JPH06508763A - ナタマイシンの連続製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ナタマイシンの連続製造法 〔発明の背景〕 本発明はナタマイシン（ｎａｔａｍｙｃｉｎ）の製造に関し、より詳しくは、接 種物を連続発酵することにより、長期間に亘って連続的に高収率でナタミマイシ ンを得る方法に関する。

ナタマイシンは、ポリエン抗真菌剤の一つである。化合物的としてのナタマイシ ンは、一般にＣ３３Ｈ４７Ｎ０１３の実験式で表される分子量約６６６のテトラ エンであり、グリコシジル結合した糖鎖部分（マイコサミン（ｍｙｃｏｓａＩｌ ］１ｎｅ）　）を含んでいる。ナタマイシンはｐＨが約６．５の等電点を有し、 構造的にみると、典型的には二つのコンフィギユレーション（エノール構造およ びケト構造）が存在する。

ナタマイシンを製造するための従来のバッチ式発酵法が、アメリカンサイアナミ ド社の英国特許第８４６．９３３中に記載されている。この英国特許第８４６． ９３３での開示内容は、本明細書中に参照として組み込まれる。

ナタマイシンは抗生物質および抗真菌剤として価値があるにもかかわらず、商業 的には極めて少ししか使用されていない。その大きな理由は、製造コストが高い ことである。

本発明の目的は、所定の培地中で接種物を増殖させ発酵させることにより、従来 の製造法の非効率性を克服して、コスト的に宵月な仕方で有用な量のナタマイシ ンを製造するための連続製造法を提供することである。

〔発明の概要〕

本発明は発酵によるナタマイシンの製造方法であって、該発酵か連続的に行なわ れる方法に関する。この発酵法は、基本的な二つの段階を具備している。第一段 階は培養物の増殖であり、第二段階はナタマイシンの製造である。この方法によ って、連続的かつ高収率でのナタマイシンの製造（即ち、長期の発酵期間に亘っ て約４〜少なくとも約１２ｇ／ｆｌ）が達成される。

本発明においては、ナタマイシンを産生じ得る微生物を連続的に発酵させる。特 に、本発明は、発酵の際にナタマイシンを産生ずるストレプトマイセス種（Ｓｔ ｒｅｐｊｏｍｙｃｅｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）　、を含む接種物の調製（例えば芽胞 形成）および増殖に向けられている。

ナタマイシンの高収率は、これにより発酵ブロスからのナタマイシンの回収が著 しく容易になるため、経済的に重要である。更に、本発明の連続製造によって、 発酵装置のコスト効果の改善、並びに製造培地のより効率的な使用が達成される 。また、一連のバッチ操作に比較して、連続発酵法では必要とされる接種物調製 の数が減少する。

〔図面の簡単な説明〕

図１は、接種物増殖（ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）のために本 発明で使用されるプロセスの模式的ブロックダイアグラムである。

図２は、本発明の連続的ナタマイシン発酵プロセスの間に起こる二つの段階を示 すグラフである。

〔発明の詳細な説明〕

本発明に従えば、ナタマイシンを産生じ得る微生物が所定の培地に接触されて接 種物か調製され、次いで、更なる繁殖の際に該微生物の最大代謝活性を支持して 連続的にナタマイシンを製造するような、所定の発酵製造培地中に移される。

連続発酵の間に、微生物は所定の製造培地の少なくとも一部をナタマイシンに変 化させる。

本発明の発酵プロセスは、二つの段階を具備している。第一段階は、ストレプト マイセス種の培養物を含有する接種物の増殖（幾らかのナタマイシン産生が付随 し得る）である。

第一段階の間のナタマイシン産生速度は、ゼロから第二段階の定常速度まで増大 する。第二段階は、生に、約４〜少なくとも約１２ｇ／（ｌの発酵ブロス中濃度 を達成するような、平衡または定常状態で且つ高速でのナタマイシン製造に向け られている。主要な活性が培養物増殖である時に起こる幾らかのナタマイシン産 生と、ナタマイシン製造の全体を通して継続する培養物増殖とに関して、これら 二つの段階は相互に重なり合っている。

第二段階の間に、培養物増殖と高いナタマイシン産生速度とが略一定になるよう に、所定の平衡が達成され且つ維持される。この培養物増殖／高いナタマイシン 産生速度の間の平衡は、次の１）および２）によって達成される＝１）適切な時 間から開始して、連続製造培地を発酵槽に連続的に添加し、一定速度での培養物 増殖およびナタマイシン製造を維持すること；２）ナタマイシンを含有する発酵 ブロスを取り出すこと。この連続段階または第二段階において、ブロス濃度およ びブロス容量は一定に維持される。しかし、所望とあらば、培地の組成および点 加速度を変更することにより、異なったナタマイシン産生速度が達成され得る。

連続製造段階の間の平衡は、理論的には制限なく継続することができる。しかし 、本発明の実施において、連続段階は実際には汚染または装置の不調によって制 限されるので、通常は少なくとも約４０日またはナタマイシン産生速度が非経済 的収率になるまで継続される。

連続発酵を可能にする本発明の重要な側面は、下記の１〜６によって特徴付けら れる。

１、発酵の第一段階を開始するために発酵槽に導入される培養物を、増殖するた めに用いられる接種培地の組成。

２、少なくとも二つの発酵段階；第一段階は非定常状態での培養物増殖／ナタマ イシン産生であり、その間にナタマイシン産生速度は増大する。第二段階は所定 の平衡における培養物増殖／高速でのナタマイシン製造である。

３、発酵培地の組成。

４、発酵培地を添加すると共に、等量の発酵ブロスを取り出してバランスさせる ことにより達成される、一定の発酵ブロス容量、一定の発酵ブロス組成、および 発酵ブロス中の一定の培養物濃度。

５、経済的な培地消費およびナタマイシン製造の両者を最大とするように選択さ れた、培地添加／ブロス取出しの速度。

６、所望とあらば、ナタマイシンは取り出された発酵ブロスから回収または分離 することができる。

ナタマイシンを産生ずるストレプトマイセス種であれば、何れの微生物も本発明 に従って使用することができる。好ましいストレプトマイセス種には、先にアメ リカ合衆国メリーランド州ロックウィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクションＣＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受付番号第１３３２６号として登 録されたストレプトマイセス・ギルボスポレウス（Ｓｌｒｅｐｌｏｍｙｃｅｓ　 ｇｉｌｙｏｓｐｏｒｅｕｓ）が含まれる。

発酵すべき接種物は、適切な芽胞の芽胞懸濁液から調製される。適切なストレプ トマイセス種の接種物は、続いて本発明の連続発酵培地中に置かれ、発酵されて 高収率でナタマイシンが製造される。該接種物は、典型的には一連の増殖段階に 付される。夫々の各増殖段階において、ナタマイシンを産生ずる細胞の量は増大 する。ストレプトマイセス細胞が充分な量になった後、これらストレプトマイセ スは、ストレプトマイセスか発酵するときに連続的なナタマイシン産生を達成す るように設計された環境および／または培地中に置かれる。

芽胞懸濁液 接種物の調製は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得たナタ マイシン産生ストレプトマイセス種の芽胞を採取することから始まる。この芽胞 を発芽させて、活発に増殖する該ストレプトマイセス種の培養物を製造する。

この活発に増殖するストレプトマイセス種の培養物（例えばＳｆｒｅｐｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｇｉｌｖｏｓｐｏｒｅｕｓまたは他のナタマイシン産生種）を、滅菌（ 例えはオートクレーブで）された寒天傾斜培養器に重接種し、傾斜培養器の全体 が実質的に芽胞で覆われるまでインキュベートする。寒天傾斜培養器上の芽胞を 、水（例えば蒸留水）、栄養培地等のような少量の液体中に削ぎ落し、水性の芽 胞懸濁液を調製する。得られた芽胞懸濁液を増殖して、発酵操作（即ちナタマイ シン製造）のための接種物を製造する。最良の結果を得るためには、接種物増殖 （ｉｎｏｃｕｌｕｍ１０　ＣＦＵ／ｍΩ、正規には少なくとも約１０”’ＣＦＵ ／ｍρの濃度の芽胞を含有していなければならない。

芽胞懸濁液の形成に用いる、ストレプトマイセス種（例えばＳ、ｇｉｌｙｏｓｐ ｏｒｅｕｓ）の芽胞形成を促進するために、多くの寒天領斜培養培地を使用でき る。適切な寒天領斜培養培地は、典型的には次の群から選ばれる少なくとも一つ を含む；酵母麦芽寒天、ヒツキー−ターナ−寒天（旧ｃｋｅ７−Ｔｕｒ＋＋ｅｒ 　ａｇａｒ）、ＧＹＡ寒天、ブリドハム寒天（Ｐｒｉｄｈａｍ　ａｇａｒ）、ポ テトデキストロース寒天、ベネットの寒天（ＢｅｎｎｅＮ’　ｓ　ａｇａｒ）等 。

芽胞懸濁液中に高濃度（例えば１０　ＣＦＵ／ｍ、Ｑ）の生存可能な芽胞が含ま れることが、本発明の重要な特徴である。

第一に、もし芽胞の濃度が低すぎると、接種物増殖により、ナタマイシンのコス ト的に有効な発酵製造に充分な量のストレプトマイセス細胞を得るために、極め て長時間を要することになる。第二に、懸濁液中の芽胞量が減少すると、全体の 接種物増殖の時間が長くなり、汚染（例えば望ましくない微生物による）される 傾向が高くなる。更に、懸濁液中の低い芽胞濃度は、大きな密に詰まった菌糸ペ レットの形成を促進する。これらペレットは、該ペレット中への酸素の移動およ び栄養のマス移動に関連した問題のために、ナタマイシンを高収率で得るは適さ ない。菌糸ペレットが望ましくない程に大きくなったときは、剪断力（例えば混 合）を用いる等により、該ペレットを物理的に砕くことができる。

接種物の増殖 上記の胞子の水性懸濁液（例えばＳ、ｇｉｌｖｏｓｐｏｒｅｕｓ）を発芽させ、 微生物が発酵によるナタマイシン製造に充分な数になるまで細胞増殖を継続させ る。適切な接種物細胞濃度は乾燥細胞重量で約１〜５ｇ／Ｄであり、ナタマイシ ン製造培地容積の約０．１〜１０容量％で使用される。

接種物増殖に用いられる水性培地によって、接種物の細胞密度および代謝状態が 決定される（例えば、充分な密度の健康細胞が望ましい）。望ましい細胞密度お よび代謝状態を有する接種物を得るためには、蛋白窒素源に共通に存在する複合 増殖因子（例えばビタミン）、無機元素（例えばカリウム、ナトリウム、カルシ ウム等）および微量元素（例えばホウ素、コバルト、鉄、銅、亜鉛等）を含む充 分な量の蛋白窒素源が必要とされる。この蛋白窒素源は、発酵により、望ましい 高収率でナタマイシンを産生ずる接種物へと芽胞懸濁液を増殖するようなもので あれば、如何なるものでもよい。

代謝性炭素源もまた、望ましい接種物細胞密度を達成するのに充分な量で、水性 接種物培地に供給されなければならない。最良の結果を得るためには、接種物増 殖の間に炭素源が完全に消耗されてはならない。炭素源が消耗すると接種物の代 謝状態が悪化し、発酵の際のナタマイシン収率が減少する傾向を生じる。

種々の水性接種物培地か本発明に従って効果的に使用され得るが、高収率でナタ マイシンを得る所定量の培地成分を用いるのが有利である。

接種物増殖のための適切な培地は水中（例えば低ミネラル水、蒸留水等）のもの として調製され、下記のａ）及びｂ）を含有する。

ａ）約２〜１６ｇ／Ｉ、正規には約８ｇ／Ｕの量の蛋白窒素源。

ｂ）全炭素の消耗を回避するのに充分な量、通常は５〜３０ｇ／１１培地、正規 には約１５ｇ、／１の量で存在する代謝性炭素源。

接種物増殖に適した培地の具体的な二つの組成を下記に示す。

組成１　量 ・ディフコ「バクト」ペプトン　５ｇ、Ｑ）（Ｄｉｌｃｏ　Ｂａｃｊｏ　”　ｐ ｅｐｔｏｎｅ　）・コーンステイープ液　３ｇ／Ω ・塩化ナトリウム　１０ｇ／ｇ ・グルコース　１５ｇ／Ω 組成２　量 ・ホーメルペプトンＰＳＲ５８ｇ、＃ （Ｈｏｒｍｅｌ　ｐｅｐｔｏｎｅ　ＰＳＲ５）・塩化ナトリウム　１０ｇ／Ω ・グルコース　１５ｇ／ｌ ストレプトマイセス細胞の生産速度を高めるための栄養素を提供する接種物培地 は、通常の技術（例えば、約１２０−１４０°Ｃの温度で炭素源および窒素源を 別々にまたは同時に滅菌する）によって調製され得る。滅菌後の接種物培地は、 望ましくは約７のｐＨを有する。芽胞懸濁液を接種物培地に導入し、該接種培地 を約２５−４０°Ｃ１正規には約２８−３５６Ｃの温度に加熱する。

ナタマイシンの連続的発酵製造のために望ましい大容量の水性接種物を得るため には、夫々の段階が先の段階よりも大きい容量で行なわれる数段階の接種物増殖 ステップが必要とされる。例えば、接種物増殖は、細胞量の指数関数的増大を達 成するように行なわれる。特に、各段階での増殖の際、接種物の容量を効果的に 増大することによって、増殖の間、培養物の指数増殖を維持するのが有利である 。これは、夫々の段階の持続時間を最小限にすることによって、または段階数を 最小限にすることによって行なわれる。例えば、接種物の所定の細胞密度が達成 されたときに、該接種物は、更なる増殖のためにより大きな環境（例えば容器） に移される。接種物増殖を効果的に制御することによって、接種物増殖に費やさ れる時間および費用を最小限とし、従って発酵の際のコスト的に有利なナタマイ シンの製造を増強することできる。

一連の接種物増殖段階における個々の段階の時間は・培地の組成、望ましいスト レプトマイセス細胞の量、温度等に応じて持続される。典型的には、個々の増殖 段階は約６時間〜少なくとも約２４時間までの間荷なわれる。

接種物増殖プロセスでは、接種物への通気が必要とされる。

例えば、約２００　ｒｐｍのロータリー振濠器で容器またはフラスコを撹拌すれ ばよい。本発明の一つの側面においては、滅菌空気を容器の底に強制的に導入し ながら、接種物を収容する容器内に配置されたインペレラーによって、接種物を 撹拌してもよい。

図１を参照すると、この図は、ナタマイシンを製造するために発酵される接種物 の製造に用いられるプロセスの概要を示す図である。図１は、増殖によって達成 される接種物の容量増大を示しており、この容量の増大は、ナタマイシンをコス ト的に有利に製造するのに充分な量の接種物を得るために必要とされる。例えば 、１２２５！Ｊツトルの水性接種培地を収容した容器に、２５リツトルの接種物 を添゛加することによって、接種物の容量は２５リツトルから１２５０リツトル にまで増大される。

増殖された接種物は、発酵培地が収容されている発酵槽中に導入される。発酵の 第一段階の間、迅速な培養増殖はナタマイシン産生を増大しなから継続される。

発酵の第二段階でのナタマイシン産生は、約１日のうちに高収率で安定化し、数 日間継続される。ブロス中のナタマイシン濃度は、通常は１以上の接種培地成分 の消耗によってナタマイシン産生速度が減少し始めるまで、略一定の速度で増大 する。

発酵の第二段階は、ナタマイシンの産生速度か低下し始める前または直後に開始 される。ナタマイシン産生速度は、発酵ブロス中のナタマイシン濃度を連続的に モニターすることによって決定される。第二段階に到達したときに、培地の添加 速度および培地の取り出し速度を等しくする。取り出された発酵ブロスの組成を モニターすることによって、発酵培地の最適な利用を得るために、培地添加／ブ ロス取出しの速度を調節する。培地の可能な最大限の利用は、培地に添加された 何れかの成分が、発酵ブロス中でのゼロ定常状態濃度にまで減少したときに達成 される。培地および装置のコストによっては、可能な最大限の利用を与えるより も幾分速い速度で培地を添加し、ブロスを取出すことが経済的に望ましい。

培地の添加およびブロスの取出しは、許容可能な何れの技術によって行ってもよ い。例えば、培地の添加および／またはブロスの取出しは、ポンプ（例えば真空 ポンプ）、圧力、重力等を用いることによって達成することができる。

所望とあらば、連続製造における最適な経済性を得るために、何時でも、第二段 階発酵培地の組成または供給速度を調節し又は若干の変化を加えることができる 。また、使用する装置によっては、全体の平均ブロス容量が略一定のままである 限り、培地の添加および／またはブロスの取出しを間欠的に行うことが望ましい かもしれない。更に、第二段階の培地の添加は、第一段階の終了よりも早期に開 始することができる。しかし、既述の定常状態が達成されるまでは、第二段階を 開始することはできない。

第二段階の間、ナタマイシン、バイオマス（例えばストレプトマイセス細胞）お よび製造培地を含む発酵ブロスは連続的に取り出され、ナタマイシンはこの取り 出されたブロスからバイオマスとの混合物として回収され、および／またはナタ マイシン（例えば結晶形態で）として抽出される。ナタマイシンは、有用な形態 および量でナタマイシンを得る適切な技術によって回収することができる。ナタ マイシンがバイオマスと混合されているときは、所望とあらば、何れかの適切な 技術によってバイオイマスからナタマイシンを回収することができる。

連続的な定常状態の第二発酵段階は、主に汚染物の侵入または装置の不調のみに よって制限され、長時間に亘って持続され得る（例えば、本発明は少なくとも約 ４０日に亘って継続することができる）。

連続的なナタマイシン製造は、その中で発酵プロセスを実行し得る発酵容器内で 行われる。ナタマイシンの最大収量を達成するために重要な一つの因子は、水性 発酵培地の組成である。発酵培地は、適切な量の代謝性炭素および蛋白窒素を含 有していなければならない。また、該培地は、蛋白窒素源に通常存在する複合増 殖因子（例えばビタミン類）、無機元素（例えばカリウム、ナトリウム、カルシ ウム等）および微量元素（例えばホウ素、コバルト、鉄、銅、亜鉛等）を含有す るのが望ましい。

発酵のための適切な培地は水中（例えば低ミネラル含量のタップ水、蒸留水等） のものとして調製され、下記のａ）及びｂ）を含有する。

ａ）約８０〜２５０　ｇ／Ωの代謝性炭素源ｂ）少なくとも１５ｇ／ｇ、正規に は約２０ｇ／ｕ〜８０ｇ／Ωの蛋白および微量成分。蛋白窒素源は、非酵母蛋白 窒素成分および酵母蛋白窒素成分を含んでいてもよい。これら二つの蛋白窒素成 分は夫々、通常は約５：１〜１１：１の範囲の比率で存在し、最良の結果を得る ためには一般に約８＝１である。

これら代謝性炭素源および蛋白窒素源の量は、適切な供給源（ｓｏｕｒｃｅ）を 連続的且つ同等に添加することにより、第二段階の全体に亘って発酵培地中に連 続的に維持される。発酵培地中の特定の供給源の量は、取り出されたブロスをモ ニターし、適切な調節を行うことによって測定される。

蛋白窒素源は、広範な供給源から連続的に供給される。例えば、大豆蛋白製品（ 例えば単離物、粉末、引き割り等）は、非酵母蛋白窒素源を含有してもよい（例 えば望ましいナタマイシン収量は、８０−９５％の蛋白を含む大豆蛋白で得られ る）。

また、蛋白窒素は牛肉抽出物、蛋白の加水分解物（例えばペプトン）、および／ または酵母（例えば抽出物、自己消化物等）を含んでいてもよい。

上記で述べたように、製造培地はストレプトマイセス種によって代謝され得る炭 素源をも含有しなければならない。この炭素源は、グルコース、多糖類、コーン 澱粉、ポテト澱粉等のような何れかの好都合な形で供給され得る。

更に、本発明の一つの側面においては、ナタマイシン製造培地の出発成分として 、ナタマイシンの製造に必要とされる炭素源の全量を最初に導入する必要はない （例えば、炭素源の初期の量は発酵の完結に充分ではない）。本発明のこの側面 において、第一段階の間は、約５〜３０ｇ／Ω、通常は２０ｇ／Ωの炭素源量を 維持するように、ナタマイシンを製造しながら炭素源の添加が行われる。こうし て、最初には適切な量の適切な炭素源が発酵培地に添加され、発酵が開始された 後に再び添加される。第二段階の連続的なナタマイシン製造の間、炭素源は、ナ タマイシン製造培地の添加速度に比例した所定の速度で添加される。炭素源の添 加速度は、好ましくは、発酵槽から未消費の炭素源を除去することなく、連続的 かつ高速でのナタマイシン製造を維持する炭素源を与えるのに充分な速度である （例えば、炭素源の量は実質的に、発酵プロセスを維持するために必要な発酵培 地中の炭素源の量に等しい）。

本発明の他の側面においては、炭素源は製造培地の一部として添加することがで き、その場合の炭素源の添加速度は製造培地の添加速度によって決定される。

ストレプトマイセス発酵およびナタマイシン製造のための栄養素を提供するナタ マイシン産生培地は、通常の技術によって調製される（例えば、約１２０−１４ ０℃の温度で、炭素源および窒素源を別々に又は同時に滅菌する）。この製造培 地は、滅菌の後に望ましくは約７のｐＨを有する。本発明の一つの側面において は、発酵培地は発酵槽に導入する途中で滅菌してもよい。例えば、発酵槽へ連続 的に供給される発酵培地を、該発酵培地を滅菌できるようなパイプ、導管または 他の適切な手段（例えば連続滅菌器）に通せばよい。

製造培地の中に約０．１−１０容量％、通常は約２容量％の濃度が達成されるま で、接種物は発酵容器に導入される（例えば、この接種物の量は複数の連続発酵 槽に接種するために充分であり得る）。発酵槽の残りの容量には発酵培地が含ま れる。

接種物を発酵槽内の製造培地に導入するためには、接種物を活発な代謝状態で送 給するものであれば、何れの技術も許容され得る。

発酵培地または製造培地は、約２５℃〜４０℃、正規には２８℃〜３５℃の温度 にされる。

発酵の間、ナタマイシン製造培地に酸素が供給される。発酵の大部分の間、製造 培地中の溶存酸素を約２０％〜８０％空気飽和のレベルに維持するのが有利であ る。適切な溶存酸素レベルを達成する能力は、通気および／または撹拌速度を適 切に調製することによって向上する。例えば、発酵培地または製造培地は、通常 は発酵培地の容量当り約０．３〜少なくとも約１．０容量の空気の比率で、培地 を通して空気（例えば滅菌空気）を強制的に送ることによって通気される。本発 明の一つの側面においては、通気しながら発酵培地を撹拌するのが望ましい。更 に、この通気速度はまた、発酵培地を撹拌するのに充分であり得る。

次に、図２を参照すると、本発明の基本的な二つの段階の夫々について、時間と ナタマイシン産生速度との間の関係が示されている。第一段階には、成る程度の ナタマイシン産生を伴った、ストレプトマイセス種の増殖が含まれる。第二段階 でアルナタマイシンの連続製造は、培地添加とブＤ　ス取出しとの間に平衡が達 成されたときに確立される。第二段階は、ナタマイシンが最早有利なコストでは 製造されなくなるまで継続される（例えば、汚染によってプロセスは非効率的に なる）。

本発明の一つの側面において、発泡の制御が望ましいときは、発酵培地またはナ タマイシン製造培地の約０．０１〜１容量％の量で、泡立ち防止剤（例えばシリ コーン消泡剤）を発酵培地に添加するのが望ましい。

接種物を添加した後のナタマイシン製造培地は、約７．０のｐＨを有し、発酵の 間にｐＨは典型的には約４．５にまで徐々に低下する。このｐＨの低下は、スト レプトマイセス種の代謝活動の結果である。発酵ブロスの最終用途によっては、 発酵培地は低いｐＨを有するのが望ましい。しがし、所望とあらば、適時に塩基 性物質を添加することにより、ｐＨを上昇させ又は制御してもよい（例えば、所 定のｐＨを維持するために、水酸化カリウムを連続的または間欠的に発酵培地に 添加すればよい）。また、培地の組成および／または培地添加／ブロス取出しの 速度を変更することによっても、ｐＨを上昇または低下させることかできる。

本発明が適切に実施されるときは（例えば、ストレプトマイセス接種物の効果的 な取扱い、培地添加およびブロス取出しの調節）、得られた発酵ブロスには、正 規には少なくとも約４ｇ／ｆｌのナタマイシンが含まれる。ある場合、ナタマイ シン製造のレベルは、約７ｇ／ｆ）〜少なくとも１２ｇ／Ｉ）の範囲に亘り得る 。

以下、実施例によって本発明を例示するが、これら実施例は例示のみを意図する ものであり、可能な均等物の範囲を制限するものではない。他に特別に指定しな い限り、商業的に入手可能な試薬等級の材料が、以下の実施例を行なうために用 いられた。

実施例１ 以下の例において、次の一般組成の寒天領斜培養器が蒸留水中で調製された。滅 菌は約１２１°Ｃで約１５分間である。

・３ｇ／Ωの酵母抽出物 （Ｄｉｆｃｏ　”Ｂａｃｔｏ”酵母抽出物）・３ｇ／、１７の麦芽抽出物 （Ｄｉｌｃｏ麦芽抽出物） ・５ｇ／ｌのペプトン （Ｄｉｒｃｏ　’Ｂａｃｊｏ”ペプトン）・１０　ｇ／ｌのグルコース ・１５ｇ／Ωの寒天 次の一般組成の接種培地が蒸留水中で調製され、水酸化カリウムでｐＨ約７，０ に調節された。滅菌は約１２１’Ｃで約１５分であった。

・１５ｇ／Ωのグルコース ・１０ｇ／Ωの塩化ナトリウム ・６ｇ／Ωのコーンステイープ液 （ＰＰＭ、ｃｏｐｎ　５ｔｅｅｐ　Ｌｉｑｕｉｄ）・５ｇ／Ｄのペプトン （Ｄｉ［ｃｏ　ＢａＮｏ　”ペプトン）凍結乾燥された芽胞懸濁液としてＡＴＣ Ｃがら入手した、ストレプトマイセス・ギルボスポレウス（ＡＴＣＣ登録番号第 １３３２６号）が培養物源として用いられた。培養物は接種培地で増殖され、芽 胞形成のため、約２５℃で寒天傾斜培養器上に保持された。接種物の発育は、寒 天領斜培培地培養（ａｇａｒｓｌａｎｊ　ｃｕｒｕｒｅｓ）で開始された。

この接種物製造のための寒天領斜培養器では、約１０日以内に多くの芽胞が形成 された。約１０”ＣＦＵ／ｒｌ！の芽胞懸濁液濃度を得るために、これらの寒天 領斜培養器から、芽胞を接種培地中に削ぎ落とした。この芽胞懸濁液路２ｍｇを 、５００ｍｇノハッフル付フラスコ内に収容された約１００ｍｇの接種培地に添 加した。該培養物は、約２９℃で合計約４８時間、三段階でインキュベートされ 、ロータリー振盪器上において約２４Ｏｒｐｍで撹拌された。最初の二段階は夫 々１２時間であり、第三段階は約２４時間であった。第二段階および第三段階で は、先行段階からの約２容量％の培地が新鮮な培地に導入された。

こうして製造された最後の接種培養物は、製造培地を必要な接種濃度で接種する ために用いられた。

第一段階のナタマイシン製造培地は、次の一般的な初期組成を有していた。

・１９．５ｇ、Ｑの大豆蛋白単離物（ＡＤＭ、“Ｐ＋ｏｆａｍ″５９７０）φ　 ４．５ｇ／Ｄの酵母抽出物（Ｓｊｘｕｆｆｅｒ、　Ｔｙｐｅ　ＫＡＴ）・　０． ２ｍ／Ωの消泡剤（Ｍａｘｕ、　ＤＦ　２９８）１リットル発酵槽内で蒸留水中 の略６００ｍ１の培地を調製し、水酸化カリウムでｐＨを約７．６に調節した。

次いで、約１２１°Ｃで約１５分間、この１リットル発酵槽を滅菌した。これと は別に、グルコース（これも第一段階培地の一部である）を略５０％の蒸留水溶 液として滅菌し、約４０ｇ／Ωの濃度で初期培地に添加した。

接種を行なう前に、製造培地を約２９℃に加熱し、通気速度を約２００時間分に セットし、拡販速度を約５０Ｏｒｐｍにセットした。

次いで、ストレプトマイセス・ギルボスポレウス（ＡＴＣＣ登録番号第１３３２ ６号）を含む接種物を、製造培地容量の約２％で発酵槽に添加し、製造サイクル の第一段階を開始させた。発酵第一段階での約２０ｇ／Ωのグルコース濃度を維 持するために、接種後約４０時間の時点て、グルコースの添加を開始した。これ は、約１ｇ／Ω時間の速度で、グルコースを発酵容器に供給することによって行 なわれた。

接種（発酵の第一段階か開始された時点）の略７２時間の後に、ナタマイシンの 産生速度は低下し始めた。ブロスの濃度は約９．０ｇ／、＆であった。第二段階 培地が添加されると共に、約６００ｍｇの一定ブロス容量を維持するために、発 酵ブロスは約１２ｍｇ／時の速度で発酵槽から抜き取られた。この製造培地は、 略１９．５ｇ／ｎの大豆蛋白単離物と、４．５ｇ／Ωの酵母抽出物と、５０ｇ／ Ｉのグルコースと、０．２ｍρ／Ωの消泡剤とを含有していた。

上記の添加および抜き取りは約１２ｍΩ／時で続けられ、発酵は発酵第一段階の 開始後の約２００時間まで継続された。この期間の間のナタマイシン産生は中程 度に過ぎず、ブロス中のナタマイシン濃度は約４．５ｇ／Ωであった。この生成 物は抜き取られたブロスから回収された。

ナタマイシンの産生速度を増大するために、培地を次の一般組成に変更した：２ ６ｇ／Ωの大豆蛋白単離物、６ｇ／ｆｌの酵母抽出物と、８０ｇ／ｆｌのグルコ ースと、０．３ｍ！：ｌ／Ωの消泡剤。この富化された栄養培地の添加およびブ ロスの抜き取りを、略同じ速度で継続した。第一段階の開始から約２５０時間の 時点で、抜き取られたブロス中のナタマイシン濃度は約８．５ｇ／ｎの高収率に まで増大し、この濃度は発酵の残りの期間を通して略一定であった。約４５０時 間の時点で、プロセスは中止された。

実施例２ 第一段階の製造培地が２６．０ｇ／Ｆの大豆蛋白単離物と、６．０ｇ／ＩＩの酵 母抽出物と、０．３ｍρ／ｇの消泡剤とを含有することを除いて、実施例１と実 質的に同様にして、第一段階のプロセスが行なわれた。

第一段階の開始から約７０時間後に、ナタマイシン濃度は約６．０ｇ／Ωに達し 、第二段階である連続操作が開始された。

第二段階の培地組成は路次の通りである：２６．Ｏｇ／Ωの大豆蛋白単離物、６ ．０ｇ／［の酵母抽出物、８０　ｇ　＃のグルコース、０，３ｍΩ／ｇの消泡剤 。この培地は約１２ｍΩ／時の速度で添加され、発酵ブロスは約６００　ｒｒＪ の一定容量を維持するために抜き取られた。約１１７時間の時点で定常状態の平 衡が達成され、ナタマイシン濃度は約８．０ｇ／ｌであった。これは、約２５０ 時間（発酵を停止した時間）まで一定であった。

上記に詳述したのは少数の実施例にすぎないが、本発明には多くの組み合わせ及 び変形か含まれることを当業者は容易に理解できるであろう。

Ｆ工Ｇ、１ 国際調査報告 ，＋ｌｅｒｎ．ｌｉ。１１１＋１　Ａｅ＊．ｉゎｍｅａ　ＨａρＣＴ／ＵＳ　９ ２／０６４９９国際調査報告 ｔｈｉ＋＋＋ｐ＋ｌｋｌｌＩＭｕｎｉｔＩ＋＋ｉｌｙｍ＋ｍｈｅｒ＋Ｔ＃ｌＩｌ ｂ＋６ｌａｌｈｔＩｌｌｅｅｌｖａ＋ｕｍｐｈｎ１０１１１qｌｈ＠ＮｈＭｍｔ ｍｏｎｅ６ｌｎ＋＋＋ｎ＋＋ｌａｎＮｌ＃ＩＴｔｈｔｅｎｄ７１１１ｍ師ｂ＋ｒ ＋Ｎ＃ｊｌ＋ｏｎ１＝ｅｍｉＲｌｈ＃Ｉｗ６ｎ自ｎ一箇ｎｍ。ｌｌｋｅｆＤ＋’ む””３０／０９／９２Ｔｈｅｒ＋ｍ＋ｌＩＭＰ＋ｌ＋ｎｌａ山＋ｅＩｓｉｎ＋ ｅ＋Ｑｌｌ＋Ｍｅｌｅ＋ｌｈｅ＋Ｈ＋ｎｌ＋ｖｎｍ＋Ｎ＋ｈ＋ｒ１ｍｐｍｌｌｇ ｉｖ■獅hｅ＋ｔｈｅｐｕ＋ｐｅ＋ｗｅぜｌｎｅ＋ｍｍａｅフロントページの続 き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ ，ＲＵ、ＳＤ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．発酵によりナタマイシンを製造する方法であって、（ａ）前記発酵は少なく とも２段階の発酵であり、その第一段階には非定常状態での培養物増殖とナタマ イシン産生とが含まれ、該第一段階の間にブロス中での濃度が増大するようにナ タマイシンが産生される一方、その第二段階には定常状態の速度での培養物増殖 およびナタマイシン産生が含まれ、該第二段階の間は発酵ブロスに組成および容 量が実質的に一定であることと、 （ｂ）約２〜少なくとも約１６ｇ／ｌの蛋白窒素源および接種物調製の間の全炭 素の消耗を回避するのに充分な量の代謝性炭素源を含有する接種培地中に、ナタ マイシンを産生するストレプトマイセス株が含まれる接種物を利用し、該接種物 を、約０．１〜少なくとも約１０容量％の量で、第一段階の発酵培地に添加する ことと、 （ｃ）前記第一段階の発酵における培地として、少なくとも１５ｇ／ｌの蛋白窒 素源と、発酵培地中に約５〜少なくとも約４０ｇ／ｌの炭素源濃度を維持するの に充分な量の代謝性炭素源とを含有する発酵培地を利用することと、（ｄ）少な くとも約１５ｇ／ｌの蛋白窒素源と、ナタマイシン産生を維持できる畳の代謝性 炭素源とを含有した、高速でのナタマイシン産生を支持することができる第二段 階の発酵培地を、第一段階の発酵ブロス中に連続的に添加することと、 （ｅ）前記第二段階の培地を添加する間、培地添加量と発酵ブロスの取り出し量 とを等しくすることによって、発酵ブロスの組成および容量の定常状態を達成す ることと、（ｆ）取り出された発酵ブロスからナタマイシンを回収することとを 具備したナタマイシンの製造方法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、更に、前記発酵培地に通気することを具備 した方法。
3. ３．請求項１に記載の方法であって、更に、前記発酵培地を撹拌することを具備 した方法。
4. ４．請求項２に記載の方法であって、前記通気速度が、発酵培地を撹拌するため に充分な速度である方法。
5. ５．請求項１に記載の方法であって、更に、前記発酵培地をその供給の途中で滅 菌することを具備した方法。