CN117721160A - 通过流加营养液提高谷氨酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了通过流加营养液提高谷氨酸产量的方法，其包括如下步骤：在发酵过程中，流加含有葡萄糖的营养液。本发明降低了谷氨酸发酵中后期因高温导致菌体生长和活力抑制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及通过流加营养液提高谷氨酸产量的方法。
背景技术
氨基酸发酵条件的优化是一个复杂的过程，涉及大量的实验研究，是一个耗时、耗力、耗费的过程。谷氨酸生产中用到的大多是对温敏型生产菌，需要发酵过程中的关键影响因素(碳源、氮源、磷盐等)进行优化，确定较优的产酸条件，从而解决温度敏感型谷氨酸棒杆菌在发酵生产中出现的菌体生长缓慢，发酵后期活力减弱以及发酵周期长等问题，进而达到提高谷氨酸发酵菌体活力和产酸能力的目的。申请人在实际发酵生产工艺中发现，发酵中后期，发酵罐内部会产生大量热量，造成温度升高，最高可达到40℃以上。高温导致菌体增殖和活力受到抑制，如何解除这种抑制，提升发酵速率和单罐发酵产能，是我们需要解决的技术问题。CN202210790067.4是申请人之前的专利技术，通过优化发酵培养基组分，提高了谷氨酸发酵菌的耐高温性能，但是达到38.5℃以上后，菌株的增殖能力和产酸性能明显下降。因此，需要继续研究耐高温性能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供通过流加营养液提高谷氨酸产量的方法，进一步降低了谷氨酸发酵中后期因高温导致菌体生长和活力抑制。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
通过流加营养液提高谷氨酸产量的方法，其包括如下步骤：在发酵过程中，流加含有葡萄糖的营养液。
具体地，
所述方法包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液转入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃；待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度到38℃以上，直至发酵结束；通过流加含有葡萄糖的营养液维持发酵液中残糖的质量比为1％，直至发酵结束；发酵总时间为36h。
进一步地，
所述含有葡萄糖的营养液包括：葡萄糖、苹果酸钠和海藻酸钠，溶剂为水。优选地，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠10g/L，海藻酸钠6g/L，溶剂为水。
优选地，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠12g/L，海藻酸钠7g/L，溶剂为水。
优选地，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖700g/L，苹果酸钠11g/L，海藻酸钠5g/L，溶剂为水。
优选地，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖700g/L，苹果酸钠10g/L，海藻酸钠7g/L，溶剂为水。
优选地，所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L，溶剂为水。
附图说明
图1：不同营养液在三种高温条件下对发酵菌体浓度的影响；
图2：不同营养液在三种高温条件下对发酵液中谷氨酸含量的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠10g/L，海藻酸钠6g/L，溶剂为水。
实施例2
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠12g/L，海藻酸钠7g/L，溶剂为水。
实施例3
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖700g/L，苹果酸钠11g/L，海藻酸钠5g/L，溶剂为水。
实施例4
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖700g/L，苹果酸钠10g/L，海藻酸钠7g/L，溶剂为水。
对比例1
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖800g/L，溶剂为水。
对比例2
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠10g/L，溶剂为水。
对比例3
一种应用于谷氨酸发酵菌生产谷氨酸的营养液，其由如下组分组成：葡萄糖800g/L，海藻酸钠6g/L，溶剂为水。
实施例5
谷氨酸发酵菌的产酸工艺，其包括如下步骤：
菌体活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌GDK-9接种到斜面上传代活化，传代两次。
所述斜面培养基为蛋白胨5g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25g/L，甲硫氨酸0.2g/L，pH＝6.8；
种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养。
所述的种子培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4 5mg/L，FeSO4 5mg/L，苏氨酸1g/L，VH10 mg/L。
所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20％，pH通过氨水控制在7.0左右。
发酵培养：将谷氨酸棒杆菌GDK-9种子液(OD600＝20)按10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃。
高温培养：待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为38.5℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加含有葡萄糖的营养液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
实施例6
谷氨酸发酵菌的产酸工艺，其包括如下步骤：
菌体活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌GDK-9接种到斜面上传代活化，传代两次。
所述斜面培养基为蛋白胨5g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25g/L，甲硫氨酸0.2g/L，pH＝6.8；
种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养。
所述的种子培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4 5mg/L，FeSO4 5mg/L，苏氨酸1g/L，VH10 mg/L。
所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20％，pH通过氨水控制在7.0左右。
发酵培养：将谷氨酸棒杆菌GDK-9种子液(OD600＝20)按10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃。
高温培养：待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为39.5℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加含有葡萄糖的营养液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
实施例7
谷氨酸发酵菌的产酸工艺，其包括如下步骤：
菌体活化：将冷冻保藏的谷氨酸棒杆菌GDK-9接种到斜面上传代活化，传代两次。
所述斜面培养基为蛋白胨5g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25g/L，甲硫氨酸0.2g/L，pH＝6.8；
种子培养：将活化好的菌株用无菌水洗脱，洗脱后全部接种到配置好的种子培养基中进行种子培养。
所述的种子培养基为：葡萄糖40g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，MnSO4 5mg/L，FeSO4 5mg/L，苏氨酸1g/L，VH10 mg/L。
所述种子培养条件为：温度维持在32℃左右，溶氧控制在20％，pH通过氨水控制在7.0左右。
发酵培养：将谷氨酸棒杆菌GDK-9种子液(OD600＝20)按10％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃。
高温培养：待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度为40.5℃，直至发酵结束；整个发酵过程中，控制通风比1∶0.8，搅拌转速200rpm，溶氧维持在20％，流加含有葡萄糖的营养液维持残糖为1％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水调节发酵液的pH值至7.2，直至发酵结束；发酵总时间36h。
所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl 2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
实施例8
验证在实施例5(38.5℃)、实施例6(39.5℃)以及实施例7(40.5℃)的温度条件下，实施例1-4、对比例1-3的营养液对菌体浓度和发酵产酸量的影响。
如图1-2所示，随着温度的升高，实施例1-4、对比例1-3的菌体浓度和谷氨酸产量均有所下降，趋势较为一致，不同的是实施例1-4下降幅度较小，对比例1下降幅度最为明显，其次是对比例2-3。
具体到实施例5(38.5℃)，实施例1-4的营养液中均添加了一定量的苹果酸钠和海藻酸钠，菌体浓度和发酵产酸量差异均较小；对比例1仅添加了葡萄糖，菌体浓度和发酵产酸量明显低于实施例1-4。与实施例1比较，对比例1的菌体浓度和发酵产酸量分别下降了2％和10％，可见，在38.5℃的温度条件下，营养液组分对菌株的浓度影响明显小于发酵产酸量，可能原因是，该温度条件下，对菌株的生长增殖影响小，而对菌株产酸活力影响较大；对比例2-3在营养液中分别添加了苹果酸钠和海藻酸钠，菌体浓度和产酸量均较对比例1有一定幅度的提升。
随着发酵温度的提高，在实施例6(39.5℃)以及实施例7(40.5℃)的温度条件下，对比例1的菌体浓度和发酵产酸量下降更为明显。在40.5℃条件下，对比例1与实施例1相比较，菌体浓度和发酵产酸量分别下降了7.5％和19.7％，可见，在更高的温度条件下，对菌株的生长增殖产生了明显抑制，甚至可能导致了部分菌株的死亡，生长增殖和活力下降的双重影响导致发酵产酸量下滑更为明显。
具体到实施例7(40.5℃)的温度条件下，对比例2营养液中添加了苹果酸钠10g/L，对比例3添加了海藻酸钠6g/L，其分别较对比例1的发酵产量提高了16g/L和11g/L，而同时添加苹果酸钠10g/L和海藻酸钠6g/L的实施例1组，较对比例1提高了35g/L，增加幅度超过了对比例2-3之和，说明在40.5℃的高温发酵条件下，苹果酸钠和海藻酸钠协同使用的效果更好。
分析上述原因：增加细菌细胞膜中饱和脂肪酸的含量和提高细胞壁中相关糖蛋白的表达水平是细菌在各种胁迫环境下生产的重要因素，苹果酸钠可能是提高了谷氨酸棒杆菌GDK-9细胞膜中饱和脂肪酸的含量，从而提高耐热性能；而海藻酸钠可能的原因是促进了谷氨酸棒杆菌GDK-9荚膜相关糖蛋白的表达，从而提高耐高温性能。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (8)
1.通过流加营养液提高谷氨酸产量的方法，其包括如下步骤：在发酵过程中，流加含有葡萄糖的营养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌种子液转入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为32℃；待发酵液OD600＝30时，提高发酵温度到38℃以上，直至发酵结束；通过流加含有葡萄糖的营养液维持发酵液中残糖的质量比为1％，直至发酵结束；发酵总时间为36h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有葡萄糖的营养液包括：葡萄糖、苹果酸钠和海藻酸钠，溶剂为水。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠10g/L，海藻酸钠6g/L，溶剂为水。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖800g/L，苹果酸钠12g/L，海藻酸钠7g/L，溶剂为水。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖700g/L，苹果酸钠11g/L，海藻酸钠5g/L，溶剂为水。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有葡萄糖的营养液由如下组分组成：葡萄糖700g/L，苹果酸钠10g/L，海藻酸钠7g/L，溶剂为水。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖80g/L，乳糖5g/L，MnSO4·H2O 3mg/L，FeSO4·7H2O 3mg/L，MgSO4·7H2O 2g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KCl2g/L，VB110mg/L，生物素7μg/L，生物氮素2g/L，甲硫氨酸0.6g/L，吐温-80 0.2g/L。
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