比为(1~13)∶1。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述碳源为柠檬酸钠。
6.根据权利要求2~5任意一项所述的应用,其特征在于,所述高氨氮废水中的氨氮浓度为500~2000mg/L。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述高氨氮废水中的氨氮浓度为700~1300mg/L。
8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述脱氮培养时间为3~8d。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述脱氮培养时间为5~7d。
10.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述异养硝化菌AlcaligenesfaecalisWT14在高氨氮废水中的接种体积为1~10%;所述异养硝化菌AlcaligenesfaecalisWT14菌液的OD600为0.2~0.8。
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GR01 | Patent grant | ||
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