CN108676750A - 一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。还公开了保藏号为CGMCC No.15518的产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌及其在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。本发明鉴定了一种针对植物卵菌和真菌病害，特别是马铃薯晚疫病菌、枯萎病菌的生防菌，利用该菌能够显著抑制马铃薯晚疫病菌孢子萌发和菌丝生长，为生物防治植物卵菌和真菌病害，特别是马铃薯晚疫病和枯萎病提供了一种有效的方法。该方法能够有效防治马铃薯晚疫病和枯萎病及其他植物病害，减少经济损失，对降低农药使用、缓解环境污染的具有重要意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。

Description

一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌及其在防治植物卵菌 和真菌病害中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用。

背景技术

植物生长发育过程中，会受到各种各样卵菌和真菌病原菌的危害。马铃薯起源于南美洲安第斯山山脉一带，属于茄科茄属双子叶植物。马铃薯也是全球第四大粮食作物，其地位仅次于小麦、水稻和玉米。由卵菌病原菌致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病，是马铃薯生产上最具毁灭性的病害之一。致病疫霉具有无色无隔菌丝，由菌丝产生的孢囊梗呈合轴分支，孢囊梗顶端膨大产生孢子囊，孢子囊呈卵形、楠圆型等。致病疫霉在田间发病呈中心发病症状，先有一株感病，然后向四周扩散病菌。在较低温度高湿度的条件下病斑迅速扩张，可在较短时间内致使田间大面积发病，造成绝产。最严重的一次是致病疫霉曾引起爱尔兰大饥荒，导致上百万人流离失所。因此，积极开展致病疫霉的防治技术的研究与应用，对我国发生区马铃薯晚疫病的危害实施科学有效控制，具有十分重要的作用。

除了卵菌可引起植物严重病害，真菌病原菌也严重威胁植物生长。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)可以侵染100多种植物，造成枯萎病发生、流行和成灾。马铃薯采前的枯萎病和采后干腐病就是由于尖孢镰刀菌造成的，近几年在我国北部和西部地区对马铃薯生产造成巨大危害。对香蕉生产具有毁灭性的病害香蕉枯萎病也是由尖孢镰刀菌造成的。

早疫病病原菌种类复杂，其中以茄链格孢(Alternaria solani)为优势种，是引起马铃薯早疫病最常见、为害较严重的一种，减产可达30％～78％，严重地块病株率甚至高达100％。

番茄灰霉病病原为半知菌亚门的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，灰霉病是番茄上危害较重且常见的病害，各菜区都发生。除危害番茄外，还可危害茄子、辣椒、黄瓜、瓠瓜等多种作物。

棉花黄萎病是一种世界性的病害，其分布广泛、遍布于世界各大产棉区。其危害200多种双子叶植物，包括一年生的草本植物，多年生植物和木本植物。其中，它对重要的经济作物棉花的危害最大，侵害全世界2/3的棉花种植区域，导致了严重的经济损失。大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和黑白轮枝菌(V.albo-atrum)是两种流行的棉花黄萎病病原菌，其中V.dahliae更为典型

针对植物病害的防治，生产实践中主要采取以下几种措施：病情预警预报系统、选育抗病品种、化学防治、物理防治、生物防治。在这几种措施中，化学防治的效果是目前广泛采用快速而直接的防治措施，但是化学防治不仅会使病菌产生抗药性，还会造成严重的环境污染，进而危害环境生态，得不偿失。而生物防治可以显著克服化学防治的缺点。但是，生物防治作为新兴的科学，也存在很多不足之处，例如：与化学杀菌剂比较，稳定性较低，见效慢。目前市场上生物防治药物或措施尚未广泛推广开来。因此，寻找或发现一种理想的生物防治药物或措施是十分必要的。

理想的生防菌应尽可能满足下列条件：可以定殖在植物根际土壤中，在土壤中生存竞争能力强，对病原菌抑制作用能力强，对病原菌所在环境的适应能力强，生防菌株对环境安全友好。研究表明，对植物病害有抑制作用的土壤，链霉菌和细菌占比较高。吸水链霉菌(Streptomyces hygroscpicus)是一类从土壤中分离并筛选得到的生物活性高、遗传性质稳定的链霉菌。这种菌因气生菌丝吸水而得名，其菌丝呈单轴分支状，孢子丝呈螺旋状。吸水链霉菌及其变种能产生许多生物活性物质，在医学和农业等领域具有重要的价值。目前对于吸水链霉菌的研究主要集中于其产生的次级代谢产物——雷帕霉素(Rapamycin)。将吸水链霉菌作为生防菌应用于农业，来进行马铃薯病害的防治还未见相关报道。

吸水链霉菌来自土壤，根际定殖能力强。广泛存在于土壤中，几乎不存在对自然环境产生安全隐患。吸水链霉菌能产生多种抗生素和次级代谢产物，对病原菌的作用能力强，其次级代谢产物能抑制或破坏病原菌生长的抗生素或胞外代谢物。由此可见，吸水链霉菌具备理想的生防菌的明显优势。

水杨酸(Salicylic acid)又名柳酸，是植物体内产生的一种简单酚类物质，是一种能够激活植物一系列抗病防卫反应的重要内源信号分子。雷帕霉素(Rapamycin)属大环内酯类抗生素，起初雷帕霉素被研究作为低毒性的抗真菌药物，而后作为一种疗效好，低毒，无肾毒性的新型免疫抑制剂而得到广泛关注。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用。

实现该目的的技术方案是：

产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。

所述植物卵菌病害为马铃薯晚疫病菌。

所述植物真菌病害为马铃薯枯萎病菌、马铃薯早疫病菌、棉花黄萎病菌或番茄灰霉病菌菌。

一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌，其保藏号为：CGMCC No.15518。

保藏号为CGMCC No.15518的吸水链霉菌在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。

在上述技术方案中，所述植物卵菌病害为马铃薯晚疫病菌。

在上述技术方案中，所述植物真菌病害为马铃薯枯萎病菌、马铃薯早疫病菌、棉花黄萎病菌或番茄灰霉病菌菌。

本发明的有益效果是：本实验室研究发现，单独使用水杨酸和雷帕霉素，对马铃薯晚疫病菌和枯萎病菌有显著抑制作用，混合使用水杨酸和雷帕霉素对马铃薯晚疫病菌和枯萎病菌有协同抑制作用。

本发明鉴定了一种针对植物卵菌和真菌病害，特别是马铃薯晚疫病菌、枯萎病菌的生防菌，该菌从土壤中分离，产雷帕霉素和水杨酸，有较好的根系定植能力和环境适应能力。利用该菌能够显著抑制马铃薯晚疫病菌孢子萌发和菌丝生长，为生物防治植物卵菌和真菌病害，特别是马铃薯晚疫病和枯萎病提供了一种有效的方法。该方法能够有效防治马铃薯晚疫病和枯萎病及其他植物病害，减少经济损失，对降低农药使用、缓解环境污染的具有重要意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。

附图说明

图1是样本1的序列对比结果。

图2是样本1的进化树图。

图3是吸水链霉菌发酵液产物高效液相分析结果图。

图4是吸水链霉菌处理组和空白对照组的马铃薯晚疫病病菌、枯萎病菌生长情况图，其中，Pi88069：马铃薯晚疫病菌；RSA：黑麦培养基；Sh：吸水链霉菌；Fo：马铃薯枯萎病菌；PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

图5是吸水链霉菌处理组和空白对照组的植物病原菌生长情况图，其中，Vd：棉花黄萎病菌；PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基；Sh：吸水链霉菌；As：马铃薯早疫病菌；Bc：番茄灰霉病菌。

图6是吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌对峙接种于马铃薯薯块结果图，其中，Sh：单独接种吸水链霉菌，Pi：Pi88069菌块。

图7是吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌对峙接种于马铃薯叶片结果图，其中，C1：处理，C2：对照。

图8是吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌孢子共培养结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1吸水链霉菌菌种鉴定分析

一、从土壤中分离吸水链霉菌：以栽种有马铃薯的土壤为样品，用稀释涂布平板法分离各种微生物。菌落计数后，通过观察菌落形态并挑取放线菌进行多次划线分离纯化后得到单菌落。

二、吸水链霉菌菌种鉴定

将实验室保存的从土壤中分离得到的吸水链霉菌样品命名为样本1，抽提样本1细菌基因组DNA，电泳检测正确后进行PCR扩增，扩增引物及其序列为：引物1:GGTGTGTACAAGGCCCGGGAAC(SEQ ID NO:1)；引物2：GTGGGCAATCTGCCCTGCACT(SEQ ID NO:2)。然后电泳检测，送测序，分析结果序列拼接。具体步骤如下：

(1)PCR反应体系

(2)PCR反应条件

(3)电泳检测

(4)测序：切胶纯化测序

(5)分析结果：拼接序列如SEQ ID NO:3所示，序列比对结果如图1所示，分析样本1的进化树如图2所示。

综合测序结果与进化树分析，本实施例保存的从土壤中分离获得的细菌样本1为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscpicus)，且为产水杨酸和雷帕霉素型吸水链霉菌。将样本1命名为cqush011，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC No.15518，保藏日期是2018年3月26日，分类命名为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，cqush011在CGMCC办理保藏时检测结果为存活。

实施例2吸水链霉菌发酵液产物分析

将已活化的实施例1的吸水链霉菌cqush011接种于200mL ISP液体培养基中，置于26℃，200r/min摇床发酵培养10天后，加入100ml乙酸乙酯，超声萃取15分钟，取上清，重复3次。混合三次上清，旋蒸浓缩干燥后，以甲醇溶解，以0.22μm滤膜过滤后上样，进行高效液相分析。分析结果如图3所示，吸水链霉菌分析结果中存在与雷帕霉素和水杨酸相近的吸收峰，即含有水杨酸和雷帕霉素。

实施例3吸水链霉菌cqush011对植物病源菌的抑菌试验

(1)配置培养基

ISP培养基配制：葡萄糖4g，酵母浸粉4g，麦芽浸粉，琼脂20g。按配方称取，加水定容至1L，121℃，高压灭菌15min。注：液体培养基不加琼脂。

黑麦(RSA)培养基配制：黑麦粉60g，蔗糖20g，琼脂12g。称取60g黑麦粉，加入500mL无菌水浸泡36小时(或48小时)。过滤，得滤液1，保存备用，滤渣55℃水浴3小时过滤，得滤液2将滤液1和滤液2混匀，121℃灭菌10分钟过滤，得滤液3，将20g蔗糖、12g琼脂加入滤液3溶解混匀，以无菌水定容至1L(如果制作液体培养基，则不加入琼脂)121℃灭菌20分钟冷却至50-60℃，根据实验需要加入或不加药物，倾倒至培养皿中，冷却凝固后即可使用。

PDA培养基配制：称取46g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L水，121℃灭菌20分钟。

(2)菌种活化以及扩大培养

首先配制一定量的适宜菌种cqush011生长的培养基，然后从超低温冰箱(-80℃)中取出塑料冻存离心管，随即放置于25-37℃的水浴锅中并快速晃动直至其完全溶解，接着在已灭菌的超净工作台中接种至培养基中，用封口膜密封后置于恒温培养箱中培养。待菌种生长至一定程度后，挑选其中生长茁壮且无污染的菌落接种至新的培养基中，按照以上步骤重复两至三次即可使活化菌种。将已活化的菌株接种至培养基扩大培养，备用。

(3)吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌和枯萎病菌对峙接种于培养基

用直径0.5cm打孔器将已培养好的吸水链霉菌cqush011菌皿(已培养6day)、马铃薯晚疫病菌皿(Pi88069菌块)(已培养15day)、马铃薯枯萎病菌皿(Fo菌块)打孔，将吸水链霉菌(Sh)以及Pi88069、Fo菌块接种至黑麦培养和PDA培养基上，以接种黑麦琼脂块(RSA)或PDA琼脂块为空白对照，Pi88069置于20℃恒温培养箱中培养，Fo置于28℃恒温培养箱中培养。

记录对峙情况：待空白对照组平板中央的马铃薯晚疫病病菌枯萎病菌长至两侧空白的固体培养基平板的圆形琼脂块时，对比实验处理组平板相应的生长情况。待空白对照组平板中央的马铃薯晚疫病病菌、枯萎病菌长满整个平板表面时，对比实验处理组平板中央的马铃薯晚疫病病菌、枯萎病菌与两侧吸水链霉菌的圆形琼脂块的对峙情况，分别在实验处理组和空白对照组中选取具有代表性的平板拍照。

同一生长时间段内吸水链霉菌处理组和空白对照组的马铃薯晚疫病病菌、枯萎病菌生长的具体情况如图4所示：在恒温黑暗的条件下培养一段时间后，实验对照组的马铃薯晚疫病病菌、枯萎病菌的生长因两侧吸水链霉菌的存在而表现出与空白对照组生长情况的明显差异，呈现出吸水链霉菌明显抑制马铃薯晚疫病菌、枯萎病菌生长的效果。

(4)吸水链霉菌与其他植物病菌对峙接种于培养基

用直径0.5cm打孔器将已培养好的吸水链霉菌cqush011菌皿(已培养6day)、马铃薯早疫病菌(Alternaria sonali)菌皿(已培养14day)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)菌皿(已培养8day)、番茄灰霉病菌菌(Botrytis cinerea)(已培养6day)菌皿打孔，将吸水链霉菌(Sh)以及植物病原菌菌块接种至PDA培养基上，以接种PDA琼脂块为空白对照，置于28℃恒温培养箱中培养。

待空白对照组平板中央的植物病原菌长满整个平板表面时，对比实验处理组平板中央的植物病原菌抗药性分子生物学与两侧吸水链霉菌的圆形琼脂块的对峙情况，分别在实验处理组和空白对照组中选取具有代表性的平板拍照。

如图5所示，在恒温黑暗的条件下培养一段时间后，实验对照组的植物病原菌的生长因两侧吸水链霉菌的存在而表现出与空白对照组生长情况的明显差异，呈现出吸水链霉菌明显抑制植物病原菌生长的效果。

(5)吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌对峙接种于马铃薯叶片

用直径0.5cm打孔器将已培养的吸水链霉菌cqush011菌皿(已培养6day)和马铃薯晚疫病菌皿(已培养15day)打孔，将吸水链霉菌(Sh)以及Pi88069菌块接种至马铃薯叶片，以接种黑麦琼脂块为空白对照，接种后的叶片置于22℃恒温光照培养箱中培养。接种叶片5天后进行拍照记录。

如图6所示，吸水链霉菌能有效抑制马铃薯晚疫病菌对马铃薯叶片的侵染。

(6)吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌对峙接种于马铃薯薯块

用直径0.5cm打孔器将已培养好的吸水链霉菌cqush011菌皿(已培养6day)和马铃薯晚疫病菌皿(已培养15day)打孔，将吸水链霉菌(Sh)以及Pi88069菌块接种至马铃薯薯块，以接种黑麦琼脂块为空白对照，接种后的薯块置于22℃恒温培养箱中培养。接种薯块9天后进行拍照记录。

如图7所示，C1是薯块上接种Pi88069，一天后去掉Pi88069琼脂块，再接种上Sh琼脂块；C2是薯块上接种Pi88069，一天后去掉Pi88069琼脂块，再接种上RSA琼脂块。从图7结果可知：用吸水链霉菌菌块处理过的薯块上生长的菌丝更少，表明吸水链霉菌能有效抑制马铃薯晚疫病菌对马铃薯薯块的侵染。

实施例4吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌孢子共培养

(1)马铃薯晚疫病菌Pi88069孢子悬浮液的制备

将生长15天的马铃薯晚疫病菌Pi88069菌皿以2mL无菌水冲洗，经已灭菌的一层神奇滤布过滤掉菌丝，所得滤液为孢子悬浮液，以无菌水调节孢子悬浮液浓度每μL含40-60个孢子。

(2)吸水链霉菌发酵液上清液的制备

将已活化的吸水链霉菌cqush011接种于ISP液体培养基中，置于26℃，200r/min摇床发酵培养10天后，在超净工作台中静置，以0.22μm灭菌滤膜过滤上清液，得吸水链霉菌培养液上清液以备用。

(3)吸水链霉菌与马铃薯晚疫病菌孢子共培养

以无菌水为对照(CK)，以吸水链霉菌发酵液上清液1μL加入到100μL马铃薯晚疫病菌Pi88069孢子悬浮液中，20℃恒温培养箱暗培养，24h后拍照观察。

如图8所示，实验结果表明吸水链霉菌培养液上清液能有效抑制马铃薯晚疫病菌Pi88069孢子的萌发。

以上结果表明，吸水链霉菌能有效抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长和孢子萌发，可有效阻止马铃薯晚疫病的侵染。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌及其在防治植物卵菌和真菌病害中的应用

<160> 3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物1

<400> 1

ggtgtgtaca aggcccggga ac 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物2

<400> 2

gtgggcaatc tgccctgcac t 21

<210> 3

<211> 1273

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 拼接序列

<400> 3

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcagc aatgctgatc tgcgattact 60

agcgactccg acttcatggg gtcgagttgc agaccccaat ccgaactgag accggctttt 120

tgagattcgc tccacctcac ggcttcgcag ctcattgtac cggccattgt agcacgtgtg 180

cagcccaaga cataaggggc atgatgactt gacgtcgtcc ccaccttcct ccgagttgac 240

cccggcagtc tcctgtgagt ccccatcacc ccgaaaggca tgctggcaac acagaacaag 300

ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacagccatg 360

caccacctgt acaccgacca caagggggca cccatctctg gatgtttccg atgtatgtca 420

agccttggta aggttcttcg cgttgcgtcg aattaagcca catgctccgc cgcttgtgcg 480

ggcccccgtc aattcctttg agttttagcc ttgcggccgt actccccagg cggggaactt 540

aatgcgttag ctgcggcacg gacaacgtgg aatgtcgccc acacctagtt cccaacgttt 600

acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg 660

tcagtatcgg cccagagatc cgccttcgcc accggtgttc ctcctgatat ctgcgcattt 720

caccgctaca ccaggaattc cgatctcccc taccgaactc tagcctgccc gtatcgaatg 780

cagacccggg gttaagcccc gggctttcac atccgacgcg acaagccgcc tacgagctct 840

ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc gccctacgta ttaccgcggc tgctggcacg 900

tagttagccg gcgcttcttc tgcaggtacc gtcacttgcg cttcttccct gctgaaagag 960

gtttacaacc cgaaggccgt catccctcac gcggcgtcgc tgcatcaggc ttccgcccat 1020

tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccagtg 1080

tggccggtcg ccctctcagg ccggctaccc gtcgtcgcct tggtaggcca tcaccccacc 1140

aacaagctga taggccgcgg gctcatcctg caccgccgga gctttccacc accagaccat 1200

gcggtcggta gtcatatccg gtattagacc ccgtttccag ggcttgtccc agagtgcagg 1260

gcagattgcc cac 1273

Claims (7)

1.产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物卵菌病害为马铃薯晚疫病菌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病害为马铃薯枯萎病菌、马铃薯早疫病菌、棉花黄萎病菌或番茄灰霉病菌菌。

4.一种产水杨酸和雷帕霉素的吸水链霉菌，其特征在于，保藏号为：CGMCCNo.15518。

5.如权利要4所述的吸水链霉菌在防治植物卵菌和植物真菌病害中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物卵菌病害为马铃薯晚疫病菌。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病害为马铃薯枯萎病菌、马铃薯早疫病菌、棉花黄萎病菌或番茄灰霉病菌菌。