CN114164239B - 一种高效发酵制备子囊霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高效发酵制备子囊霉素的方法。本发明所述高效发酵制备子囊霉素的方法，通过对子囊霉素产生菌的发酵培养基进行优化，通过在发酵开始的0‑12h，添加适当浓度的精氨酸和亮氨酸至发酵培养基中诱导子囊霉素的发酵，建立了适宜于吸水链霉菌S.hygroscopicus FIM‑311‑80的发酵代谢途径。氨基酸作为发酵产物的前体物质，可能通过改变子囊霉素产生菌的代谢途径，引起发酵液中代谢产物比例的改变，使得目标代谢产物的合成增加，而减少其他杂质的合成，大幅降低了结构近似物对后续纯化分离过程的影响。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高效发酵制备子囊霉素的方法。
背景技术
子囊霉素(Ascomycin，FK-520)是由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus发酵产生的一种23元大环内酯类抗生素，具有诸如免疫抑制、抗疟疾、抗真菌、抗痉挛、神经再生与恢复等多种生物活性。子囊霉素是一种非常有价值的多功能药物，已被广泛应用于临床上治疗器官移植排斥反应、自身免疫疾病及多种皮肤疾病。除上述活性药物成分外，子囊霉素也是合成其衍生物吡美莫司的起始成分，并由于侧链基团的变化，该衍生物成为具有增强活性的子囊霉素的有力替代品，目前不仅用于特应性皮炎(轻中度)的一线治疗，也可用于银屑病、脂溢性皮炎和白癜风这些皮肤炎症性疾病的治疗。
子囊霉素虽然具有广阔的应用及市场前景，但由于其大环内酯结构复杂，导致化学合成比较困难，副产物多且产率较低，严重影响了子囊霉素的产量。目前，利用吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)进行微生物发酵是国内外工业生产子囊霉素的首选工艺。但是，基于微生物发酵生产子囊霉素工艺依然存在产量偏低及工业化生产成本较高的问题。另外，子囊霉素产生菌在发酵过程中会同时产生相似组分FK523，由于二者的化学结构极为接近，导致在后期的分离纯化中难以去除，进一步增加了子囊霉素的生产成本，给社会和患者造成极大的负担。因此，如何通过发酵工艺的优化以提高目标产物子囊霉素产量，以及有效提高目标产物在发酵液中的组分比例，有效降低副产物的含量，不仅可简化分离纯化操作，且可降低生产成本，是微生物发酵子囊霉素的工业化领域迫切需要解决的问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效发酵制备子囊霉素的方法，该方法可有效提高子囊霉素的发酵产量，并减少副产物的含量，便于大规模工业化生产，降低生产成本，提高产品品质。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效发酵制备子囊霉素的方法，包括将子囊霉素产生菌接种至含精氨酸和/或亮氨酸的发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
具体的，所述发酵培养基中，所述精氨酸的含量为1.5-3g/L，所述亮氨酸的含量为1-2g/L。
优选的，所述精氨酸和亮氨酸彼此独立的于发酵开始后的0-12h添加至所述发酵培养基中。
优选的，所述子囊霉素产生菌包括吸水链霉菌，其分类命名为S.hygroscopicusFIM-311-80，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13470。
具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：糊精40-60g/L、黄豆粉10-20g/L、玉米浆粉2.5-8g/L、酵母粉0.5-5g/L、蛋白胨0.5-5g/L、磷酸氢二钾0.5-2g/L、精氨酸1.5-3g/L、亮氨酸1-2g、碳酸钙0.25-5g/L，pH6.5-7.2。
优选的，所述发酵培养基包括如下组分：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、精氨酸2g/L、亮氨酸1g/L、碳酸钙0.5g/L，pH7.0。
具体的，所述发酵培养步骤的条件为：以10％(v/v)的接种量将培养好的种子液进行接种，控制温度26-29℃，摇床转速为200-250r/min，培养68-120h。
具体的，所述方法还包括将所述子囊霉素产生菌接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖2.5-10g/L、燕麦粉5-20g/L、酵母粉0.5-5g/L、蛋白胨0.5-5g/L、氯化钠0.5-5g/L，pH 6.5-7.2。
优选的，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
具体的，所述种子液培养步骤的条件为：刮取适量成熟的斜面孢子接入所述种子培养基中，控制温度26-29℃，摇床转速为200-250r/min，培养24-48h。
具体的，所述方法还包括将所述子囊霉素产生菌接种于固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述斜面培养基包括如下质量含量的组分：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，自然pH。
具体的，所述活化培养步骤的条件为：取适量于-20℃保存的所述子囊霉素产生菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，控制温度26-29℃，静置培养8-10天至孢子成熟。
本发明所述高效发酵制备子囊霉素的方法，通过对子囊霉素产生菌的发酵培养基进行优化，通过在发酵开始的0-12h，添加适当浓度的精氨酸和/或亮氨酸至发酵培养基中诱导子囊霉素的发酵，建立了适宜于吸水链霉菌S.hygroscopicus FIM-311-80的发酵代谢途径。本发明方案以精氨酸和/或亮氨酸作为发酵产物的前体物质，可能通过改变子囊霉素产生菌的代谢途径，引起发酵液中代谢产物比例的改变，使得目标代谢产物的合成增加，而减少其他杂质的合成，大幅降低了结构近似物对后续纯化分离过程的影响。本发明所述高效发酵制备子囊霉素的方法，可使得子囊霉素的产量提高了1倍以上，且主成分FK520与副产物FK523比例提高了3倍以上，有利于目标发酵产物子囊霉素的分离纯化，降低了后期分离纯化的难度，且本发明工艺简单，便于后期工业化生产，降低成本。
具体实施方式
本发明下述实施例中，对于发酵液中子囊霉素及杂质FK523的含量检测采用现有技术中已知的HPLC方法，具体包括：岛津HPLC系统，DAD检测器，色谱柱：Agilent ZORBAXSB-CN(4.6×250mm、5μm)，柱温：60℃，检测波长215nm，流动相：V乙腈：V0.1％磷酸水＝38：62，流速：1.0mL/min。以子囊霉素标准品为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价(Titer)，发酵效价取3次平均值，以相对值标示。
本发明如下实施例中，以吸水链霉菌作为子囊霉素产生菌进行发酵，其分类命名为S.hygroscopicus FIM-311-80，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13470。
下面通过如下具体实施例对本发明做详细说明。
实施例1
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、碳酸钙0.5g/L，pH7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为1g/L的不同氨基酸(见表1)，以不添加氨基酸作为对照组。发酵结束后，经HPLC检测FK520(子囊霉素)的含量，其中对照组的相对效价设定为100％，其他实验组的相对效价为实验组子囊霉素含量与对照组子囊霉素含量的比值。所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见下表1。
表1不同氨基酸对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
| 氨基酸 | 相对效价/％ | 氨基酸 | 相对效价/％ |
| 对照 | 100 | 苏氨酸 | 81.5 |
| 亮氨酸 | 116.3 | 丝氨酸 | 76.4 |
| 丙氨酸 | 100.7 | 鸟氨酸 | 90.1 |
| 苯丙氨酸 | 90.9 | 精氨酸 | 124.3 |
| 酪氨酸 | 82.7 | 甘氨酸 | 67.6 |
| 脯氨酸 | 76.8 | 赖氨酸 | 104.3 |
| 蛋氨酸 | 95.5 | 谷氨酸 | 103.5 |
| 胱氨酸 | 102.6 | 异亮氨酸 | 95.2 |
| 半胱氨酸 | 87.3 | 组氨酸 | 102.6 |
| 色氨酸 | 98.0 | 缬氨酸 | 86.7 |
从表1中结果可见，1g/L的亮氨酸及精氨酸均可提升子囊霉素产量；而丙氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸及组氨酸对子囊霉素产量几乎无影响；余下其他氨基酸的添加会降低子囊霉素产量。
实施例2
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80作为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度26-29℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、碳酸钙0.5g/L，pH 7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的精氨酸。发酵结束后，经HPLC检测FK520(子囊霉素)及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见下表2。
表2精氨酸对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
| 精氨酸含量/g/L | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 |
| 子囊霉素产量/mg/L | 534 | 609 | 687 | 761 | 822 | 801 | 756 |
| FK520/FK523 | 11.6:1 | 12.3:1 | 13.4:1 | 13.7:1 | 14.6:1 | 14.4:1 | 14.1:1 |
从表2中结果可见，对照组子囊霉素产量约为534mg/L；随着精氨酸浓度逐步提高时，子囊霉素产量也逐渐提高，当精氨酸的浓度为2g/L时，子囊霉素产量达到最高，为822mg/L，相对于对照组提高了54％，但是此后随着精氨酸浓度逐步提高，子囊霉素产量反而不断下降。此外，随着精氨酸浓度提高，FK520与FK523比例也缓慢增加。
实施例3
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、碳酸钙0.5g/L，pH7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的亮氨酸。发酵结束后，经HPLC检测FK520及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见表3。
表3亮氨酸对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
| 亮氨酸含量/g/L | 0 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | 2.5 | 3 |
| 子囊霉素产量/mg/L | 534 | 577 | 631 | 643 | 654 | 608 | 562 |
| FK520/FK523 | 11.6:1 | 17.9:1 | 26.4:1 | 25.5:1 | 24.6:1 | 24.3:1 | 23.6:1 |
从表3中结果可见，对照组子囊霉素产量约为534mg/L；随着亮氨酸浓度逐步提高时，子囊霉素产量也逐渐提高，当亮氨酸的浓度为2g/L时，子囊霉素产量达到最高，为654mg/L，相对于对照组提高了22％，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，子囊霉素产量反而不断下降。此外，当亮氨酸浓度逐步提高时，FK520与FK523比例迅速提高，当亮氨酸的浓度为1g/L时，该比例达到最高，为26.4：1，相对于对照组提高了约2.3倍，但此后随着亮氨酸浓度逐步提高，该比例反而出现轻微下降。
实施例4
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、精氨酸2g/L、碳酸钙0.5g/L，pH 7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的亮氨酸。发酵结束后，经HPLC检测FK520及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见表4。
表4不同浓度精氨酸和亮氨酸共同对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
从表4中结果可见，对照组子囊霉素产量约为521mg/L；当精氨酸浓度为2g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，子囊霉素产量也逐渐提高，当亮氨酸的浓度为1-2g/L时，子囊霉素产量达到最高，为1009-1078mg/L，相对于对照组提高了约94％-107％(最高达1倍以上)，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，子囊霉素产量反而不断下降。对照组FK520与FK523比例为11.2：1；当精氨酸浓度为2g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，FK520与FK523比例也逐渐升高，当亮氨酸的浓度为1g/L时，该比例达到最高，为34.3：1，相对于对照组提高了3.1倍，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，该比例下降。
实施例5
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、精氨酸1.5g/L、碳酸钙0.5g/L，pH 7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的亮氨酸。发酵结束后，经HPLC检测FK520及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见表5。
表5不同浓度精氨酸和亮氨酸共同对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
从表5中结果可见，对照组子囊霉素产量约为521mg/L；当精氨酸浓度为1.5g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，子囊霉素产量也逐渐提高，当亮氨酸的浓度为1-2g/L时，子囊霉素产量达到最高，为905-958mg/L，相对于对照组提高了约74％-84％，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，子囊霉素产量反而不断下降。对照组FK520与FK523比例为11.2：1；当精氨酸浓度为1.5g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，FK520与FK523比例也逐渐升高，当亮氨酸的浓度为1g/L时，该比例达到最高，为30.6：1，相对于对照组提高了2.7倍，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，该比例下降。
实施例6
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、精氨酸3g/L、碳酸钙0.5g/L，pH 7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的亮氨酸。发酵结束后，经HPLC检测FK520及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见表6。
表6不同浓度精氨酸和亮氨酸共同对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
从表6中结果可见，对照组子囊霉素产量约为521mg/L；当精氨酸浓度为3g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，子囊霉素产量也逐渐提高，当亮氨酸的浓度为1-2g/L时，子囊霉素产量达到最高，为925-988mg/L，相对于对照组提高了约78％-90％，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，子囊霉素产量反而不断下降。对照组FK520与FK523比例为11.2：1；当精氨酸浓度为3g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，FK520与FK523比例也逐渐升高，当亮氨酸的浓度为1g/L时，该比例达到最高，为31.2：1，相对于对照组提高了2.8倍，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，该比例下降。
实施例7
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、精氨酸2.5g/L、碳酸钙0.5g/L，pH 7.0。
在发酵的0h时，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L的亮氨酸。发酵结束后，经HPLC检测FK520及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见表7。
表7不同浓度精氨酸和亮氨酸共同对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响-4
从表7中结果可见，对照组子囊霉素产量约为521mg/L；当精氨酸浓度为2.5g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，子囊霉素产量也逐渐提高，当亮氨酸的浓度为1-2g/L时，子囊霉素产量达到最高，为943-1024mg/L，相对于对照组提高了约81％-97％，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，子囊霉素产量反而不断下降。对照组FK520与FK523比例为11.2：1；当精氨酸浓度为2.5g/L时，随着亮氨酸浓度逐步提高时，FK520与FK523比例也逐渐升高，当亮氨酸的浓度为1g/L时，该比例达到最高，为30.9：1，相对于对照组提高了2.8倍，但是此后随着亮氨酸浓度逐步提高，该比例下降。
实施例8
本实施例所述高效发酵制备子囊霉素的方法，是由吸水链霉菌S.hygroscopicusFIM-311-80做为产生菌，经过常规的菌种活化，种子培养及发酵培养步骤得到所述子囊霉素。
菌种活化：取适量于-20℃保存的吸水链霉菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，温度27℃，静置培养8-10天后至孢子成熟，备用。其中，斜面培养基的成分及含量为：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，pH自然。
种子培养：刮取适量成熟的斜面孢子接入摇瓶种子培养基中，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养24h。其中，种子培养基的成分及含量为：葡萄糖5g/L、燕麦粉10g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨1.5g/L、氯化钠2g/L，pH 7.0。
发酵培养：将上述培养好的种子液按10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，温度27℃，摇床转速为230r/min，培养72h。其中，所述发酵培养基的成分及含量为：糊精55g/L、黄豆粉20g/L、玉米浆粉5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾1g/L、碳酸钙0.5g/L，pH7.0。
在发酵开始后的0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，分别向装有发酵培养基的摇瓶中添加终浓度为2g/L的精氨酸及1g/L的亮氨酸，继续发酵至结束。发酵结束后，经HPLC检测FK520及FK523含量，所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值，检测结果见表8。
表8精氨酸和亮氨酸添加时间对发酵液中子囊霉素产量及杂质含量的影响
| 添加时间/h | 0 | 12 | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 |
| 子囊霉素产量/mg/L | 1057 | 1032 | 976 | 855 | 768 | 621 | 572 |
| FK520/FK523 | 35.2:1 | 32.5:1 | 24.6:1 | 19.3:1 | 15.4:1 | 13.9:1 | 12.3:1 |
从表8中结果可见，精氨酸与亮氨酸的添加时间在发酵开始的0-12h之间时，子囊霉素产量最高，且FK520与FK523比例最高，随着添加时间越往后，子囊霉素产量下降，且FK520与FK523比例下降。精氨酸和亮氨酸的最佳添加时间为发酵开始的0-12h。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种高效发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，包括将子囊霉素产生菌接种至含精氨酸和亮氨酸的发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述子囊霉素产生菌为吸水链霉菌，其分类命名为S.hygroscopicus FIM-311-80，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13470；
所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：糊精40-60g/L、黄豆粉10-20g/L、玉米浆粉2.5-8g/L、酵母粉0.5-5g/L、蛋白胨0.5-5g/L、磷酸氢二钾0.5-2g/L、精氨酸1.5-3g/L、亮氨酸1-2g、碳酸钙0.25-5g/L，pH6.5-7.2；
所述精氨酸和亮氨酸彼此独立的于发酵开始后的0-12h添加至所述发酵培养基中。
2.根据权利要求1所述高效发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述发酵培养步骤的条件为：以10％(v/v)的接种量将培养好的种子液进行接种，控制温度26-29℃，摇床转速为200-250r/min，培养68-120h。
3.根据权利要求1或2所述高效发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述子囊霉素产生菌接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖2.5-10g/L、燕麦粉5-20g/L、酵母粉0.5-5g/L、蛋白胨0.5-5g/L、氯化钠0.5-5g/L，pH 6.5-7.2。
4.根据权利要求3所述高效发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述种子液培养步骤的条件为：刮取适量成熟的斜面孢子接入所述种子培养基中，控制温度26-29℃，摇床转速为200-250r/min，培养24-48h。
5.根据权利要求1或2所述高效发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述子囊霉素产生菌接种于固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述斜面培养基包括如下质量含量的组分：燕麦粉20g/L、琼脂20g/L，自然pH。
6.根据权利要求5所述高效发酵制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述活化培养步骤的条件为：取适量于-20℃保存的所述子囊霉素产生菌孢子悬液涂布于斜面培养基上，控制温度26-29℃，静置培养8-10天至孢子成熟。
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| CN102250982A (zh) * | 2011-06-20 | 2011-11-23 | 天津大学 | 外源添加物促进微生物合成子囊霉素的方法及种子液和培养基的制备 |
| CN107245460A (zh) * | 2017-05-18 | 2017-10-13 | 福建省微生物研究所 | 一种高产子囊霉素的吸水链霉菌诱变菌株及其应用 |
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| 子囊霉素工程菌的构建及初步发酵工艺优化;王志娟等;中国抗生素杂志;第46卷(第9期);第857页右栏第2段 * |
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