CN110777084B - 一种a21978c高产菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种A21978C的高产菌株，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.16016。本发明还公开了所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016用于生产达托霉素的应用。所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016，经发酵培养后，A21978C的产量可达到3.47g/L左右，是高产A21978C的优良菌株，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种A21978C高产菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域，具体的说，是关于一种A21978C高 产菌株及其应用。
背景技术
达托霉素是治疗革兰氏阳性菌感染、特别是耐药菌感染的重磅炸弹药 物，临床应用于革兰氏阳性菌引起的皮肤感染和MRSA引起的心内膜炎。达 托霉素是从链霉菌产生的脂肽类次级代谢产物A21978C混合物中分离出的 最小的组分。A21978C混合物均含有一个13个氨基酸组成的母核，包含了 环上10个氨基酸和环外的三个氨基酸残基。不同的是达托霉素在结构上含 有一个直链癸酸侧链，其他三个主组分在N末端分别含有11、12、13个碳原子的支链脂肪酸链。利用产A21978C的菌株在发酵罐上补加癸酸后可以 实现大规模工业化生产达托霉素。由于发酵单位低，达托霉素工业化生产 难度大、成本高，从而导致其价格昂贵、产量远远不能满足市场需求。目 前国内外应用的菌株，其达托霉素产量约在2.0g/L至3.0g/L之间。中国 专利文献CN102796680B公开了通过补加癸酸和癸醛组合物作为前体，发酵 玫瑰孢链霉菌生产达托霉素，其效价为2.55g/L。专利文献CN106133131A 公开了通过诱变获得丝状链霉菌(streptomyces filamentosus)突变株， 其罐发酵生产达托霉素的能力为2.75g/L。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明旨在提供一种A21978C高产菌株。 为此，本申请以小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027为出发 菌株，经基因工程和诱变育种，筛选到一株A21978C高产菌株，并将其进 行了保藏，保藏号为CGMCC No.16016。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种A21978C高产菌株，其保藏号为CGMCC No.16016。
作为本发明的第二个方面，所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016 用于生产达托霉素的应用。
作为本发明的第三个方面，一种达托霉素的生产方法，通过发酵上述 所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016获得A21978C，再通过补加癸酸 获得达托霉素。
根据本发明，所述发酵的条件如下：
发酵培养基(wt)：玉米淀粉0.5％，葡萄糖0.8％，糊精3.2％，黄豆饼 粉2.5％，(NH4)2SO4 0.5％，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06％，MnSO4 0.02％，pH 7.5；
发酵培养条件：28℃，通气量1vvm，搅拌转速150～400rpm，罐压 0.05mpa；DO保持20％以上，pH用氨水控制在6.5；自发酵培养20h开始补 加50％癸酸溶液，补加速率为0.15ml/L·h，每培养36h，前体补加速率 增加0.1ml/L·h，至约200h发酵结束。
本发明的有益效果：本发明提供的A21978C高产菌株，其遗传性状稳 定，具有良好的工业化应用价值。本发明的A21978C高产菌株，经过发酵 获得的发酵液中的A21978C的含量可达到3.47g/L左右，是高产A21978C 的优良菌株。
附图说明
图1为出发菌株和突变菌株的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例 仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
本申请以Streptomyces parvus CGMCC No.4027为出发菌株，经基因 工程和紫外诱变，获得一株A21978C高产菌株，并将其进行了保藏，保藏 单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为小链 霉菌Streptomyces parvus，保藏号为CGMCCNo.16016，保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年06月28日。
1、以下实施例所用的试验材料，具体详见表1。
表1试验材料
试验材料 来源
pMD19-T simple载体 Takara公司
pKC1139载体 生物风公司
E.coli ET12567/pUZ8002 生物风公司
armB基因 NCBI登录号JQ911524.1
2、以下实施例所用到的引物，具体如表2所示。
表2本发明的引物
引物名称 引物序列 SEQ ID
arb-up-F AAAAGCTTACGGTCTTGTGGCGGAAGA NO：1
arb-up-R GCTGTTCGAGGCACAGGCGTCTAGAGGTGACGTACGCAACCTGC NO：2
arb-down-F GCAGGTTGCGTACGTCACCTCTAGACGCCTGTGCCTCGAACAGC NO：3
arb-down-R GGGAATTCAGGAGGGCCGGGTCCTGTC NO：4
arb-v-F ACGGCAACCCGGTACCCCA NO：5
arb-v-R GCACCCCTTTCCCGACACG NO：6
实施例1基因工程菌的构建
以CGMCC No.4027总DNA为模板，利用引物arb-up-F/R和arb-down-F/R 分别扩增armB基因的上下游同源臂片段，两片段重叠PCR拼接，克隆到 pMD19-T simple载体上，获得质粒pLYARB。pLYARB经Hind III和EcoR I 双酶切，回收同源臂片段，然后与经过同样双酶切的pKC1139载体连接， 获得用于敲除armB基因的重组质粒pKCARB。
将质粒pKCARB电转入E.coli ET12567/pUZ8002感受态，然后接合转 移入CGMCCNo.4027中，涂布于MS平板(组成为：黄豆饼粉2.0％，甘露醇 2.0％，琼脂粉2.0％，pH自然。)，28℃培养18h后覆盖安普霉素和萘啶酮酸 溶液继续培养；挑取接合子在含有安普霉素抗性的MS培养基37℃培养，获 得单交换菌株；获得的单交换菌株经过连续传代后通过影印法挑取对安普 霉素敏感的菌株；利用引物arb-v-F/R进行筛选，其中，回复突变株PCR 片段长2.4kb，敲除突变株PCR片段长0.6kb，后者缺失了部分armB基因 序列；获得的ΔarmB敲除突变株记作LYARB。
实施例2紫外诱变及突变株筛选
用0.9％的生理盐水收集LYARB孢子，28℃、220rpm震荡20min，经灭 菌脱脂棉过滤，制得单孢子悬液，血球计数板计数，用生理盐水调整到孢 子浓度为108个/mL。取5mL上述制备的孢子悬液置于直径6cm的无菌培养 皿中，开盖置于15W紫外灯下30cm处照射，恒速搅拌。照射20s后，经过 适当稀释，涂布于含有10μg/ml卡那霉素和400μg/ml癸酸的高氏一号培 养平板上(组成为：可溶性淀粉2.0％，NaCl 0.05％，K2HPO4 0.05％，KNO3 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4 0.001％，琼脂2.0％。)，28℃避光培养5-7d。
将平板上长出的单菌落划线于高氏一号平板上，28℃培养5天。待平 板上长出均匀的菌苔后，用一个无菌打孔器(孔径约5mm)在菌苔上打孔， 然后将孔中琼脂圆块放于涂布好金黄色葡萄球菌菌液的LB平板上。28℃培 养1天，通过比较抑菌圈直径大小进行初筛。共挑取5040个单菌落，抑菌 圈初筛得592株突变株。
实施例3突变株复筛
取实施例2的突变株的新鲜斜面孢子接种于种子培养基(组成为：糊 精3.5％，葡萄糖0.5％，棉籽粉2.0％，酵母粉0.4％，NaCl 0.2％，KH2PO4 0.04％， pH 7.5。)，28℃振荡培养42h；转种于发酵培养基(组成为：玉米淀粉0.5％， 葡萄糖0.8％，糊精3.2％，黄豆饼粉2.5％，(NH4)2SO4 0.5％，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06％，MnSO4 0.02％，pH 7.5。)，28℃振荡培养5d后，取发酵液加入两倍 体积的无水甲醇混匀，4℃放置45min，12000rpm离心15min，取上清进行 HPLC分析。HPLC条件为：色谱柱Hypersil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)； 流动相A：乙腈-0.5％(NH4)H2PO4缓冲液(10:90)，B：乙腈-0.5％(NH4)H2PO4缓冲液(45:55)，梯度洗脱(0-15min，A:B＝25:75-0:100)；流速1.5ml/min； 柱温35℃；进样量20μl。
592株初筛菌经复筛发酵验证，筛选获得21株阳性菌株。经对21株阳 性菌株的产孢能力以及5代以上传代稳定性的考察，优选出高产且稳定的 菌株HCCB20673进行保藏。本发明由出发菌株经基因工程和紫外诱变获得 的A21978C高产菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.16016。
本实施例的微生物采用的发酵培养基为：玉米淀粉0.5％，葡萄糖0.8％， 糊精3.2％，黄豆饼粉2.5％，(NH4)2SO4 0.5％，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06％， MnSO4 0.02％，pH7.5。经过发酵获得的发酵液中A21978C的含量达到3.47g/l 左右。
实施例4突变菌株与出发菌株的比较
培养基、培养条件和检测方法，如实施例3。
(1)突变菌株与出发菌株的比较，以A21978C含量为例，其比较结果 如表3(取自3批发酵平均值)：
表3突变菌株与出发菌株的比较
Figure BDA0001748763390000061
由表3可见，本发明的突变菌株的A21978C的含量与出发菌株的相比， 提高了194％；菌浓提高了77％。
(2)突变菌株与出发菌株的色谱图的比较，结果如图1所示。
由图1可见，A21978C系列化合物含量显著提高；两个大的杂质峰明显 消减。
实施例5突变菌株发酵产生达托霉素
将通过实施例3的方法获得的种子培养液按照发酵罐培养基体积1～5％ 的接种量接种于发酵培养基中(50L发酵罐，装液量30L；组成为：玉米 淀粉0.5％，葡萄糖0.8％，糊精3.2％，黄豆饼粉2.5％，酵母粉0.5％， Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06％，MnSO4 0.02％，KCl0.02％，消泡剂0.05％，pH 7.5。)， 发酵培养条件：28℃，通气量1vvm，搅拌转速150～400rpm，罐压0.05mpa。 DO保持20％以上，pH用氨水控制在6.5。自发酵培养20h开始补加50％癸 酸溶液，补加速率为0.15ml/L·h，每培养36h，前体补加速率增加0.1ml /L·h，至约200h发酵结束。
连续发酵三批，达托霉素产量分别为3.8g/L、4.1g/L、3.9g/L。
对本发明提供的高产菌株进行发酵，可以高产量获得A21978C，进而高 水平发酵获得达托霉素，显著降低了达托霉素生产成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本 行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和 说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前 提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本 发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司
<120> 一种A21978C高产菌株及其应用
<130> 181061
<141> 2018-07-31
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaagcttac ggtcttgtgg cggaaga 27
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgttcgag gcacaggcgt ctagaggtga cgtacgcaac ctgc 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaggttgcg tacgtcacct ctagacgcct gtgcctcgaa cagc 44
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggaattcag gagggccggg tcctgtc 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acggcaaccc ggtacccca 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaccccttt cccgacacg 19

Claims (4)

1.一种A21978C高产菌株，其特征在于，所述的A21978C高产菌株的保藏号为CGMCCNo.16016。
2.如权利要求1所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016用于生产达托霉素的应用。
3.一种达托霉素的生产方法，其特征在于，通过发酵权利要求1所述的A21978C高产菌株CGMCC No.16016获得A21978C，再通过补加癸酸获得达托霉素。
4.如权利要求3所述的达托霉素的生产方法，其特征在于，所述发酵的条件如下：
发酵培养基(wt)：玉米淀粉0.5％，葡萄糖0.8％，糊精3.2％，黄豆饼粉2.5％，(NH4)2SO40.5％，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.06％，MnSO4 0.02％，pH 7.5；
发酵培养条件：28℃，通气量1vvm，搅拌转速150～400rpm，罐压0.05mpa；DO保持20％以上，pH用氨水控制在6.5；自发酵培养20h开始补加50％癸酸溶液，补加速率为0.15ml/L·h，每培养36h，前体补加速率增加0.1ml/L·h，至约200h发酵结束。
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