CN111718863B - 一种发酵生产闰年霉素的方法 - Google Patents
一种发酵生产闰年霉素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111718863B CN111718863B CN201910222050.7A CN201910222050A CN111718863B CN 111718863 B CN111718863 B CN 111718863B CN 201910222050 A CN201910222050 A CN 201910222050A CN 111718863 B CN111718863 B CN 111718863B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- leap
- mycin
- year
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 97
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 97
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 37
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 34
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 17
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 17
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 16
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 15
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 14
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 14
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 14
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 14
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 14
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 14
- 241000187844 Actinoplanes Species 0.000 claims description 7
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 7
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 claims description 7
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000187712 Actinoplanes sp. Species 0.000 claims 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 30
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 29
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 8
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 abstract description 6
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 12
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 7
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229930189077 Rifamycin Natural products 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229960003255 natamycin Drugs 0.000 description 2
- NCXMLFZGDNKEPB-FFPOYIOWSA-N natamycin Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C[C@@H](C)OC(=O)/C=C/[C@H]2O[C@@H]2C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 NCXMLFZGDNKEPB-FFPOYIOWSA-N 0.000 description 2
- 235000010298 natamycin Nutrition 0.000 description 2
- 239000004311 natamycin Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229960003292 rifamycin Drugs 0.000 description 2
- HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N rifamycin SV Chemical compound OC1=C(C(O)=C2C)C3=C(O)C=C1NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@@H](OC)\C=C\O[C@@]1(C)OC2=C3C1=O HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 208000037384 Clostridium Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010054236 Clostridium difficile infection Diseases 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 description 1
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种生产闰年霉素的发酵培养基。所述发酵培养基通过优化有机碳源、有机氮源、无机盐以及维生素B1的加入量，使闰年霉素发酵单位达到2000µg/ml以上。利用本发明的发酵培养基不仅提高了闰年霉素的发酵单位，而且发酵液中闰年霉素的HPLC纯度达到了75%以上，可大幅度提高产品质量，降低生产成本，适用于闰年霉素的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种发酵生产闰年霉素的方法。
背景技术
闰年霉素是通过指孢囊菌发酵产生的一种18元环结构的新型大环内酯类抗生素，属于窄谱型抗菌化合物，对革兰氏阳性需氧及厌氧菌具有优良的抗菌作用。
闰年霉素与非达霉素具有相同的抗菌谱，体外对艰难梭菌菌株有很好的抗菌活性，为较有潜力的用于治疗艰难梭菌感染引起腹泻的化合物。
目前，对闰年霉素的研究主要集中在其抗菌活性、应用、组合物等方面，发明专利CN 107898801 A公开了含有利福霉素和闰年霉素组合物及其应用，闰年霉素与利福霉素连用，可以产生协同杀菌效应，在更低的使用剂量下有效，毒性更低，且不易产生耐药性，很好解决了治疗细菌感染单独用药存在的肝毒性和易产生耐药性问题，为闰年霉素的深入研究注入了新的活力。关于闰年霉素发酵生产的培养基和发酵工艺的专利文献不多，发明专利CN104497079 A公开了一种高纯度闰年霉素的制备方法，其中闰年霉素的发酵单位在500 µg/ml左右，且发酵方法产物收率低。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中微生物发酵生产闰年霉素发酵水平低的问题，通过提供一种发酵培养基，有效提高闰年霉素的发酵单位。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种生产闰年霉素的发酵培养基，其组分包含有机碳源、有机氮源、无机盐及维生素B1，其中：有机碳源为麦芽糊精5-25g/L，葡萄糖30-65g/L；有机氮源为黄豆饼粉10-30g/L，酵母粉5-20g/L，玉米浆1-3g/L；无机盐为硫酸铵2-5g/L，七水硫酸镁1-3g/L，碳酸钙3-5g/L；维生素B1为0.01-0.1g/L。
所述的有机碳源中麦芽糊精用量优选10-20g/L，葡萄糖用量优选50-65g/L。
所述的有机氮源中黄豆饼粉优选低温黄豆饼粉，用量优选20-30g/L，酵母粉用量优选15-20g/L，玉米浆用量优选1-2g/L。
所述的无机盐为硫酸铵、七水硫酸镁和碳酸钙，硫酸铵用量优选4-5g/L，七水硫酸镁用量优选2-3g/L，碳酸钙用量优选4-5g/L。
所述的维生素B1用量优选0.05-0.07g/L。
本发明所用菌株为游动放线菌菌株（Actinoplanes sp.）N12W0304，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年12月26日，保藏编号为CGMCC No.7043。
将游动放线菌株接种于种子培养基，装量为40ml/250ml，在28℃、220rpm的旋转式摇床上培养48h获得种子液；种子液以10%的接种量接种于装量为40ml/250ml的发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度28℃，发酵周期7天。发酵结束后在含有产物闰年霉素的发酵液中加入等体积的乙醇，振摇30min后离心取上清，HPLC测定闰年霉素的发酵单位。
所述种子培养基的组成为：葡萄糖50g/L、低温黄豆饼粉10g/L、牛肉膏4g/L、酵母粉1.0g/L、蛋白胨4.0g/L、氯化钠2.5g/L、碳酸钙5.0g/L，培养基pH7.0-7.2，121℃灭菌30min。
本发明的有益效果在于：
本发明解决了闰年霉素发酵水平低的不足，提供了一种有利于游动放线菌高效发酵生产闰年霉素的发酵培养基，通过优选发酵培养基的有机碳源、有机氮源及配比、无机盐及适量加入维生素B1，从而大幅度提高了闰年霉素的发酵单位，适用于其的发酵生产。
采用该培养基，所得的发酵产物组分较为单一，发酵液中闰年霉素的HPLC纯度达到了75%以上，便于后序分离纯化。
附图说明
图1 是闰年霉素发酵液的液相图。
图2 是闰年霉素粗品的液相图。
图3 是闰年霉素纯品的液相图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用的培养基各组分如无特殊说明均为工业级原料。
本发明中所使用的游动放线菌菌株（Actinoplanes sp.）N12W0304保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年12月26日，保藏编号为CGMCC No.7043。
高效液相色谱仪器包括996型检测器、515泵（Waters公司生产）；INVOA 500型核磁共振波谱仪购自Varian公司；Acquity uplc system，PDA检测器，Xevo TQ MS/MS检测器均购自Waters公司。
实施例1
将游动放线菌株接种于种子培养基，装量为40ml/250ml，在28℃、220rpm的旋转式摇床上培养48h获得种子液；种子液以10%的接种量接种于装量为40ml/250ml的发酵摇瓶中进行发酵，发酵温度28℃，发酵周期7天。发酵结束后在含有产物闰年霉素的发酵液中加入等体积的乙醇，振摇30min后离心取上清，HPLC测定闰年霉素的发酵单位。
所述种子培养基的组成为：葡萄糖50g/L、低温黄豆饼粉10g/L、牛肉膏4g/L、酵母粉1.0g/L、蛋白胨4.0g/L、氯化钠2.5g/L、碳酸钙5.0g/L，培养基pH7.0-7.2，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精10g/L，葡萄糖57g/L，低温黄豆饼粉18g/L，酵母粉5g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵2g/L，七水硫酸镁1g/L，碳酸钙3g/L，维生素B1 0.03g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。闰年霉素的发酵单位为2130µg/ml，HPLC纯度为75.6%。HPLC图谱见图1。
实施例2
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精25g/L，葡萄糖30g/L，低温黄豆饼粉25g/L，酵母粉10g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵3.5g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙5g/L，维生素B1 0.1g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2231µg/ml，HPLC纯度为76.1%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例3
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精15g/L，葡萄糖56g/L，低温黄豆饼粉30g/L，酵母粉16g/L，玉米浆2g/L，硫酸铵4 g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.06g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2612µg/ml，HPLC纯度为75.7%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例4
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精10g/L，葡萄糖65g/L，低温黄豆饼粉25g/L，酵母粉15g/L，玉米浆2g/L，硫酸铵5g/L，七水硫酸镁3g/L，碳酸钙5g/L，维生素B1 0.05g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2465µg/ml，HPLC纯度为77.2%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例5
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精14g/L，葡萄糖40g/L，低温黄豆饼粉30g/L，酵母粉13g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵2.8 g/L，七水硫酸镁3g/L，碳酸钙3g/L，维生素B1 0.01g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2084µg/ml， HPLC纯度为76.4%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例6
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精20g/L，葡萄糖50g/L，低温黄豆饼粉20g/L，酵母粉20g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵4.3g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.07g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2507µg/ml， HPLC纯度为78.1%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例7
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精22g/L，葡萄糖54g/L，低温黄豆饼粉20g/L，酵母粉8g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵5g/L，七水硫酸镁1g/L，碳酸钙5g/L，维生素B1 0.1g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2269µg/ml，HPLC纯度为76.3%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例8
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精5g/L，葡萄糖49g/L，低温黄豆饼粉15g/L，酵母粉11g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵2g/L，七水硫酸镁3g/L，碳酸钙3g/L，维生素B1 0.08g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2176µg/ml，HPLC纯度为76.4%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例9
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精13g/L，葡萄糖33g/L，低温黄豆饼粉12g/L，酵母粉20g/L，玉米浆3g/L，硫酸铵3g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.02g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2362µg/ml，HPLC纯度为79.3%。HPLC图谱与图1基本一致。
实施例10
所述发酵培养基的组成为：麦芽糊精17g/L，葡萄糖50g/L，低温黄豆饼粉10g/L，酵母粉19g/L，玉米浆1g/L，硫酸铵3.5g/L，七水硫酸镁2g/L，碳酸钙4g/L，维生素B1 0.01g/L，PH6.8-7.4，121℃灭菌30min。
按照实施例1制得的种子液以10%接种量接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，发酵周期7天，其他条件同实施例1，闰年霉素的发酵单位为2405µg/ml，HPLC纯度为78.7%。HPLC图谱与图1基本一致。
综上可知，将本发明发酵培养基用于生产闰年霉素发酵培养基时，具有较高的发酵单位，能大幅度提高闰年霉素的产率。
表1 不同发酵培养基的闰年霉素发酵情况统计
实施例11
a、取实施例1发酵液20L，过滤，得到4.0kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为95%的乙醇12.0L，搅拌浸提3h后过滤，得到闰年霉素浸提液。
b、浸提液在40℃，真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至乙醇浓度小于10%，得到1400ml浓缩液，加入2800ml乙酸乙酯萃取3h后，浓缩、干燥得到闰年霉素粗品42g，含量为83.5%（HPLC图谱见图2），粗提收率为80.3%。
c、取闰年霉素粗品10g，加入50ml乙醇溶解，0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙醇：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为1：10000（v/v），HPLC在线检测，收集含量≥98.5%的洗脱液，40℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素湿粉。将湿粉置于40℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥9h，得到闰年霉素纯品6.1g，含量为99.5%（HPLC图谱见图3），纯化收率为72.7%。
实施例12
a、取实施例2发酵液15L，过滤，得到3.2kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为90%的乙醇水溶液6.4L，搅拌浸提4h后过滤，得到闰年霉素浸提液。
b、浸提液在 50℃，真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至乙醇浓度小于10%，得到1120ml浓缩液，加入1120ml乙酸乙酯萃取4h后，浓缩、干燥得到闰年霉素粗品33g，含量为82.7%，粗提收率为81.6%。
c、取闰年霉素粗品10g，加入30ml乙腈溶解，0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙腈：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为5：10000（v/v），HPLC在线检测，收集含量≥98.5%的洗脱液，50℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素湿粉。将湿粉置于50℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥4h，得到闰年霉素纯品6.0g，含量为99.2%，纯化收率为72.0%。
Claims (5)
1.一种发酵培养基在游动放线菌发酵生产闰年霉素中的应用，其特征在于，所述培养基由有机碳源、有机氮源、无机盐及维生素B1组成，其中，有机碳源为麦芽糊精5-25g/L，葡萄糖30-65g/L；有机氮源为低温黄豆饼粉10-30g/L，酵母粉5-20g/L，玉米浆1-3g/L；无机盐为硫酸铵2-5g/L，七水硫酸镁1-3g/L，碳酸钙3-5g/L；维生素B1为0.01-0.1g/L；所述闰年霉素发酵培养基的菌种为游动放线菌Actinoplanes sp.N12W0304，保藏编号为CGMCCNo.7043。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的有机碳源中麦芽糊精用量为10-20g/L，葡萄糖用量为50-65g/L。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的有机氮源中低温黄豆饼粉用量为20-30g/L，酵母粉用量为15-20g/L，玉米浆用量为1-2g/L。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的无机盐中硫酸铵用量为4-5g/L，七水硫酸镁用量为2-3g/L，碳酸钙用量为4-5g/L。
5.根据权利要求1所述的应用，所述的维生素B1用量为0.05-0.07g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910222050.7A CN111718863B (zh) | 2019-03-22 | 2019-03-22 | 一种发酵生产闰年霉素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910222050.7A CN111718863B (zh) | 2019-03-22 | 2019-03-22 | 一种发酵生产闰年霉素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111718863A CN111718863A (zh) | 2020-09-29 |
| CN111718863B true CN111718863B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=72562913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910222050.7A Active CN111718863B (zh) | 2019-03-22 | 2019-03-22 | 一种发酵生产闰年霉素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111718863B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115404175A (zh) * | 2022-10-12 | 2022-11-29 | 北京雷力海洋生物新产业股份有限公司 | 一种绿色木霉菌的发酵培养基、木霉菌剂及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3978211A (en) * | 1973-11-22 | 1976-08-31 | Gruppo Lepetit S.P.A. | Lipiarmycin and its preparation |
| CN101760489A (zh) * | 2008-12-23 | 2010-06-30 | 上海医药工业研究院 | 一种用于生产咪唑立宾的发酵培养基 |
| CN104497079A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-04-08 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 高纯度闰年霉素a4的制备方法 |
| CN105524961A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-04-27 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种发酵生产两性霉素b的方法 |
-
2019
- 2019-03-22 CN CN201910222050.7A patent/CN111718863B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3978211A (en) * | 1973-11-22 | 1976-08-31 | Gruppo Lepetit S.P.A. | Lipiarmycin and its preparation |
| CN101760489A (zh) * | 2008-12-23 | 2010-06-30 | 上海医药工业研究院 | 一种用于生产咪唑立宾的发酵培养基 |
| CN104497079A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-04-08 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 高纯度闰年霉素a4的制备方法 |
| CN105524961A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-04-27 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种发酵生产两性霉素b的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 岳海梅.植物病理学实验及研究技术.中国农业大学出版社,2015,第101页. * |
| 徐威等.环境微生物学.中国建材工业出版社,2017,第33-34页. * |
| 王松灵.中华医学百科全书•口腔医学（一）.中国协和医科大学出版社,2017,第208页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111718863A (zh) | 2020-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2003251902B2 (en) | Tiacumicin production | |
| CN108676755B (zh) | 一种含芽孢杆菌的微生物液体肥及其制备方法和应用 | |
| AU2021207155A1 (en) | High-yield eurotium cristatum strain containing diketopiperazine dimer, and method for separating and purifying diketopiperazine dimer therefrom | |
| CN102732580A (zh) | 一种制备高效抗肿瘤抗生素卡里奇霉素的方法 | |
| CN111718863B (zh) | 一种发酵生产闰年霉素的方法 | |
| CN101720772B (zh) | 一种防治作物真菌病害的大环内脂类组合物及其制备工艺 | |
| CN101720781B (zh) | 一种防治作物真菌病害的新磷氮霉素a及其制备工艺 | |
| CN111778172B (zh) | 一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用 | |
| CN102477067B (zh) | 3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸及其制备方法和应用 | |
| CN115181774A (zh) | 一种提高多粘菌素b有效组分含量的发酵液制备方法 | |
| CN109811023B (zh) | A82846b的发酵制备方法 | |
| CN102690333A (zh) | 一种高纯度替考拉宁的制备方法 | |
| CN108707560B (zh) | 一种微生物液体菌肥及其制备方法和应用 | |
| CN108586481B (zh) | 5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和结晶工艺 | |
| CN104497079A (zh) | 高纯度闰年霉素a4的制备方法 | |
| CN109971809B (zh) | 一种糖肽类抗生素中间体的发酵制备方法 | |
| CN116874417B (zh) | 一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用 | |
| CN115466194B (zh) | 一种溶杆菌来源的嗜铁素及其制备方法 | |
| CN113801819B (zh) | 一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法 | |
| CN109929895B (zh) | 一种酸降解液 | |
| CN110872338A (zh) | 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN114164239B (zh) | 一种高效发酵制备子囊霉素的方法 | |
| CN109811024B (zh) | 发酵制备奥利万星中间体的方法 | |
| CN109762860B (zh) | 一种碱降解液 | |
| CN117417255A (zh) | 来源于植物内生真菌的十氢化萘衍生物及制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 052165 North China Pharmaceutical Group new drug research and Development Co., Ltd., 98 Hainan Road, Shijiazhuang Economic and Technological Development Zone, Hebei Province Applicant after: NORTH CHINA PHARMACEUTICAL NEW DRUG R&D Co.,Ltd. Address before: 050015 No. 388 Pingdong Road, Chang'an District, Shijiazhuang City, Hebei Province Applicant before: NORTH CHINA PHARMACEUTICAL NEW DRUG R&D Co.,Ltd. |
|
| CB02 | Change of applicant information | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |