CN113502308B - 一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素b12的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,该方法以好氧的维生素B12生产菌为发酵菌种进行好氧发酵;好氧发酵开始后,控制发酵液的ORP值处于50mv~75mv之间,直至发酵液中溶氧降低至30~50%,再控制发酵液的ORP值处于‑120mv~‑140mv之间,至发酵过程结束。本发明在发酵体系中引入氧化还原电位(ORP)电极的检测,利用pH值、供氧策略(搅拌转速和通气比)以及对发酵无抑制作用的氧化剂与还原剂对维生素B12的发酵过程进行多阶段ORP调控,以促进菌体生长和维生素B12合成的启动和积累,不仅提高了维生素B12的产量,还降低了原料葡萄糖和甜菜碱的消耗。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域,尤其涉及一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法。
背景技术
维生素B12,又名钴胺素,是目前发现的唯一一种含有金属元素的维生素,根据其中心钴离子结合配基基团的不同可形成不同类型的钴胺素,如羟基钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和氰钴胺素。
维生素B12可作为抗贫血药物,用于治疗恶性贫血和其它巨幼红细胞性贫血,也可以用于神经炎等的辅助治疗。此外,维生素B12作为饲料添加剂,也可以治疗VB12缺乏所引起的禽畜生长发育不良和贫血,提高饲料蛋白的利用率等。当前VB12年需求量65~70吨,市场广阔。
化学合成VB12的路线早在1974年便已打通,但其合成步骤长且繁琐,市场上现有的产品大都由生物转化法生产获得。发酵法生产VB12的菌株主要是以脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)和钴胺素根瘤菌(Rhizobium cobaiaminogenum)为代表的好氧菌株和以费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)与谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)为代表的厌氧菌株。
对于好氧菌而言,外部的供氧和营养与其生长和代谢的适配,决定了目标产物的合成情况。公布号为CN108949866A和公布号为CN108913738A的发明专利申请在发酵不同时期通过对搅拌速率、通气速率与发酵培养基组分的调节来提高VB12的合成。公布号为CN102399845A和公布号为CN102021214A的发明专利申请在发酵过程中对菌体的氧消耗速率(OUR)和二氧化碳生成速率(CER)进行多阶段调控,有效地促进了VB12的合成。公布号为CN110205350A的发明专利申请在发酵初期通过补加酵母浸粉稀释液,进而控制发酵初期氨基氮水平,有效的缓解了高浓度氨氮在VB12发酵中造成的菌体生长和生物合成的矛盾。公布号为CN102453740A的发明专利申请则根据糖蜜组分检测结果进行糖蜜模拟液的配制,进而解决VB12生产过程中糖蜜质量不稳定的现象。公布号为CN108913739A的发明专利申请描述了以甘蔗糖蜜和尿素控制发酵过程中的 pH为7,来达到促进VB12合成的目的。
氧化还原电位(ORP)作为发酵过程的重要控制参数,反映了菌体生长代谢过程中的氧化还原过程。对于发酵体系而言,ORP是温度、pH值、DO水平、培养基组分以及渗透压的综合反映。通过对ORP的调节可以实现对工业微生物的代谢流分布、电子流向及胞内NADH水平的调控。在好氧发酵过程中可以通过控制DO水平来控制ORP,此法在丙酮酸、柠檬酸、长链二元酸和L-赖氨酸等发酵体系已有应用。公布号为CN101624608A的发明专利申请公开了一种控制发酵体系中DO水平在20%,并通过添加外源电子受体铁氰化钾来提高初始ORP至400mv,使胞内NADH水平降低45.3%,加速糖酵解,丙酮酸含量由49.6g/L增加至61.9g/L。公布号为CN105755062A的发明专利申请通过调节搅拌转速和通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来实现两阶段ORP控制策略,长链二元酸的发酵产率较对照组(未控制ORP)提高4.6倍以上。对于厌氧体系而言,则可以通过氧化剂和还原剂的搭配使用来实现对ORP的控制,公告号为CN101182555B的发明专利公开了一种以氧化剂过氧化氢或铁氰化钾,还原剂二硫苏糖醇、胱氨酸、半胱氨酸、亚硫酸钠、维生素C、维生素E、H2、富马酸或NaHB4,调控发酵体系的ORP在-100mv~-600mv之间,结果表明在发酵过程中对ORP进行调控可实现丁二酸产量提高11.2%~34.6%,甲酸减少26.3%~45.8%,乙酸含量减少26.1%~42.9%,发酵时间缩短17.4%~27.3%。公告号为CN102296093A的发明专利根据生产菌株在目标产物生产过程中ORP变化的特性,组合使用氧化剂和还原剂对发酵体系的 ORP进行多阶段调节,对于丁醇产率及生产速率的提升有明显促进作用。
对于好氧型微生物而言,外部的供氧和营养与其生长和代谢的适配,决定了目标产物的合成情况。一般的好氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生,在这种情况下可以以溶氧 (DO)来表征供氧水平,但对于某些特殊的高耗氧菌株来说,供氧水平有限,发酵将长期处于氧限制状态,溶氧不能成为有效地控制指标,这就需要寻找其他控制参数来对发酵过程中菌体生长和代谢进行表征。此外,现有技术中尚没有通过调控氧化还原电位来提高维生素B12产量的报道。
目前,随着市场对维生素B12需求量的迅速增加,优化生产工艺、提高维生素B12的生产水平成为当务之急。本领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法,不仅需要提高维生素B12 的产量,也要最大程度的节约能耗、降低成本,提高生产效率,以满足市场的需求。
发明内容
本发明提供了一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,该方法通过调控发酵液的氧化还原电位来提高维生素B12的产量。
具体技术方案如下:
一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,包括:以好氧的维生素B12生产菌为发酵菌种进行好氧发酵;好氧发酵开始后,先控制发酵液的ORP值处于50mv~75mv之间,直至发酵液中溶氧降低至30%~50%,再控制发酵液的ORP值处于-120mv~-140mv之间,直至发酵过程结束。
进一步地,所述好氧的维生素B12生产菌为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCCNo.21299。发明人已将该菌株进行保藏,菌株名称为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)Nhu015-9,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.21299,保藏日期为2020 年12月04日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步地,通过调节pH值、搅拌转速和通气量中的一种以上操作手段来控制发酵液中ORP 值的高低;所述pH值的调控范围为6.5~7.5,搅拌转速的调控范围为50~500rpm,通气量的调控范围为0.1~5.0vvm。优选,pH值的调控范围为6.8~7.2,搅拌转速的调控范围为180~350rpm,通气量的调控范围为0.5~1.5vvm。
进一步地,通过向发酵液中添加氧化剂或还原剂来控制发酵液中ORP值的高低;所述氧化剂为硫酸铁或铁氰化钾,所述还原剂为胱氨酸、半胱氨酸、维生素C、维生素E和富马酸中的任意一种或至少两种的组合。
当实际ORP值高于设定值时,可通过提升pH值(最大不可超过7.5)或添加还原剂(胱氨酸、半胱氨酸、维生素C、维生素E和富马酸中的任意一种或至少两种的组合)进行调控。当实际ORP 值低于设定值时,可通过提升搅拌转速(最大不可超过500rpm)、增大通气比(最大不可超过 5.0vvm)或添加氧化剂(硫酸铁或铁氰化钾)进行调控。
进一步地,所述方法包括如下步骤:
(1)菌种活化:将菌种接种至斜面培养基中,进行活化培养,得到活化后的菌种;
(2)种液扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,进行扩大培养,得到扩培后的种液;
(3)好氧发酵:将扩培后的种液接种至发酵培养基中,进行好氧发酵,得到发酵培养液。
进一步地,步骤(1)中,所述斜面培养基为糖蜜50~70g/L,玉米浆20~40g/L,硫酸铵3~7 g/L,磷酸氢二铵3~7g/L,氯化钴0.5~2g/L,二甲基苯并咪唑(DMBI)0.2~0.7g/L,碳酸钙1~3g/L,硫酸锰0.5~2g/L,pH 6.8~7.5;活化培养的温度为25~37℃,活化培养的时间为12~36h。
进一步地,步骤(2)中,所述种子培养基为糖蜜50~70g/L,玉米浆20~40g/L,硫酸铵3~7 g/L,磷酸氢二铵3~7g/L,氯化钴0.5~2g/L,二甲基苯并咪唑(DMBI)0.2~0.7g/L,碳酸钙1~3 g/L,硫酸锰0.5~2g/L,pH 6.8~7.5;扩大培养的温度为25~35℃,扩大培养的时间为12~36h。
进一步地,步骤(3)中,种液接种至发酵培养基的接种量为0.5~15%;所述发酵培养基为麦芽糖70~90g/L,玉米浆40~50g/L,甜菜碱10~20g/L,硫酸铵0.5~2g/L,氯化钴0.05~0.08g/L,氧化镁0.3~0.7g/L,二甲基苯并咪唑(DMBI)0.03~0.07g/L,色氨酸0.05~0.1g/L,碳酸钙1~3g/L, pH 6.9~7.1。
进一步地,步骤(3)中,通过调节pH值、搅拌转速和通气量中的一种以上操作手段来控制发酵液中ORP值的高低;所述pH值的调控范围为6.5~7.5,搅拌转速的调控范围为50~500rpm,通气量的调控范围为0.1~5.0vvm。
进一步地,步骤(3)中,所述好氧发酵的压力为0.02~0.06Mpa,发酵时间为120~250h。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明在发酵体系中引入氧化还原电位(ORP)电极的检测,利用pH值、供氧策略(搅拌转速和通气比)以及对发酵无抑制作用的氧化剂与还原剂对维生素B12的发酵过程进行多阶段 ORP调控,以促进菌体生长和维生素B12合成的启动和积累,不仅提高了维生素B12的产量,还降低了原料(葡萄糖和甜菜碱)的消耗。
(2)本发明方法可有效降低单位能耗,极大的降低了生产成本,具有工艺控制简单、可操作性强、节约能源等特点,有利于进一步工业化放大及推广应用。
附图说明
图1为50L发酵罐未施加氧化还原电位调控的菌体代谢情况
其中,最高OD700为133.5,效价为195.40mg/L,DO%在发酵运行至17h时跌至3.3,而后趋于平稳,ORP为好氧发酵过程中的实际氧化还原电位值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述,以下列举的仅是本发明的具体实施例,但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1 50L发酵罐水平上未施加氧化还原电位调控的菌体代谢情况
本实例所用的菌种为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299。在本实施例中,通过以下方法来进行维生素B12的生产,具体包括以下步骤:
(1)菌种活化:将保藏的液氮管接种于斜面培养基中,于30℃培养24h,斜面培养基的配方(g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.0。
(2)种子扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于29℃培养12h,种子培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵,5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.2。
(3)发酵生产:将扩培后的种液以10%的接种比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中,温度控制32℃,pH7.2,压力在0.04Mpa,无菌空气的通气量1.0vvm,搅拌转速200rpm,当发酵液中总糖浓度下降至20g/L时开始补加补料葡萄糖培养基,控制发酵液中葡萄含量在10~15g/L,当甜菜碱浓度下降至6g/L时开始补加补料甜菜碱培养基,控制发酵液中甜菜碱6~10g/L,发酵运行200h完成。
其中,发酵培养基(g/L)为:麦芽糖80,玉米浆45,甜菜碱14,硫酸铵1,氯化钴0.075,氧化镁0.5,DMBI 0.05,硫酸锌0.08,碳酸钙2;
补料葡萄糖培养基(g/L)为:葡萄糖650;
补料甜菜碱培养基(g/L)为:甜菜碱550,DMBI 0.005,氯化钴0.01。
在该发酵条件下,粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299发酵生产维生素B12产量为195.40mg/L。ORP的数据检测图如图1所示。
实施例2氧化还原电位在发酵初期调控对发酵的影响
本实例所用的菌种为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299。在本实施例中,通过以下方法来进行维生素B12的生产,具体包括以下步骤:
(1)菌种活化:将保藏的液氮管接种于斜面培养基中,于30℃培养24h,斜面培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.0。
(2)种子扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于29℃培养12h,种子培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.2。
(3)发酵生产:将扩培后的种液以10%的接种比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中。初始发酵条件如下:温度控制32℃,pH7.2,压力在0.04Mpa,无菌空气的通气量1.0vvm,搅拌转速200rpm。然后调控pH(最大不超过7.5)、搅拌转速(最大不超过500rpm)和通气比(最大不超过5.0vvm),并结合氧化剂(硫酸铁)或还原剂(胱氨酸),将发酵初期(从好氧发酵培养开始时算)ORP分别控制在0mv,25mv,50mv,75mv或100mv;在发酵第二阶段,即溶氧降低至 50%时,不再对ORP进行调控,仅通过连续补料的方式控制发酵液中甜菜碱和葡萄糖含量分别在 5g/L和10g/L,培养180h。
其中,发酵培养基(g/L)为:麦芽糖80,玉米浆45,甜菜碱14,硫酸铵1,氯化钴0.075,氧化镁0.5,DMBI 0.05,硫酸锌0.08,碳酸钙2。
补料葡萄糖培养基(g/L)为:葡萄糖650。
补料甜菜碱培养基(g/L)为:甜菜碱550,DMBI 0.005,氯化钴0.01。
发酵结果如表1所示,在发酵初期将ORP控制在0mv,25mv,50mv,75mv或100mv左右时,维生素B12产量分别为153.51mg/L,162.10mg/L,254.39mg/L,221.89mg/L和177.78mg/L。
表1氧化还原电位的调控对发酵生产维生素B12的影响
实施例3氧化还原电位在发酵过程中的调控对发酵的影响
本实例所用的菌种为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299。在本实施例中,通过以下方法来进行维生素B12的生产,具体包括以下步骤:
(1)菌种活化:将保藏的液氮管接种于斜面培养基中,于30℃培养24h,斜面培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.0。
(2)种子扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于29℃培养12h,种子培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵,5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.2。
(3)发酵生产:将扩培后的种液以10%的接种比接种至装有30L发酵培养基的50L发酵罐中。初始发酵条件如下:温度控制32℃,pH7.2,压力在0.04Mpa,无菌空气的通气量1.0vvm,搅拌转速200rpm。然后,调控pH(最大不超过7.5)、搅拌转速(最大不超过500rpm)和通气比(最大不超过5.0vvm),并结合氧化剂(硫酸铁)或还原剂(维生素C),将发酵初期(从好氧发酵培养开始时算)ORP控制在50mv(具体见实施例2);在发酵第二阶段,即溶氧降低至50%时,逐渐控制ORP在-80mv,-100mv,-120mv,-140mv和-160mv左右,当ORP高于设定值时,逐渐提升pH值(最大不可超过7.5),当ORP低于设定值时逐渐提升搅拌转速(最大不可超过500rpm) 和通气比(最大不可超过5.0vvm),并结合氧化剂(硫酸铁)或还原剂(维生素C),同时通过连续补料的方式控制发酵液中甜菜碱和葡萄糖含量分别在5g/L和10g/L,培养180h。
发酵结果表明,发酵初期控制ORP在50mv,发酵第二阶段逐渐控制ORP在-80mv,-100mv, -120mv,-140mv和-160mv左右,维生素B12产量分别为201.11,235.33,277.39,271.89和167.18 mg/L。ORP(-120mv罐批)的数据检测图如表2所示。
表2氧化还原电位的调控对发酵生产维生素B12的影响
实施例4 5000L发酵罐水平未施加氧化还原电位调控的菌体代谢情况
本实例所用的菌种为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299。在本实施例中,通过以下方法来进行维生素B12的生产,具体包括以下步骤:
(1)菌种活化:将保藏的液氮管接种于斜面培养基中,于30℃培养24h,斜面培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.0。
(2)种子扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于29℃培养18h,种子培养基的配方 (g/L)为:糖蜜60,玉米浆30,硫酸铵5,磷酸氢二铵5,氯化钴1,DMBI 0.5,碳酸钙2,硫酸锰1,pH 7.2。
(3)发酵生产:将扩培后的种液以10%的接种比接种至装有3000L发酵培养基的5000L发酵罐中,温度控制32℃,pH7.2,压力在0.04Mpa,无菌空气的通气量1.0vvm,搅拌转速200rpm,当发酵液中总糖浓度下降至20g/L时开始补加补料葡萄糖培养基,控制发酵液中葡萄糖含量在 10~15g/L,当甜菜碱浓度下降至6g/L时开始补加补料甜菜碱培养基,控制发酵液中甜菜碱6~10g/L,发酵运行200h完成。
其中,发酵培养基(g/L)为:麦芽糖80,玉米浆45,甜菜碱14,硫酸铵1,氯化钴0.075,氧化镁0.5,DMBI 0.05,硫酸锌0.08,碳酸钙2;
补料葡萄糖培养基(g/L)为:葡萄糖650;
补料甜菜碱培养基(g/L)为:甜菜碱550,DMBI 0.005,氯化钴0.01。
在该发酵条件下,粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299发酵生产维生素B12产量为 177.20mg/L。
实施例5优化的控制策略在5000L发酵罐上的应用
本实例所用的菌种为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299,与实施例1不同之处在于,在5000L规模反应器上进行应用,具体步骤如下:
扩培后的种液以10%的接种比接种至反应器上后。初始发酵条件如下:温度控制32℃,pH7.2,压力在0.04Mpa,无菌空气的通气量1.0vvm,搅拌转速200rpm。然后,调控pH(最大不超过7.5)、搅拌转速(最大不超过500rpm)和通气比(最大不超过5.0vvm),并结合氧化剂(硫酸铁)或还原剂(维生素C),将发酵初期(从好氧发酵培养开始时算)ORP控制在50mv;在发酵第二阶段,即溶氧降低至50%时,逐渐控制ORP在-120mv,当实际ORP值高于设定值时,逐渐提升pH值(最大不可超过7.5),当实际ORP值低于设定值时逐渐提升搅拌转速(最大不可超过500rpm)和通气比(最大不可超过5.0vvm),并结合氧化剂(硫酸铁)或还原剂(维生素C),同时通过连续补料的方式控制发酵液中甜菜碱和葡萄糖含量分别在7g/L和20g/L,培养220h。
发酵结果表明,以ORP调控作为放大依据,可显著提升维生素B12的产量,降低其葡萄糖和甜菜碱单耗,具体结果见表3。
表3 ORP优化的控制策略在5000L发酵罐上的应用
Claims (9)
1.一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,包括:以好氧的维生素B12生产菌为发酵菌种进行好氧发酵;好氧发酵开始后,先控制发酵液的ORP值处于50mv~75mv之间,直至发酵液中溶氧降低至30%~50%,再控制发酵液的ORP值处于-120mv~-140mv之间,直至发酵过程结束;所述好氧的维生素B12生产菌为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)CGMCC No.21299,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.21299,保藏日期为2020年12月04日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,通过调节pH值、搅拌转速和通气量中的一种以上操作手段来控制发酵液中ORP值的高低;所述pH值的调控范围为6.5~7.5,搅拌转速的调控范围为50~500rpm,通气量的调控范围为0.1~5.0vvm。
3.如权利要求1所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,通过向发酵液中添加氧化剂或还原剂来控制发酵液中ORP值的高低;所述氧化剂为硫酸铁和/或铁氰化钾,所述还原剂为胱氨酸、半胱氨酸、维生素C、维生素E和富马酸中的任意一种或至少两种的组合。
4.如权利要求1所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)菌种活化:将菌种接种至斜面培养基中,进行活化培养,得到活化后的菌种;
(2)种液扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,进行扩大培养,得到扩培后的种液;
(3)好氧发酵:将扩培后的种液接种至发酵培养基中,进行好氧发酵,得到发酵培养液。
5.如权利要求4所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述斜面培养基为糖蜜50~70g/L,玉米浆20~40g/L,硫酸铵3~7g/L,磷酸氢二铵3~7g/L,氯化钴0.5~2g/L,二甲基苯并咪唑0.2~0.7g/L,碳酸钙1~3g/L,硫酸锰0.5~2g/L,pH 6.8~7.5;活化培养的温度为25~37℃,活化培养的时间为12~36h。
6.如权利要求4所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述种子培养基为糖蜜50~70g/L,玉米浆20~40g/L,硫酸铵3~7g/L,磷酸氢二铵3~7g/L,氯化钴0.5~2g/L,二甲基苯并咪唑0.2~0.7g/L,碳酸钙1~3g/L,硫酸锰0.5~2g/L,pH 6.8~7.5;扩大培养的温度为25~35℃,扩大培养的时间为12~36h。
7.如权利要求4所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,步骤(3)中,种液接种至发酵培养基的接种量为0.5~15%;所述发酵培养基为麦芽糖70~90g/L,玉米浆40~50g/L,甜菜碱10~20g/L,硫酸铵0.5~2g/L,氯化钴0.05~0.08g/L,氧化镁0.3~0.7g/L,二甲基苯并咪唑0.03~0.07g/L,色氨酸0.05~0.1g/L,碳酸钙1~3g/L,pH 6.9~7.1。
8.如权利要求4所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,步骤(3)中,通过调节pH值、搅拌转速和通气量中的一种以上操作手段来控制发酵液中ORP值的高低;所述pH值的调控范围为6.5~7.5,搅拌转速的调控范围为50~500rpm,通气量的调控范围为0.1~5.0vvm。
9.如权利要求4所述的基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素B12的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述好氧发酵的压力为0.02~0.06Mpa,发酵时间为120~250h。
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