JP2801966B2

JP2801966B2 - ナタマイシンの連続製造法

Info

Publication number: JP2801966B2
Application number: JP5503816A
Authority: JP
Inventors: オルソン、フィリップ・テリー
Original assignee: バイオーテクニカル・リソーシス
Priority date: 1991-08-05
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1998-09-21
Anticipated expiration: 2013-09-21
Also published as: IL102728A0; DE69214654D1; CN1041536C; IL102728A; DE69214654T2; AU2408092A; WO1993003171A1; CA2115036C; NZ243827A; ZA925869B; MX9204520A; ES2093272T3; CN1070688A; JPH06508763A; TW213489B; EP0598009A1; CA2115036A1; EP0598009B1

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕本発明はナタマイシン（natamycin）の製造に関し、
より詳しくは、接種物を連続発酵することにより、長期
間に亘って連続的に高収率でナタマイシンを得る方法に
関する。

ナタマイシンは、ポリエン抗真菌剤の一つである。化
合物としてのナタマイシンは、一般にc₃₃H₄₇NO₁₃の実験
式で表される分子量約666のテトラエンであり、グリコ
シジル結合した糖鎖部分（マイコサミン（mycosamin
e））を含んでいる。ナタマイシンはpHが約6.5の等電点
を有し、構造的にみると、典型的には二つのコンフィギ
ュレーション（エノール構造およびケト構造）が存在す
る。

ナタマイシンを製造するための従来のバッチ式発酵法
が、アメリカンサイアナミド社の英国特許第846,933中
に記載されている。この英国特許第846,933での開示内
容は、本明細書中に参照として組み込まれる。

ナタマイシンは抗生物質および抗真菌剤として価値が
あるにもかかわらず、商業的には極めて少ししか使用さ
れていない。その大きな理由は、製造コストが高いこと
である。

本発明の目的は、所定の培地中で接種物を増殖させ発
酵させることにより、従来の製造法の非効率性を克服し
て、コスト的に有利な仕方で有用な量のナタマイシンを
製造するための連続製造法を提供することである。

〔発明の概要〕

本発明は発酵によるナタマイシンの製造方法であっ
て、該発酵が連続的に行なわれる方法に関する。この発
酵法は、基本的な二つの段階を具備している。第一段階
は培養物の増殖であり、第二段階はナタマイシンの製造
である。この方法によって、連続的かつ高収率でのナタ
マイシンの製造（即ち、長期の発酵期間に亘って約４〜
少なくとも約12g/）が達成される。

本発明においては、ナタマイシンを産生し得る微生物
を連続的に発酵させる。特に、本発明は、発酵の際にナ
タマイシンを産生するストレプトマイセス種（Streptom
yces species）を含む接種物の調製（例えば芽胞形成）
および増殖に向けられている。

ナタマイシンの高収率は、これにより発酵ブロスから
のナタマイシンの回収が著しく容易になるため、経済的
に重要である。更に、本発明の連続製造によって、発酵
装置のコスト効果の改善、並びに製造培地のより効率的
な使用が達成される。また、一連のバッチ操作に比較し
て、連続発酵法では必要とされる接種物調製の数が減少
する。

〔図面の簡単な説明〕

図１は、接種物増殖（inoculum propagation）のため
に本発明で使用されるプロセスの模式的ブロックダイア
グラムである。

図２は、本発明の連続的ナタマイシン発酵プロセスの
間に起こる二つの段階を示すグラフである。

〔発明の詳細な説明〕

本発明に従えば、ナタマイシンを産生し得る微生物が
所定の培地に接触されて接種物が調製され、次いで、更
なる繁殖の際に該微生物の最大代謝活性を支持して連続
的にナタマイシンを製造するような、所定の発酵製造培
地中に移される。連続発酵の間に、微生物は所定の製造
培地の少なくとも一部をナタマイシンに変化させる。

本発明の発酵プロセスは、二つの段階を具備してい
る。第一段階は、ストレプトマイセス種の培養物を含有
する接種物の増殖（幾らかのナタマイシン産生が付随し
得る）である。第一段階の間のナタマイシン産生速度
は、ゼロから第二段階の定常速度まで増大する。第二段
階は、主に、約４〜少なくとも約12g/の発酵ブロス中
濃度を達成するような、平衡または定常状態で且つ高速
でのナタマイシン製造に向けられている。主要な活性が
培養物増殖である時に起こる幾らかのナタマイシン産生
と、ナタマイシン製造の全体を通して継続する培養物増
殖とに関して、これら二つの段階は相互に重なり合って
いる。

第二段階の間に、培養物増殖と高いナタマイシン産生
速度とが略一定になるように、所定の平衡が達成され且
つ維持される。この培養物増殖／高いナタマイシン産生
速度の間の平衡は、次の１）および２）によって達成さ
れる:1）適切な時間から開始して、連続製造培地を発酵
槽に連続的に添加し、一定速度での培養物増殖およびナ
タマイシン製造を維持すること;2）ナタマイシンを含有
する発酵ブロスを取り出すこと。この連続段階または第
二段階において、ブロス濃度およびブロス容量は一定に
維持される。しかし、所望とあらば、培地の組成および
点加速度を変更することにより、異なったナタマイシン
産生速度が達成され得る。

連続製造段階の間の平衡は、理論的には制限なく継続
することができる。しかし、本発明の実施において、連
続段階は実際には汚染または装置の不調によって制限さ
れるので、通常は少なくとも約40日またはナタマイシン
産生速度が非経済的収率になるまで継続される。

連続発酵を可能にする本発明の重要な側面は、下記の
１〜６によって特徴付けられる。

1.発酵の第一段階を開始するために発酵槽に導入される
培養物を、増殖するために用いられる接種培地の組成。

2.少なくとも二つの発酵段階；第一段階は非定常状態で
の培養物増殖／ナタマイシン産生であり、その間にナタ
マイシン産生速度は増大する。第二段階は所定の平衡に
おける培養物増殖／高速でのナタマイシン製造である。

3.発酵培地の組成。

4.発酵培地を添加すると共に、等量の発酵ブロスを取り
出してバランスさせることにより達成される、一定の発
酵ブロス容量、一定の発酵ブロス組成、および発酵ブロ
ス中の一定の培養物濃度。

5.経済的な培地消費およびナタマイシン製造の両者を最
大とするように選択された、培地添加／ブロス取出しの
速度。

6.所望とあらば、ナタマイシンは取り出された発酵ブロ
スから回収または分離することができる。

ナタマイシンを産生するストレプトマイセス種であれ
ば、何れの微生物も本発明に従って使用することができ
る。好ましいストレプトマイセス種には、先にアメリカ
合衆国メリーランド州ロックウイルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託され、AT
CC受付番号第13326号として登録されたストレプトマイ
セス・ギルボスポレウス（Streptomyces gilvosporeu
s）が含まれる。

発酵すべき接種物は、適切な芽胞の芽胞懸濁液から調
製される。適切なストレプトマイセス種の接種物は、続
いて本発明の連続発酵培地中に置かれ、発酵されて高収
率でナタマイシンが製造される。該接種物は、典型的に
は一連の増殖段階に付される。夫々の各増殖段階におい
て、ナタマイシンを産生する細胞の量は増大する。スト
レプトマイセス細胞が充分な量になった後、これらスト
レプトマイセスは、ストレプトマイセスが発酵するとき
に連続的なナタマイシン産生を達成するように設計され
た環境および／または培地中に置かれる。

芽胞懸濁液接種物の調製は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションから得たナタマイシン産生ストレプトマイ
セス種の芽胞を採取することから始まる。この芽胞を発
芽させて、活発に増殖する該ストレプトマイセス種の培
養物を製造する。この活発に増殖するストレプトマイセ
ス種の培養物（例えばStreptomyces gilvosporeusまた
は他のナタマイシン産生種）を、滅菌（例えばオートク
レーブで）された寒天傾斜培養器に重接種し、傾斜培養
器の全体が実質的に芽胞で覆われるまでインキュベート
する。寒天傾斜培養器上の芽胞を、水（例えば蒸留
水）、栄養培地等のような少量の液体中に削ぎ落し、水
性の芽胞懸濁液を調製する。得られた芽胞懸濁液を増殖
して、発酵操作（即ちナタマイシン製造）のための接種
物を製造する。最良の結果を得るためには、接種物増殖
（inoculum propagation）の開始に用いられる芽胞懸濁
液は、約10⁵〜10¹⁰CFU/ml、正規には少なくとも約10⁸CF
U/mlの濃度の芽胞を含有していなければならない。

芽胞懸濁液の形成に用いる、ストレプトマイセス種
（例えばS.gilvosporeus）の芽胞形成を促進するため
に、多くの寒天傾斜培養培地を使用できる。適切な寒天
傾斜培養培地は、典型的には次の群から選ばれる少なく
とも一つを含む：酵母麦芽寒天、ヒッキー・ターナー寒
天（Hickey−Turner agar）、GYA寒天、プリドハム寒天
（Pridham agar）、ポテトデキストロース寒天、ベネッ
ト寒天（Bennett′s agar）等。

芽胞懸濁液中に高濃度（例えば10⁸CFU/ml）の生存可
能な芽胞が含まれることが、本発の重要な特徴である。
第一に、もし芽胞の濃度が低すぎると、接種物増殖によ
り、ナタマイシンのコスト的に有効な発酵製造に充分な
量のストレプトマイセス細胞を得るために、極めて長時
間を要することになる。第二に、懸濁液中の芽胞量が減
少すると、全体の接種物増殖の時間が長くなり、汚染
（例えば望ましくない微生物による）される傾向が高く
なる。更に、懸濁液中の低い芽胞濃度は、大きな密に詰
まった菌系ペレット形成を促進する。これらペレット
は、該ペレット中への酸素の移動および栄養のマス移動
に関連した問題のために、ナタマイシンを高収率で得る
は適さない。菌系ペレットが望ましくない程に大きくな
ったときは、剪断力（例えば混合）を用いる等により、
該ペレットを物理的に砕くことができる。

接種物の増殖上記の胞子の水性懸濁液（例えばS.gilvosporeus）を
発芽させ、微生物が発酵によるナタマイシン製造に充分
な数になるまで細胞増殖を継続させる。適切な接種物細
胞濃度は乾燥細胞重量で約１〜5g/であり、ナタマイ
シン製造培地容積の約0.1〜10容量％で使用される。

接種物増殖に用いられる水性培地によって、接種物の
細胞密度および代謝状態が決定される（例えば、充分な
密度の健康細胞が望ましい）。望ましい細胞密度および
代謝状態を有する接種物を得るためには、蛋白窒素源に
共通に存在する複合増殖因子（例えばビタミン）、無機
元素（例えばカリウム、ナトリウム、カルシウム等）お
よび微量元素（例えばホウ素、コバルト、鉄、銅、亜鉛
等）を含む充分な量の蛋白窒素源が必要とされる。この
蛋白窒素源は、発酵により、望ましい高収率でナタマイ
シンを産生する接種物へと芽胞懸濁液を増殖するような
ものであれば、如何なるものでもよい。

代謝性炭素源もまた、望ましい接種物細胞密度を達成
するのに充分な量で、再生接種培地に供給されなければ
ならない。最良の結果を得るためには、接種物増殖の間
に炭素源が完全に消耗されてはならない。炭素源が消耗
すると接種物の代謝状態が悪化し、発酵の際のナタマイ
シン収率が減少する傾向を生じる。

種々の水性接種物培地が本発明に従って効果的に使用
され得るが、高収率でナタマイシンを得る所定量の培地
成分を用いるのが有利である。

接種物増殖のための適切な培地は水中（例えば低ミネ
ラル水、蒸留水等）のものとして調製され、下記のａ）
及びｂ）を含有する。

ａ）約２〜16g/、正規には約8g/の量の蛋白窒素
源。

ｂ）全炭素の消耗を回避するのに充分な量、通常は５〜
30g/1培地、正規には約15g/の量で存在する代謝性
炭素源。

接種物増殖に適した培地の具体的な二つの組成を下記
に示す。組成１量・ディスコ「バクト」ペプトン 5g/ （Difco“Bacto"peptone）・コーンスティープ液 3g/ ・塩化ナトリウム 10g/ ・グルコース 15g/組成２量・ホーメルペプトンPSR 5 8g/ （Hormel peptone PSR 5）・塩化ナトリウム 10g/ ・グルコース 15g/ ストレプトマイセス細胞の生産速度を高めるための栄
養素を提供する接種物培地は、通常の技術（例えば、約
120−140℃の温度で炭素源および窒素源を別々にまたは
同時に滅菌する）によって調製され得る。滅菌後の接種
物培地は、望ましくは約７のpHを有する。芽胞懸濁液を
接種物培地に導入し、該接種培地を約25−40℃、正規に
は約28−35℃の温度に加熱する。

ナタマイシンの連続的発酵製造のために望ましい大容
量の水性接種物を得るためには、夫々の段階が先の段階
よりも大きい容量で行なわれる数段階の接種物増殖ステ
ップが必要とされる、例えば、接種物増殖は、細胞量の
指数関数的増大を達成するように行なわれる。特に、各
段階での増殖の際、接種物の容量を効果的に増大するこ
とによって、増殖の間、培養物の指数増殖を維持するの
が有利である。これは、夫々の段階の持続時間を最少限
にすることによって、または段階数を最小限にすること
によって行なわれる。例えば、接種物の所定の細胞密度
が達成されたときに、該接種物は、更なる増殖のために
より大きな環境（例えば容器）に移される。接種物増殖
を効果的に制御することによって、接種物増殖に費やさ
れる時間および費用を最小限とし、従って発酵の際のコ
スト的に有利なナタマイシンの製造を増強することでき
る。

一連の接種物増殖段階における個々の段階の時間は、
培地の組成、望ましいストレプトマイセス細胞の量、温
度等に応じて持続される。典型的には、個々の増殖段階
は約６時間〜少なくとも約24時間までの間行なわれる。

接種物増殖プロセスでは、接種物への通気が必要とさ
れる。例えば、約200rpmのロータリー振蘯器で容器また
はフラスコを撹拌すればよい。本発明の一つの側面にお
いては、滅菌空気を容器の底に強制的に導入しながら、
接種物を収容する容器内に配置されたインペレラーによ
って、接種物を撹拌してもよい。

図１を参照すると、この図は、ナタマイシンを製造す
るために発酵される接種物の製造に用いられるプロセス
の概要を示す図である。図１は、増殖によって達成され
る接種物の容量増大を示しており、この容量の増大は、
ナタマイシンをコスト的に有利に製造するのに充分な量
の接種物を得るために必要とされる。例えば、1225リッ
トルの水性接種培地を収容した容器に、25リットルの接
種物を添加することによって、接種物の容量は25リット
ルから1250リットルにまで増大される。

増殖された接種物は、発酵培地が収容されている発酵
槽中に導入される。発酵の第一段階の間、迅速な培養増
殖はナタマイシン産生を増大しながら継続される。発酵
の第二段階でのナタマイシン産生は、約１日のうちに高
収率で安定化し、数日間継続される。ブロス中のナタマ
イシン濃度は、通常は１以上の接種培地成分の消耗によ
ってナタマイシン産生速度が減少し始めるまで、略一定
の速度で増大する。

ナタマイシンの連続製造発酵の第二段階は、ナタマイシンの産生速度が低下し
始める前または直後に開始される。ナタマイシン産生速
度は、発酵ブロス中のナタマイシン濃度を連続的にモニ
ターすることによって決定される。第二段階に到達した
ときに、培地の添加速度および培地の取り出し速度を等
しくする。取り出された発酵ブロスの組成をモニターす
ることによって、発酵培地の最適な利用を得るために、
培地添加／ブロス取出しの速度を調節する。培地の可能
な最大限の利用は、培地に添加された何れかの成分が、
発酵ブロス中でのゼロ定常状態濃度にまで減少したとき
に達成される。培地および装置のコストによっては、可
能な最大限の利用を与えるよりも幾分速い速度で培地を
添加し、ブロスを取出すことが経済的に望ましい。

培地の添加およびブロスの取出しは、許容可能な何れ
の技術によって行ってもよい。例えば、培地の添加およ
び／またはブロス取出しは、ポンプ（例えば真空ポン
プ）、圧力、重力等を用いることによって達成すること
ができる。

所望とあらば、連続製造における最適な経済性を得る
ために、何時でも、第二段階発酵培地の組成または供給
速度を調節し又は若干の変化を加えることができる。ま
た、使用する装置によっては、全体の平均ブロス容量が
略一定のままである限り、培地の添加および／またはブ
ロスの取出しを間欠的に行うことが望ましいかもしれな
い。更に、第二段階の培地の添加は、第一段階の終了よ
りも早期に開始することができる。しかし、既述の定常
状態が達成されるまでは、第二段階を開始することはで
きない。

第二段階の間、ナタマイシン、バイオマス（例えばス
トレプトマイセス細胞）および製造培地を含む発酵ブロ
スは連続的に取り出され、ナタマイシンはこの取り出さ
れたブロスからバイオマスとの混合物として回収され、
および／またはナタマイシン（例えば結晶形態で）とし
て抽出される。ナタマイシンは、有用な形態および量で
ナタマイシンを得る適切な技術によって回収することが
できる。ナタマイシンがバイオマスと混合されていると
きは、所望とあらば、何れかの適切な技術によってバイ
オマスからナタマイシンを回収することができる。

連続的な定常状態の第二発酵段階は、主に汚染物の侵
入または装置の不調のみによって制限され、長時間に亘
って持続され得る（例えば、本発明は少なくとも約40日
に亘って継続することができる）。

連続的なナタマイシン製造は、その中で発酵プロセス
を実行し得る発酵容器内で行われる。ナタマイシンの最
大収量を達成するために重要な一つの因子は、水性発酵
培地の組成である。発酵培地は、適切な量の代謝性炭素
および蛋白窒素を含有していなければならない。また、
該培地は、蛋白窒素源に通常存在する複合増殖因子（例
えばビタミン類）、無機元素（例えばカリウム、ナトリ
ウム、カルシウム等）および微量元素（例えばホウ素、
コバルト、鉄、銅、亜鉛等）を含有するのが望ましい。

発酵のための適切な培地は水中（例えば低ミネラル含
量のタップ水、蒸留水等）のものとして調製され、下記
のａ）及びｂ）を含有する。

ａ）約80〜250g/の代謝性炭素源ｂ）少なくとも15g/、正規には約20g/〜80g/の蛋
白および微量成分。蛋白窒素源は、非酵母蛋白窒素成分
および酵母蛋白窒素成分を含んでいてもよい。これら二
つの蛋白窒素成分は夫々、通常は約5:1〜11:1の範囲の
比率で存在し、最良の結果を得るためには一般に約8:1
である。

これら代謝性炭素源および蛋白窒素源の量は、適切な
供給源（source）を連続的且つ同等に添加することによ
り、第二段階の全体に亘って発酵培地中に連続的に維持
される。発酵培地中の特定の供給源の量は、取り出され
たブロスをモニターし、適切な調節を行うことによって
測定される。

蛋白窒素源は、広範な供給源から連続的に供給され
る。例えば、大豆蛋白製品（例えば単離物、粉末、引き
割り等）は、非酵母蛋白窒素源を含有してもよい（例え
ば望ましいナタマイシン収量は、80−95％の蛋白を含む
大豆蛋白で得られる）。また、蛋白窒素は牛肉抽出物、
蛋白の加水分解物（例えばペプトン）、および／または
酵母（例えば抽出物、自己消化物等）を含んでいてもよ
い。

上記で述べたように、製造培地はストレプトマイセス
種によって代謝され得る炭素源をも含有しなければなら
ない。この炭素源は、グルコース、多糖類、コーン澱
粉、ポテト澱粉等のような何れかの好都合な形で供給さ
れ得る。

更に、本発明の一つの側面においては、ナタマイシン
製造培地の出発成分として、ナタマイシンの製造に必要
とされる炭素源の全量を最初に導入する必要はない（例
えば、炭素源の初期の量は発酵の完結に充分ではな
い）。本発明のこの側面において、第一段階の間は、約
５〜30g/、通常は20g/の炭素源量を維持するよう
に、ナタマイシンを製造しながら炭素源の添加が行われ
る。こうして、最初には適切な量の適切な炭素源が発酵
培地に添加され、発酵が開始された後に再び添加され
る。、第二段階の連続的なナタマイシン製造の間、炭素
源は、ナタマイシン製造培地の添加速度に比例した所定
の速度で添加される。炭素源の添加速度は、好ましく
は、発酵槽から未消費の炭素源を除去することなく、連
続的かつ高速でのナタマイシン製造を維持する炭素源を
与えるのに充分な速度である（例えば、炭素源の量は実
質的に、発酵プロセスを維持するために必要な発酵培地
中の炭素源の量に等しい）。

本発明の他の側面においては、炭素源は製造培地の一
部として添加することができ、その場合の炭素源の添加
速度は製造培地の添加速度によって決定される。

ストレプトマイセス発酵およびナタマイシン製造のた
めの栄養素を提供するナタマイシン産生培地は、通常の
技術によって調製される（例えば、約120−140℃の温度
で、炭素源および窒素源を別々に又は同時に滅菌す
る）。この製造培地は、滅菌の後に望ましくは約７のpH
を有する。本発明の一つの側面においては、発酵培地は
発酵槽に導入する途中で滅菌してもよい。例えば、発酵
槽へ連続的に供給される発酵培地を、該発酵培地を滅菌
できるようなパイプ、導管または他の適切な手段（例え
ば連続滅菌器）に通せばよい。

製造培地の中に約0.1−10容量％、通常は約２容量％
の濃度が達成されるまで、接種物は発酵容器に導入され
る（例えば、この接種物の量は連続発酵槽に接種するた
めに充分であり得る）。発酵槽の残りの容量には発酵培
地が含まれる。接種物を発酵槽内の製造培地に導入する
ためには、接種物を活発な代謝状態で送給するものであ
れば、何れの技術も許容され得る。

発酵培地または製造培地は、約25℃〜40℃、正規には
28℃〜35℃の温度にされる。

発酵の間、ナタマイシン製造培地に酸素が供給され
る。発酵の大部分の間、製造培地中の溶存酸素を約20％
〜80％空気飽和のレベルに維持するのが有利である。適
切な溶存酸素レベルを達成する能力は、通気および／ま
たは撹拌速度を適切に調製することによって向上する。
例えば、発酵培地または製造培地は、通常は発酵培地の
容量当り約0.3〜少なくとも約1.0容量の空気の比率で、
培地を通して空気（例えば滅菌空気）を強制的に送るこ
とによって通気される。本発明の一つの側面において
は、通気しながら発酵培地を撹拌するのが望ましい。更
に、この通気速度はまた、発酵培地を撹拌するのに充分
であり得る。

次に、図２を参照すると、本発明の基本的な二つの段
階の夫々について、時間とナタマイシン産生速度との間
の関係が示されている。第一段階には、或は程度のナタ
マイシン産生を伴った、ストレプトマイセス種の増殖が
含まれる。第二段階であるナタマイシンの連続製造は、
培地添加とブロス取出しとの間に平衡が達成されたとき
に確立される。第二段階は、ナタマイシンが最早有利な
コストでは製造されなくなるまで継続される（例えば、
汚染によってプロセスは非効率的になる）。

本発明の一つの側面において、発泡の制御が望ましい
ときは、発酵培地またはナタマイシン製造培地の約0.01
〜１容量％の量で、泡立ち防止剤（例えばシリコーン消
泡剤）を発酵培地に添加するのが望ましい。

接種物を添加した後のナタマイシン製造培地は、約7.
0のpHを有し、発酵の間にpHは典型的には約4.5まで徐々
に低下する。このpHの低下は、ストレプトマイセス種の
代謝活動の結果である。発酵ブロスの最終用途によって
は、発酵培地は低いpHを有するのが望ましい。しかし、
所望とあらば、適時に塩基性物質を添加することによ
り、pHを上昇させ又は制御してもよい（例えば、所定の
pHを維持するために、水酸化カリウムを連続的または間
欠的に発酵培地に添加すればよい）。また、培地の組成
および／または培地添加／ブロス取出し速度を変更する
ことによっても、pHを上昇または低下させることができ
る。

本発明が適切に実施されるときは（例えば、ストレプ
トマイセス接種物の効果的な取扱い、培地添加およびブ
ロス取出しの調節）、得られた発酵ブロスには、正規に
は少なくとも約4g/のナタマイシンが含まれる。ある
場合、ナタマイシン製造のレベルは、約7g/〜少なく
とも12g/の範囲に亘り得る。

以下、実施例によって本発明を例示するが、これら実
施例は例示のみを意図するものであり、可能な均等物の
範囲を制限するものではない。他に特別に指定しない限
り、商業的に入手可能な試薬等級の材料が、以下の実施
例を行なうために用いられた。

実施例１以下の例において、次の一般組成の寒天傾斜培養器が
蒸留水中で調製された。滅菌は約121℃で約15分間であ
る。

・3g/の酵母抽出物（Difco“Bacto"酵母抽出物）・3g/の麦芽抽出物（Difco麦芽抽出物）・5g/のペプトン（Difco“Bacto"ペプトン）・10g/のグルコース・15g/の寒天次の一般組成の接種培地が蒸留水中で調製され、水酸
化カリウムでpH約7.0に調節された。滅菌は約121℃で約
15分であった。

・15g/のグルコース・10g/の塩化ナトリウム・6g/のコーンスティープ液（PPM,copn steep Liquid）・5g/のペプトン（Difco “Bacto"ペプトン）凍結乾燥された芽胞懸濁液としてATCCから入手した、
ストレプトマイセス・ギルボスポレウム（ATCC登録番号
第13326号）が培養物源として用いられた。培養物は接
種培地で増殖され、芽胞形成のため、約25℃で寒天傾斜
培養器上に保持された。接種物の発育は、寒天傾斜培培
地培養（agar slant cultures）で開始された。

この接種物製造のための寒天傾斜培養器では、約10日
以内に多くの芽胞が形成された。約10⁸CFU/mlの芽胞懸
濁液濃度を得るために、これらの寒天傾斜培養器から、
芽胞を接種培地中に削ぎ落とした。この芽胞懸濁液略2m
lを、500mlのバッフル付フラスコ内に収容された約100m
lの接種培地に添加した。該培養物は、約29℃で合計約4
8時間、三段階でインキュベートされ、ロータリー振蘯
器上において約240rpmで撹拌された。最初の二段階は夫
々12時間であり、第三段階は約24時間であった。第二段
階および第三段階では、先行段階からの約２容量％の培
地が新鮮な培地に導入された。こうして製造された最後
の接種培養物は、製造培地を必要な接種濃度で接種する
ために用いられた。

第一段階のナタマイシン製造培地は、次の一般的な初
期組成を有していた。

・19.5g/の大豆蛋白単離物（ADM,“Profam"S970）・ 4.5g/の酵母抽出物（Stauffer,Type KAT）・ 0.2g/の消泡剤（Mazu,DF298）１リットル発酵槽内で蒸留水中の略600mlの培地を調
製し、水酸化カリウムでpHを約7.6に調節した。次い
で、約121℃で約15分間、この１リットル発酵槽を滅菌
した。これとは別に、グルコース（これも第一段階培地
の一部である）を略50％の蒸留水溶液として滅菌し、約
40g/の濃度で初期培地に添加した。

接種を行なう前に、製造培地を約29℃に加熱し、通気
速度を約250ml/分にセットし、撹拌速度を約500rpmにセ
ットした。

次いで、ストレプトマイセス・ギルボスポレウス（AT
CC登録番号第13326号）を含む接種物を、製造培地容量
の約２％で発酵槽に添加し、製造サイクルの第一段階を
開始させた。発酵第一段階での約20g/のグルコース濃
度を維持するために、接種後約40時間の時点で、グルコ
ースの添加を開始した。これは、約1g/時間の速度
で、グルコースを発酵容器に供給することによって行な
われた。

接種（発酵の第一段階が開始された時点）の略72時間
の後に、ナタマイシンの産生速度は低下し始めた。ブロ
スの濃度は約9.0g/であった。第二段階培地が添加さ
れると共に、約600mlの一定ブロス容量を維持するため
に、発酵ブロスは約12ml/時の速度で発酵槽から抜き取
られた。この製造培地は、略19.5g/の大豆蛋白単離物
と、4.5g/の酵母抽出物と、50g/のグルコースと、
0.2ml/の消泡剤とを含有していた。

上記の添加および抜き取りは約12ml/時で続けられ、
発酵は発酵第一段階の開始後の約200時間まで継続され
た。この期間の間はナタマイシン産生は中程度に過ぎ
ず、ブロス中のナタマイシン濃度は約4.5g/であっ
た。この生成物は抜き取られたブロスから回収された。

ナタマイシンの産生速度を増大するために、培地を次
の一般組成に変更した:26g/の大豆蛋白単離物、6g/
の酵母抽出物と、80g/のグルコースと、0.3ml/の消
泡剤。この富化された栄養培地の添加およびブロスの抜
き取りを、略同じ速度で継続した。第一段階の開始から
約250時間の時点で、抜き取られたブロス中のナタマイ
シン濃度は約8.5g/の高収率にまで増大し、この濃度
は発酵の残りの期間を通して略一定であった。約450時
間の時点で、プロセスは中止された。

実施例２第一段階の製造培地が26.0g/の大豆蛋白単離物と、
6.0g/の酵母抽出物と、0.3ml/の消泡剤とを含有す
ることを除いて、実施例１と実質的に同様にして、第一
段階のプロセスが行なわれた。

第一段階の開始から約70時間後に、ナタマイシン濃度
は約6.0g/に達し、第二段階である連続操作が開始さ
れた。第二段階の培地組成は略次の通りである:26.0g/
の大豆蛋白単離物、6.0g/の酵母抽出物、80g/の
グルコース、0.3ml/の消泡剤。この培地は約12ml/時
の速度で添加され、発酵ブロスは約600mlの一定容量を
維持するために抜き取られた。約117時間の時点で定常
状態の平衡が達成され、ナタマイシン濃度は約8.0g/
であった。これは、約250時間（発酵を停止した時間）
まで一定であった。

上記に詳述したのは少数の実施例にすぎないが、本発
明には多くの組み合わせ及び変形が含まれることを当業
者は容易に理解できるであろう。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】発酵によりナタマイシンを製造する方法で
あって、（ａ）前記発酵は少なくとも２段階の発酵であり、その
第一段階には非定常状態での培養物増殖とナタマイシン
産生とが含まれ、該第一段階の間にブロス中での濃度が
増大するようにナタマイシンが産生される一方で、その
第二段階には定常状態の速度での培養物増殖およびナタ
マイシン産生が含まれ、該第二段階の間は発酵ブロスに
組成および容量が実質的に一定であることと、（ｂ）約２〜約16g/の蛋白窒素源および接種物調製の
間の全炭素の消耗を回避するのに充分な量の代謝性炭素
源を含有する接種培地中に、ナタマイシンを産生するス
トレプトマイセス株が含まれる接種物を利用し、該接種
物を、約0.1〜約10容量％の量で、第一段階の発酵培地
に添加することと、（ｃ）前記第一段階の発酵における培地として、少なく
とも15g/の蛋白窒素源と、発酵培地中に約５〜約40g/
の炭素源濃度を維持するのに充分な量の代謝性炭素源
とを含有する発酵培地を利用することと、（ｄ）少なくとも約15g/の蛋白窒素源と、ナタマイシ
ン産生を維持できる量の代謝性炭素源とを含有した、高
速でのナタマイシン産生を支持することができる第二段
階の発酵培地を、第一段階の発酵ブロス中に連続的に添
加することと、（ｅ）前記第二段階の培地を添加する間、培地添加量と
発酵ブロスの取り出し量とを等しくすることによって、
濃度が少なくとも4g/のナタマイシンを含む発酵ブロ
スの組成およびその容量に関して定常状態を達成するこ
とと、（ｆ）取り出された発酵ブロスからナタマイシンを回収
することとを具備したナタマイシンの製造方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、更に、前
記発酵培地に通気することを具備した方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、更に、前
記発酵培地を撹拌することを具備した方法。
【請求項４】請求項２に記載の方法であって、前記通気
速度が、発酵培地を撹拌するために充分な速度である方
法。
【請求項５】請求項１に記載の方法であって、更に、前
記発酵培地をその供給の途中で滅菌することを具備した
方法。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法
であって、前記蛋白窒素源は非酵母蛋白窒素成分と酵母
蛋白窒素成分とを含み、非酵母蛋白窒素成分の酵母蛋白
窒素成分に対する比が5:1から11:1までの範囲である方
法。
【請求項７】請求項１〜６の何れか１項に記載の方法で
あって、前記のストレプトマイセス株が、ATCC受け入れ
番号13326の下に寄託されたストレプトマイセス・ギル
ボスポレウス（Streptomyces gilvosporeus）である方
法。