CN112553132A - sucC基因敲除的红色糖多孢菌的优化发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种sucC基因敲除的红色糖多孢菌的优化发酵方法。本发明人观察到该工程菌在发酵过程的后期发生自溶、影响红霉素产量的现象，进而通过调节pH以及在特定时间段添加硫酸铵的工艺改进，有效减少了sucC基因敲除的红色糖多孢菌的自溶，同时还大大地提高了该基因工程菌的红霉素A在总红霉素产物中的占比。在利用合成(型)培养基的情况下，本发明的红霉素A产量和纯度高，适用于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，更具体地，本发明涉及优化的E3-△sucC基因工程菌发酵方法。
背景技术
红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)，是一种革兰氏阳性的丝状放线菌，这种细菌最重要的特性就是可以产生在医疗上具有显著疗效的抗生素：红霉素。红霉素是一种重要的广谱型的14元环大环内酯类抗生素，其在治疗许多由革兰氏阳性致病菌引起的疾病方面被普遍使用。
目前，工业生产上主要通过发酵的手段来生产红霉素。和其他放线菌通过次级代谢反应生产抗生素类似的是，红霉素的合成过程也是很复杂并且在很大程度上受到培养基的成分和培养条件的影响。近年来对红霉素发酵工艺的优化，国内外有众多研究人员进行了大量的工作，取得了显著的成果。目前中国已成为世界最大的红霉素生产国。
主要的红霉素族抗生素可分为红霉素A、红霉素B、红霉素C、红霉素D。红霉素的抑菌基质在于红霉素能够和一些病原微生物的核糖体50S亚基相结合，因而使得该微生物的蛋白质翻译过程受到抑制，进而杀死病原微生物。人类亚基高等动物的细胞中的核糖体亚基与微生物有较大的差异，并不会与红霉素结合，因而不会受到红霉素的影响。红霉素具有非常广的应用空间。
红霉素C是红霉素的一种主要的联合代谢产物，通过红色糖多孢菌发酵作用产生。红霉素C具有窄谱抗生素活性，与红霉素A相比，红霉素C的活性较低，因此在发酵产物中，人们倾向于使得产物中具有更多的红霉素A占比以及尽可能少的红霉素C占比。
综上，尽管红霉素生物发酵方面有了一定的进步，但仍然存在对培养基要求高(需要成本较高的复合培养基)，产量不高、有效组分(红霉素A)偏低的问题。因此，本领域亟待对其进行进一步的工艺优化。
发明内容
本发明的目的在于提供优化的E3-△sucC基因工程菌发酵方法；更具体地在于提供减少E3-△sucC基因工程菌自溶的方法，以及提高E3-△sucC基因工程菌的红霉素A产量的方法。
在本发明的第一方面，提供一种减少sucC基因敲除的红色糖多孢菌自溶的方法，其特征在于，包括：培养sucC基因敲除的红色糖多孢菌，在发酵过程中控制pH值为7±0.3；同时，在发酵起始后第50～70小时，流加硫酸铵。
在一个优选例中，所述的sucC基因敲除的红色糖多孢菌为以S.erythraea E3菌株为出发菌株，敲除琥珀酰辅酶A合成基因sucC。
在另一优选例中，在发酵过程中控制pH值为7±0.2(更佳地7±0.1)；同时，在发酵起始后第55～65小时，流加硫酸铵。
在另一优选例中，流加硫酸铵的量为0.002～0.05g/L·h；较佳地0.005～0.02g/L·h；如0.01g/L·h。
在另一优选例中，发酵培养基为合成型培养基(不是复合型培养基)，包括葡萄糖，硫酸镁(较佳地为七水硫酸镁)，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，丙氨酸，精氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，柠檬酸三钠，氯化钴，硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵。
在另一优选例中，发酵培养基包括：葡萄糖22.0g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸二氢钾0.64g/L、磷酸氢二钾1.28g/L、丙氨酸0.86g/L、精氨酸0.68g/L、半胱氨酸0.78g/L、丝氨酸0.73g/L、柠檬酸三钠2.28g/L、氯化钴0.009g/L、硼酸钠0.006g/L、三氯化铁0.0068g/L、氯化铜0.00027g/L、钼酸铵0.00027g/L；其中各个组分浓度在30％范围内上下浮动，较佳地在20％范围内上下浮动，更佳地在10％范围内上下浮动。
在另一优选例中，发酵过程中，溶氧水平大于30％，搅拌转速为250±100rpm，较佳地250±50rpm，更佳地250±25rpm，通气量1±0.3vvm，较佳地，1±0.2vvm；更佳地，1±0.1vvm。
在本发明的另一方面，提供一种提高sucC基因敲除的红色糖多孢菌的红霉素A产量的方法，包括：
(1)培养sucC基因敲除的红色糖多孢菌，在发酵过程中控制pH值为7±0.3(较佳地7±0.2，更佳地7±0.1)；同时，在发酵起始后第50～70小时，流加硫酸铵；
(2)分离红霉素，其中红霉素A占比高于97％，更佳地高于98％，更佳地高于99％。
在一个优选例中，所述的提高红霉素产量包括：提高红霉素产物中红霉素A的占比量。
在另一优选例中，流加硫酸铵的量为0.002～0.05g/L·h；较佳地0.005～0.02g/L·h；如0.01g/L·h。
在另一优选例中，发酵培养基为合成型培养基(不是复合型培养基)，包括葡萄糖，硫酸镁(较佳地为七水硫酸镁)，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，丙氨酸，精氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，柠檬酸三钠，氯化钴，硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、发酵过程中菌体干重的检测统计结果。其中，1为实验组发酵60小时补加硫酸铵，0为对照组(不补加硫酸铵)。
图2、发酵过程中红霉素产量的检测统计结果。其中，1为实验组发酵60小时补加硫酸铵，0为对照组(不补加硫酸铵)。
具体实施方式
在获得sucC基因敲除的红色糖多孢菌的基础上，本发明人在反复研究中意外地发现该工程菌在发酵过程的后期发生自溶、影响红霉素产量的现象。经过进一步广泛的分析和研究验证，本发明人通过调节pH以及在特定时间段添加硫酸铵的工艺改进，有效减少了sucC基因敲除的红色糖多孢菌的自溶，同时还大大地提高了该基因工程菌的红霉素A在总红霉素产物中的占比。在利用合成(型)培养基(其营养成分不同于复合(型)培养基)的情况下，本发明的红霉素A产量高，适用于工业化应用。
根据本发明人的新发现，提供了一种避免或减少sucC基因敲除的红色糖多孢菌自溶的方法，该方法包括：培养sucC基因敲除的红色糖多孢菌，在发酵过程中控制pH值为7±0.3；同时，在发酵起始后第50～70小时，流加硫酸铵。
本发明中，用于发酵的菌株为一种基因工程菌，其基因组中sucC基因被敲除。本发明人深入观测研究后发现，sucC基因敲除改变了红色糖多孢菌的一些生理、生长性状以及胞内代谢，使得其与出发菌相比，红霉素的生产情况也发生变化。sucC基因敲除使得改造后的菌株对pH的敏感性显著增加，更易于产酸；更为令人惊讶的是，本发明人发现，sucC基因敲除还使得该菌株在发酵进行到一定阶段后，发生自溶，而这些现象并没有表现在其出发菌中。与之不同的是，其出发菌株对于pH值调节的依赖性低，且不会发生显著性的自溶。
作为本发明的优选方式，所述的sucC基因敲除的红色糖多孢菌为以S.erythraeaE3菌株为出发菌株，敲除琥珀酰辅酶A合成基因sucC。S.erythraea E3菌株为一种可获得的工业菌株。
本发明的优选方式中，在发酵过程中控制发酵体系中pH值为7左右；更佳地，在发酵起始时，预先将培养基调节为这一pH值。pH值的调整使得菌株生长状态较好，前期生长相对较快。
本发明的优选方式中，流加硫酸铵的量为流加硫酸铵的量为0.002～0.05g/L·h；较佳地0.005～0.02g/L·h。适当阶段，特别是在大规模发生菌体自溶阶段之前的15～30小时时，也即大约在发酵起始后第50～70小时，添加硫酸铵对于减少菌体的自溶现象是非常有效的，进而稳定和提高红霉素产量；更特别地，还显著性地增加了发酵产物中高品质的红霉素A的占比，减少了低活性产物的占比。
本发明的发酵培养，可以应用成本低廉的合成培养基，而不一定需要应用相对成本更高的复合型培养基。在本发明的优选方式中，所述发酵培养基为合成型培养基，包括葡萄糖，硫酸镁(较佳地为七水硫酸镁)，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，丙氨酸，精氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，柠檬酸三钠，氯化钴，硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵。更具体地，包括：葡萄糖22.0g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸二氢钾0.64g/L、磷酸氢二钾1.28g/L、丙氨酸0.86g/L、精氨酸0.68g/L、半胱氨酸0.78g/L、丝氨酸0.73g/L、柠檬酸三钠2.28g/L、氯化钴0.009g/L、硼酸钠0.006g/L、三氯化铁0.0068g/L、氯化铜0.00027g/L、钼酸铵0.00027g/L；其中各个组分浓度在30％范围内上下浮动，较佳地在20％范围内上下浮动，更佳地在10％范围内上下浮动。利用成本低廉、配制方便的培养基，就能实现良好的红霉素A的生产，显然这贴合了工业生产的需要，便于产业化。
可以采用本领域已知的技术来进行培养基的配制，培养基中所涉及的组分均可通过商业途径购买获得。
在本发明的优选实施方式中，发酵过程中还包括设置其它的一些发酵参数以配合菌体的有效生长和生产。优选地，调节溶氧水平大于30％，调节搅拌转速为250±100rpm；调节通气量1±0.3vvm。
本发明人还发现，通过工艺的优化，还使得发酵产物红霉素中红霉素A的占比显著高于运用其出发菌株的情形，甚至使得红霉素A在红霉素产物中占比高于99％。
基于本发明人的上述发现，提供了一种提高sucC基因敲除的红色糖多孢菌的红霉素A产量，较佳地提高红霉素产物中红霉素A的占比量的方法，其特征在于，包括：(1)培养sucC基因敲除的红色糖多孢菌，在发酵过程中控制pH值为7±0.3；同时，在发酵起始后第50～70小时，流加硫酸铵；和(2)分离红霉素，其中红霉素A占比高于97％，更佳地高于98％，更佳地高于99％。
众所周知，红霉素A的活性远远高于红霉素C，是最为优选的产物；同时在制药领域杂质降到1％以下是有利于纯化的，因此这一技术效果是特别有意义的。
本发明的有益效果为：
发现和解决了发酵后期菌体自溶的现象，同时提高了红霉素的产量，提高了红霉素A比红霉素C的比例，降低了发酵成本。使红霉素的产量提高了18％以上，并且将红霉素A与红霉素C的比例由低于85％提高到了99％，简化了生产工艺，降低了生产成本，适合于工业化大生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例所用培养基
平板种子培养基：
淀粉10.0g/L、玉米浆13.0g/L、氯化钠3.0g/L、硫酸铵3.0g/L、琼脂20.0g/L、碳酸钙3.0g/L。
摇瓶种子培养基：
淀粉40.0g/L、氯化钠4.0g/L、碳酸钙1.5g/L、蛋白胨20.0g/L、葡萄糖10.0g/L、硫酸镁0.25g/L、七水硫酸镁0.2g/L。
发酵培养基(采用合成培养基)：
葡萄糖22.0g/L、七水硫酸镁1.0g/L、磷酸二氢钾0.64g/L、磷酸氢二钾1.28g/L、丙氨酸0.86g/L、精氨酸0.68g/L、半胱氨酸0.78g/L、丝氨酸0.73g/L、柠檬酸三钠2.28g/L、氯化钴0.009g/L、硼酸钠0.006g/L、三氯化铁0.0068g/L、氯化铜0.00027g/L、钼酸铵0.00027g/L。
实施例1、E3-△sucC基因工程菌的制备
以工业菌株S.erythraea E3菌株(获自上海国佳生化工程技术研究中心有限公司)为出发菌株，来制备琥珀酰辅酶A合成酶基因(SucC)敲除的基因工程菌。
采用插入失活的方式敲除SucC基因，插入失活过程中设计引物来扩增SucC基因起始密码子后面从196bp到1216bp之间长度为1021bp的片段。
引物序列具体如下：
上游引物：
CCCAAGCTTGGGATGAGGCCAAGACGAA(SEQ ID NO:1)；
下游引物：
GAAGATCTTCGCCCTGGACGATGACCTTG(SEQ ID NO:2)。
以S.erythraea E3菌株的基因组为模板，以上述引物进行扩增获得目的片段，其长度为1021bp。通过限制性内切酶HindIII/BglII将该片段插入到质粒pOJ260-tsr(获自上海国佳生化工程技术研究中心有限公司)中，获得插入了该1021bp片段的重组质粒。
将前述构建的重组质粒转入到S.erythraea E3菌株中，获得阳性的目标菌株，该菌株为S.erythraea E3-△sucC菌株，简称为E3-△sucC。
实施例2、基本培养
1、平板种子培养
将平板种子培养基根据所需用量配制好，在灭菌前将PH调至7.0，然后连同牛皮纸包好的平板竹签一起在121℃条件下高压灭菌30min，接着在超净工作台上将灭菌的培养基分装倒入平板中。在倒平板之前，平板培养皿温度不超过60℃加入抗生素阿普拉(浓度为50μg/ml)和硫链丝霉素(浓度为100μg/ml)。
等平板凝固后，用接种环从保存的甘油管中蘸取菌种，在平板划线，最后用封口膜封号平板，放置在35℃恒温培养箱中培养一周时间，直至平板上出现较为明显的灰白孢子。
2、摇瓶种子培养
配制45ml的摇瓶种子培养基倒入到500ml锥形瓶中，在灭菌前将PH调至7.0，在121℃条件下高压灭菌20min。然后称取葡萄糖单独分装到10ml离心管中，加入5ml去离子水，在115℃条件下高压灭菌20min。灭菌结束后将所有物品放在超净工作台上并打开紫外灯照射15-20min，待温度降至室温后开始接种。
用接种铲在长好的平板上挖取1cm2携带有菌种的小块，并加入到锥形瓶中，逐个完成接种之后，再依次分别倒入葡萄糖溶液，用棉线依次扎好每个锥形瓶的瓶口，最后放置在转速为220rpm，温度为34℃的摇床上培养48h。
3、5L发酵罐合成培养基发酵培养
发酵过程使用成本低廉的合成培养基。按照合成培养基配方配制好的培养基定容至2370ml，然后倒入5L发酵罐中，加入1.5ml消泡剂后将发酵罐包扎好，在121℃条件下高压灭菌60min。然后称取葡萄糖单独加入500ml锥形瓶中，加入去离子水300ml。在115℃条件下高压灭菌20min。5L发酵罐在灭菌之前要进行电极标定以及气密性检查，电极的标定主要包括pH的两点标定PH 4.0和PH6.86，溶氧电极的零点校正。
接种：取6个培养好的种子摇瓶，在4000rpm离心5min，然后倒出上清液，此时倒入30ml灭好菌的生理盐水，重悬菌体得到菌悬液。将5L发酵罐按正常操作依次连接好，采用火焰圈接种法将菌悬液、葡萄糖和微量元素倒入5L发酵罐中。
设置通气量和转速，标定溶氧满度，维持整个发酵过程溶氧水平大于30％，搅拌转速设置为250rpm，通气量1vvm。
本发明人对菌体的生长以及红霉素生产进行观测和监控，结果发现，接种到培养基后，在菌体生长的前期会产生大量酸类物质导致发酵液的PH降低发酵液PH降低不利于菌体生长；在菌体进入稳定期后，菌体也能产生一定的红霉素，但是产量非常低。产生这一状况的原因一方面可能是与出发菌株相比，E3-△sucC基因工程菌在生长性能上发生显著性改变；需要进行进一步的优化调整。
实施例3、培养过程优化
根据前面实施例2的E3-△sucC基因工程菌的生长情况，本发明人进一步优化其培养过程。针对多种培养条件的反复调整后发现，对于初始培养基以及发酵培养基中的pH的调整相对而言是较为重要的。尽管出发菌株S.erythraea E3对pH的适应性较强，但E3-△sucC基因工程菌并非如此，其产酸性能不同于出发菌，使得其必须进行pH调节。
发酵过程使用成本低廉的合成培养基。按照合成培养基配方配制好的培养基定容至2370ml，在灭菌前将pH调至7.0，然后倒入5L发酵罐中，加入1.5ml消泡剂后将发酵罐包扎好，在121℃条件下高压灭菌60min。然后称取葡萄糖单独加入500ml锥形瓶中，加入去离子水300ml。在115℃条件下高压灭菌20min。5L发酵罐在灭菌之前要进行电极标定以及气密性检查，电极的标定主要包括PH的两点标定和溶氧电极的零点校正。
接种：取6个培养好的种子摇瓶，在4000rpm离心5min，然后倒出上清液，此时倒入30ml灭好菌的生理盐水，重悬菌体得到菌悬液。将5L发酵罐按正常操作依次连接好，采用火焰圈接种法将菌悬液、葡萄糖和微量元素倒入5L发酵罐中。
设置通气量和转速，标定溶氧满度，维持整个发酵过程溶氧水平大于30％，搅拌转速设置为250rpm，通气量1vvm。
5L发酵罐合成培养基发酵培养过程中，本发明人进行了全程的观测。结果发现，在菌体生长到一定的阶段，尤其是发酵约80-100小时后，菌体干重发生显著的下降，同时红霉素的增量也显著性减缓，如图1和2中标为“0”的曲线。更为细致地观测后，本发明人发现，在发酵约80-100小时后，E3-△sucC基因工程菌菌体发生了大幅度的自溶，这也不同于野生型菌株(未观测到显著的自溶现象)。
实施例4、培养过程的进一步优化
针对实施例3中出现的菌体自溶现象，在沿用成本低廉的合成培养基的情况下，本发明人对其它发酵条件进行了大量的调整工作，包括发酵过程的多种因素以及培养过程中营养成分的流加调整。结果发现，在菌体发生自溶前的适当时间补加硫酸铵，可以显著地减少自溶现象的发生。
沿用成本低廉的合成培养基。按照合成培养基配方配制好的培养基定容至2370ml，在灭菌前将pH调至7.0，然后倒入5L发酵罐中，加入1.5ml消泡剂后将发酵罐包扎好，在121℃条件下高压灭菌60min。然后称取葡萄糖单独加入500ml锥形瓶中，加入去离子水300ml。在115℃条件下高压灭菌20min。5L发酵罐在灭菌之前要进行电极标定以及气密性检查，电极的标定主要包括PH的两点标定和溶氧电极的零点校正。
接种：取6个培养好的种子摇瓶，在4000rpm离心5min，然后倒出上清液，此时倒入30ml灭好菌的生理盐水，重悬菌体得到菌悬液。将5L发酵罐按正常操作依次连接好，采用火焰圈接种法将菌悬液、葡萄糖和微量元素倒入5L发酵罐中。
设置通气量和转速，标定溶氧满度，维持整个发酵过程溶氧水平大于30％，搅拌转速设置为250rpm，通气量1vvm。
发酵周期到60小时的时候补料添加硫酸铵，补料速率为0.01g/L·h，至发酵结束。
对于发酵过程观测发现，在菌体生长约80-100小时后，菌体干重监管也有一定的变化，但基本上是平缓的。同时红霉素的增量仍然较高，如图1和2中标为“1”的曲线。可见，不添加硫酸铵之后，E3-△sucC基因工程菌菌体自溶的情况得到有效的遏制，基本上解决了菌体自溶的问题。
进一步地，本发明人还比较了实施例3和实施例4发酵过程的红霉素产量。红霉素A(Er-A)和红霉素A(Er-C)组分浓度如表1和表2。而其它种类红霉素如红霉素B为痕量，无需考虑。
表1
表2
根据表1和表2所示，在应用硫酸铵流加后，红霉素产物中红霉素A(Er-A)的产量显著性增加，Er-A在总红霉素中占比从85％以下上升到99％，显然这是极为理想的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> sucC基因敲除的红色糖多孢菌的优化发酵方法
<130> 197575
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
cccaagcttg ggatgaggcc aagacgaa 28
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
gaagatcttc gccctggacg atgaccttg 29
Claims (10)
1.一种减少sucC基因敲除的红色糖多孢菌自溶的方法，其特征在于，包括：培养sucC基因敲除的红色糖多孢菌，在发酵过程中控制pH值为7±0.3；同时，在发酵起始后第50～70小时，流加硫酸铵。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sucC基因敲除的红色糖多孢菌为以S.erythraea E3菌株为出发菌株，敲除琥珀酰辅酶A合成基因sucC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵过程中控制pH值为7±0.2；同时，在发酵起始后第55～65小时，流加硫酸铵。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流加硫酸铵的量为0.002～0.05g/L·h；较佳地0.005～0.02g/L·h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基为合成型培养基，包括葡萄糖，硫酸镁，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，丙氨酸，精氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，柠檬酸三钠，氯化钴，硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵培养基包括：葡萄糖22.0g/L、硫酸镁1.0g/L、磷酸二氢钾0.64g/L、磷酸氢二钾1.28g/L、丙氨酸0.86g/L、精氨酸0.68g/L、半胱氨酸0.78g/L、丝氨酸0.73g/L、柠檬酸三钠2.28g/L、氯化钴0.009g/L、硼酸钠0.006g/L、三氯化铁0.0068g/L、氯化铜0.00027g/L、钼酸铵0.00027g/L；其中各个组分浓度在30％范围内上下浮动，较佳地在20％范围内上下浮动，更佳地在10％范围内上下浮动。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵过程中，溶氧水平大于30％，搅拌转速为250±100rpm，通气量1±0.3vvm。
8.一种提高sucC基因敲除的红色糖多孢菌的红霉素A产量的方法，其特征在于，包括：
(1)培养sucC基因敲除的红色糖多孢菌，在发酵过程中控制pH值为7±0.3；同时，在发酵起始后第50～70小时，流加硫酸铵；
(2)分离红霉素，其中红霉素A占比高于97％，更佳地高于98％，更佳地高于99％。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的提高红霉素产量包括：提高红霉素产物中红霉素A的占比量。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，流加硫酸铵的量为0.002～0.05g/L·h；较佳地0.005～0.02g/L·h；或
发酵培养基为合成型培养基，包括葡萄糖，硫酸镁，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，丙氨酸，精氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，柠檬酸三钠，氯化钴，硼酸钠，三氯化铁，氯化铜，钼酸铵。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113174418A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-07-27 | 华东理工大学 | 一种基因组模型指导正丙醇补料提高红霉素产量的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296571A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-02-03 | 宁夏启元药业有限公司 | 一种提高红霉素发酵效价的方法 |
| CN108467879A (zh) * | 2017-02-23 | 2018-08-31 | 华东理工大学 | 一种用于红霉素发酵的合成培养基 |
| CN110452945A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 华东理工大学 | 利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素的新型方法 |
| CN113174418A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-07-27 | 华东理工大学 | 一种基因组模型指导正丙醇补料提高红霉素产量的方法 |
-
2019
- 2019-09-25 CN CN201910909507.1A patent/CN112553132A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296571A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-02-03 | 宁夏启元药业有限公司 | 一种提高红霉素发酵效价的方法 |
| CN108467879A (zh) * | 2017-02-23 | 2018-08-31 | 华东理工大学 | 一种用于红霉素发酵的合成培养基 |
| CN110452945A (zh) * | 2018-05-07 | 2019-11-15 | 华东理工大学 | 利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素的新型方法 |
| CN113174418A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-07-27 | 华东理工大学 | 一种基因组模型指导正丙醇补料提高红霉素产量的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YONG CHEN ET AL.: "Significant decrease of broth viscosity and glucose consumption in erythromycin fermentation by dynamic regulation of ammonium sulfate and phosphate", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 * |
| 庄振栋: "红色糖多孢菌全基因组规模代谢网络模型重构及其应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 * |
| 沈兆兵等: "豆油在红霉素发酵中的作用及作用机制的研究", 《中国抗生素杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113174418A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-07-27 | 华东理工大学 | 一种基因组模型指导正丙醇补料提高红霉素产量的方法 |
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