CN116836892B - 一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法，该方法是在普通高氏一号培养基中添加添加萘乙酸和谷氨酸进行5406链霉素培养同时生产获得香豆素和水杨酸。本发明首次解决同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌发酵的问题，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法。
背景技术
5406链霉菌，又称泾阳链霉菌（Streptomyces jingyanggensis），是植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)的典型代表。5406链霉菌在我国作为抗生菌肥料已有多年，是从我国陕西泾阳等地土壤中分离到的，通过分类研究定名为泾阳链霉菌，5406为这个新种的典型菌株，在中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为ACCC40021，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为4.891。5406链霉菌不仅能抑制30多种病原菌的生长，同时还具有刺激植物生根、发芽等性能。5406链霉菌能产生抗病物质起到防治植物病害的作用，但其产生的具体物质、以及同时产生香豆素和水杨酸的培养方法尚无报道。
发明内容
本发明旨在提供一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法，以填补现有技术的空白。
本发明技术方案如下：
一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法，包括以下步骤：
（1）5406链霉菌活化；
（2）培养基配方及配制：在高氏一号液体培养基中添加萘乙酸和谷氨酸；
（3）5406链霉菌培养：取活化后的5406链霉菌单菌落，接种在步骤（2）所述培养基中，震荡培养5-6 d。
优选的，萘乙酸和谷氨酸在培养基中的添加量分别为萘乙酸0.05~0.15 g/L、谷氨酸5~15 g/L。
优选的，萘乙酸和谷氨酸在培养基中的添加量分别为萘乙酸0.1 g/L、谷氨酸10g/L。
优选的，震荡培养的条件为转速250±50 rpm、温度30±2℃。
优选的，震荡培养的时间为至少5 d。
优选的，震荡培养的时间为5-6 d。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
（1）本发明提供了一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法，填补了5406链霉菌同时产生香豆素和水杨酸的发酵技术方面的空白。
（2）本发明在高氏一号培养基的基础上，同时添加萘乙酸和谷氨酸进行发酵，可同时生产得到香豆素和水杨酸。
（3）本发明方法简单、操作方便，利于科研工作者的研究。
附图说明
图1：质谱多反应监测模式示意图
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法
（1）5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种（来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 4.891）从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30℃培养2-3天。
（2）培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加萘乙酸0.05g/L和谷氨酸5 g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
（3）5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
（4）激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，-80 ℃保存，采用LC-MS/MS法测定瑞香素、水杨酸、茉莉酸含量。
方法如下：
样品提取：
1）将样品从-80 ℃冰箱中取出，解冻后，涡旋30 S混匀。
2）取适量液体样本，置于对应的已编号的50mL离心管中，-80℃冰箱中冷冻一夜，真空冷冻干燥。
3）冻干后，按照浓缩30倍比例加入70%甲醇含内标提取液，比如9mL样本冻干后加入300μL提取剂，6mL样本冻干加入200μL提取剂。
4）涡旋15 min，冰水浴超声（KQ5200E）10min。12000 r/min，4℃条件下离心（5424R ，Eppendorf）3min。
5）移取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm pore size）过滤后，保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS检测。
色谱质谱采集条件：
数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（Ultra Performance LiquidChromatography，UPLC）（ExionLC™ AD，https://sciex.com.cn/）和串联质谱（Tandemmass spectrometry，MS/MS）（Applied Biosystems 6500 QTRAP，https://sciex.com.cn/）。
液相条件主要包括：
1）色谱柱：AgilentSB-C18 1.8 µm，2.1 mm * 100 mm；
2）流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；
3）洗脱梯度： 0.00 min B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10.00-11.10 min，B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；
4）流速0.35 mL/min；柱温40°C；进样量2 μL。
质谱条件主要包括：
电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度500°C；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和气帘气（CUR）分别设置为50、60和25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。通过进一步的去簇电压（declustering potential， DP）和碰撞能（collision energy，CE）优化，完成了各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的MRM离子对。
代谢物定性与定量：
基于自建数据库MWDB（metware database），根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含K+离子、Na+离子、NH4 +离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。
代谢物定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（multiple reactionmonitoring，MRM，如下图1）分析完成。MRM模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子（母离子），排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成很多碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的一个特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质色谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正(Fraga et al.2010)。
实施例2一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法
（1）5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30℃培养2-3天。
（2）培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加萘乙酸0.1 g/L和谷氨酸10 g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
（3）5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
（4）激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定瑞香素、水杨酸、茉莉酸含量。
实施例3一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法
（1）5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30℃培养2-3天。
（2）培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加萘乙酸0.15 g/L和谷氨酸 15g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
（3）5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
（4）激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定瑞香素、水杨酸、茉莉酸含量。
对比例1一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法
（1）5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30℃培养2-3天。
（2）培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
（3）5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
（4）激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定瑞香素、水杨酸、茉莉酸含量。
为了说明本发明的效果，分别统计了前述实施例和对比例的生长素和细胞分裂素浓度。每组3次重复。结果见下表。
对比例2一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法
（1）5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30℃培养2-3天。
（2）培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加萘乙酸0.1 g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
（3）5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
（4）激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定瑞香素、水杨酸、茉莉酸含量。
对比例3一种同时产生香豆素和水杨酸的5406链霉菌培养方法
（1）5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30℃培养2-3天。
（2）培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加谷氨酸10 g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
（3）5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
（4）激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定瑞香素、水杨酸、茉莉酸含量。
表1
注：氧化戊烯基环戊烷丁酸，英文名称：3-oxo-2-(2-(Z)-Pentenyl)cyclopentane-1-butyric acid，CAS号：136845-17-5。
研究结果表明，比较实施例和对比例1可知，本发明在高氏一号培养基基础上，同时添加萘乙酸0.05-0.15 g/L和5-15 g/L 谷氨酸，5406链霉菌可同时发酵生产瑞香素和水杨酸。
以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种同时产生瑞香素和水杨酸的5406链霉菌培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）5406链霉菌活化；所述5406链霉菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 4.891；
（2）培养基配方及配制：在高氏一号液体培养基中添加萘乙酸和谷氨酸，萘乙酸和谷氨酸在培养基中的添加量分别为萘乙酸0.05~0.15 g/L、谷氨酸5~15 g/L；
（3）5406链霉菌培养：取活化后的5406链霉菌单菌落，接种在步骤（2）所述培养基中，震荡培养；
震荡培养的条件为转速250±50 rpm、温度30±2℃，震荡培养的时间为5-6 d。
2.根据权利要求1所述的一种同时产生瑞香素和水杨酸的5406链霉菌培养方法，其特征在于，萘乙酸和谷氨酸在培养基中的添加量分别为萘乙酸0.1 g/L、谷氨酸10 g/L。
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