CN114990002B - 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114990002B
CN114990002B CN202210373314.0A CN202210373314A CN114990002B CN 114990002 B CN114990002 B CN 114990002B CN 202210373314 A CN202210373314 A CN 202210373314A CN 114990002 B CN114990002 B CN 114990002B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
pantothenic acid
medium
controlling
beta
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210373314.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114990002A (zh
Inventor
柳志强
刘翠翠
马张驰
张博
杜军
马石金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Hongshi Biotechnology Co ltd
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Hangzhou Hongshi Biotechnology Co ltd
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Hongshi Biotechnology Co ltd, Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Hangzhou Hongshi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210373314.0A priority Critical patent/CN114990002B/zh
Publication of CN114990002A publication Critical patent/CN114990002A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114990002B publication Critical patent/CN114990002B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于生产D‑泛酸的发酵培养基以及利用该发酵培养基发酵生产D‑泛酸的方法。所述发酵培养基组成包括：葡萄糖，硫酸铵，酵母提取物，胰蛋白胨，磷酸二氢钾，七水硫酸镁，β‑丙氨酸，VB12，VB1，盐溶液，异亮氨酸，异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷，硫酸卡那霉素，溶剂为水。本发明通过优化培养基组成及发酵参数，能有效提高菌体的生物量，大幅缩短泛酸积累地时间，通过变温控制能够有效改善菌体合成泛酸产量，发酵工艺便于控制，采用pH与补料联控，工艺简单，有利于后期实现工业大规模化生产。

Description

一种用于生产D-泛酸的发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明涉及一种用于生产D-泛酸的发酵培养基以及利用该发酵培养基发酵生产D-泛酸的方法。
背景技术
D-泛酸（DPA）又称维生素B5，是一种普遍存在于生物体体内的必需酸性物质。它也是辅酶a生物合成的重要前体，对生物的生长有重要的促进作用。近年来，DPA因其有良好的市场前景和价值，逐渐在食品、饲料、化妆品和制药等行业得到发展和应用。
D-泛酸的合成方法有三种：化学合成法、酶法和生物发酵法。目前，生产D-泛酸的化学合成方法较为成熟，并已在工业上得到广泛应用，其中D-泛酸钙是最终产品。如今，泛酸的工业生产仍然利用化学合成方法。酶法是选择性水解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯或D-泛解酸内酯，以得到单一的D-泛解酸内酯。饲料级DPA是通过在甲醇或乙醇环境中加热DPA的两种前体(D-泛解酸内酯和β-丙氨酸)获得的。化学合成过程有许多局限性，比如，氢氰酸和氰化钠造成严重的环境污染和人类危害。由于日益严重的环境污染问题和日益增长的环境意识，已经开始试验使用微生物发酵工艺生产DPA。
D-泛酸在微生物体内合成，由α-酮异戊酸和L-天冬氨酸两种物质经过四步酶促反应生成。四步反应中关键酶酮泛解酸羟甲基转移酶(PanB)、酮泛解酸还原酶(PanE)、L-天冬氨酸-α-脱羧酶（PanD）、泛酸合成酶(PanC)。PanB最适pH在7.0到7.6之间，最适温度在37℃。PanE 最适pH为7.5，最适温度为25℃。PanD最适温度为37℃，最适pH为7.0。PanC最适pH值为10.0，最适温度为30℃。
直接发酵法是在含有葡萄糖的培养基中，通过微生物菌体代谢β-丙氨酸产生D-泛酸；D-泛酸通过微生物发酵法主要是针对菌种以及培养基进行优化，鲜有对其发酵条件进行系统考察。
发明内容
本发明的目的本发明是针对现有工艺技术中存在大肠杆菌生长慢，且D-泛酸产量较低的问题，提供一种用。于生产D-泛酸的发酵培养基以及利用该发酵培养基发酵生产D-泛酸的方法
本发明采用的技术方案是：
一种用于生产D-泛酸的发酵培养基，组成如下：葡萄糖10~30g/L，硫酸铵5~20g/L，酵母粉1~8 g/L，胰蛋白胨1~8g/L，磷酸二氢钾0.5~2.0 g/L，七水硫酸镁0.1~1.0 g/L，β-丙氨酸 0.5~2 g/L，VB12 0.001~0.005 g/L，VB1 0.001~0.01 g/L，盐溶液0.5~2 mL/L，异亮氨酸80~200 mg/ L，诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48~96 mg/L，抗生素硫酸卡那霉素0~100 mg/L（优选30~60 mg/L），溶剂为水；所述盐溶液组成如下：NiCl2·7H2O 0.02 g/L，CuCl2 10 g/L，FeSO4·7H2O 10 g/L，ZnSO4·7H2O 10 g/L，CuSO4 0.2 g/L，溶剂为水。
优选的，所述培养基组成如下：葡萄糖18~22g/L，硫酸铵5~15 g/L，酵母粉1~8 g/L，胰蛋白胨3~6 g/L，磷酸二氢钾0.6~0.8 g/L，七水硫酸镁0.4~0.6 g/L，β-丙氨酸 1.2~2g/L，VB12 0.002 g/L，VB1 0.005 g/L，盐溶液0.5~2 mL/L，异亮氨酸80~200 mg/ L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L，硫酸卡那霉素50 mg/L，溶剂为水。
本发明对发酵培养基配方进行了改进，有效缩短了泛酸产量达到40 g/L的时间。
本发明还涉及利用所述发酵培养基发酵生产D-泛酸的方法，所述方法包括：
（1）将菌株活化后进行种子培养，得到种子液；
（2）将种子液接种至发酵培养基，发酵时搅拌初始转速300~500 r/ min；通过搅拌和通风控制溶氧在15%~25% ；通过流加氨水控制pH在6.8~7.2；培养温度26.0℃~37℃；补料在pH>6.81时开始流加补料培养基，直至发酵结束。
所述补料培养基组成如下：葡萄糖500 g/L，硫酸铵10 g/L，酵母粉1~8 g/L，胰蛋白胨1~8 g/L，磷酸二氢钾14 g/L，七水硫酸镁16 g/L，β-丙氨酸40 g/L，VBl 0.01 g/ L，VB12 0.004 g/L，异亮氨酸160 mg/L，盐溶液2 mL/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 48 mg/L，硫酸卡那霉素100 mg/L。
所述活化培养基组成如下：蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.8~7.0。
所述种子培养基组成如下：蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.8~7.0。
发酵过程温度控制如下：发酵0~12 h，控制温度37℃；发酵12~36 h，控制温度30℃；发酵36~48 h，控制温度28℃；发酵48h直至发酵结束，控制温度26℃。
发酵过程pH控制如下：发酵0~36h，控制pH7.2；发酵36~48 h，控制pH6.8；发酵48h直至发酵结束，控制pH6.5。
本发明通过增加有机氮源的量补加菌体生长的营养物质，减少铵盐的量，减少NH4+对菌株生长的抑制，菌体生长阶段将温度由原来的30℃改为37℃，有效提高菌体生长速率。大肠杆菌耗氧量高，将搅拌与溶氧联控，有效控制在15%-25%，及时补充溶氧不足。补料与pH联控有效避免糖补加过量。连续变温降温，有利于酶的正确表达折叠，更加有利于酶的最适温度，促使泛酸高效合成。
本发明的有益效果主要体现在：本发明通过优化培养基组成及发酵发酵，能有效提高菌体的生物量，大幅缩短泛酸积累地时间，通过变温控制能够有效改善菌体合成泛酸产量，发酵工艺便于控制，采用pH与补料联控，工艺简单，有利于后期实现工业大规模化生产。
附图说明
图1为不同硫酸卡那霉素添加量下OD值和泛酸产量；
图2为不同异亮氨酸添加量下OD值和泛酸产量；
图3为不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷添加量下OD值和泛酸产量；
图4为在不同氮源培养基下OD值和泛酸产量；
图5为实施例14和实施例16发酵过程泛酸和生物OD值对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，该菌株详见前期的专利申请：公开号为“CN113637618A”、发明名称为“一种D-泛酸生产菌、构建方法及应用 ”。从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度30℃，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，pH控制6.8，手动调整转速和通气量，维持溶氧在15%~25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
初始发酵培养基：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉2 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水硫酸镁1 g/L，β-丙氨酸 1.5 g/L，VB12 0.002 g/L，VB1 0.005 g/L，盐溶液1 mL/L，异亮氨酸160 mg/ L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L，硫酸卡那霉素50 mg/L。
初始补料培养基：葡萄糖500 g/L，硫酸铵10 g/L，酵母粉2 g/L，磷酸二氢钾14 g/L，七水硫酸镁16 g/L，β-丙氨酸40 g/L，VBl 0.01 g/ L，VB12 0.004 g/L，异亮氨酸160 mg/L，盐溶液2 mL/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L，硫酸卡那霉素100 mg/L。
上述盐溶液配方为：NiCl2·7H2O 0.02 g/L，CuCl2 10 g/L，FeSO4·7H2O 10 g/L，ZnSO4·7H2O 10 g/L，CuSO4 0.2 g/L（下文中盐溶液均为该配方）。
发酵84 h结束，OD值52.8，泛酸产量为17.8 g/L。
实施例2：
以案例1中原始发酵培养基为基础，单因素考察硫酸卡那霉素不同添加量对Escherichia coli DPA11A合成D-泛酸和生物生长的影响，硫酸卡那霉素添加量分别为：0mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。
从保藏的工作库中将Escherichia coli DPA11A菌液接入到试管培养基活化后12h，得到活化的种子液。以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶（装液量50 mL/250 mL）培养，37 ℃，180 r/min摇床培养12 h，获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基，30 ℃ ，150 rpm，培养48 h，进行取样离心，测量OD值及泛酸含量。
硫酸卡那霉素添加量考察如附图1所示，摇瓶结果显示，不添加硫酸卡那霉素，菌株表达合成D-泛酸不受影响，添加量依次增加至200 mg/L，对泛酸合成促进作用没有很明显，生物量OD值都在6~7之间变化。硫酸卡那霉素的作用一是防止菌体在传代过程中质粒丢失，二是在发酵过程中，防止其他菌体污染，所以在试验在0~200 mg/L对泛酸和生长影响不是很大。
实施例3：
以案例1中原始发酵培养基为基础，考察异亮氨酸不同添加量对Escherichiacoli DPA11A合成D-泛酸和生物生长的影响，添加量分别为：0 mg/L、160 mg/L、320 mg/L、640 mg/L。
实验流程：从保藏的工作库中将Escherichia coli DPA11A菌液接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶（装液量50mL/250 mL）培养，37 ℃，180 r/min摇床培养12 h，获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基，30 ℃ ，150 rpm，培养48 h，进行取样离心，测量OD值及泛酸含量。
异亮氨酸添加量考察如附图2所示，结果显示不添加异亮氨酸的批次菌体的生物量OD值明显低于添加异亮氨酸的，随着异亮氨酸添加量增加，生物量变化不是很大。不添加异亮氨酸的批次D-泛酸产量最高，随着异亮氨酸添加增加，D-泛酸依次减少。所以异亮氨酸添加量控制在0～320 mg/L较好，太低不利于菌体生长，太高又会反馈抑制泛酸合成。
实施例4：
以案例1中原始发酵培养基为基础，考察异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对Escherichia coli DPA11A合成D-泛酸和生物生长的影响，添加量分别为：0 mg/L、48 mg/L、96 mg/L。
从保藏的工作库中将Escherichia coli DPA11A菌液接入到试管培养基活化后12h，得到活化的种子液。以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶（装液量50 mL/250 mL）培养，37 ℃，180 r/min摇床培养12 h，获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基，30 ℃ ，150 rpm，培养48 h，进行取样离心，测量OD值及泛酸含量。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）不同添加量对D-泛酸合成和菌株生长的影响如附图3所示，不添加诱导剂IPTG，D-泛酸不表达。添加48 mg/L IPTG 泛酸表达，增加至96mg/L时，生物量和泛酸有微弱下降。
实施例5：
氮源单因素优化过程中，以实施例1中不含氮源的简单复合原始发酵培养基（不含氮源，其他组分同实施例1）的基础上，以2%的添加量考察不同有机氮源或无机氮源：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸铵、氯化铵、玉米浆，筛选最佳用以生长和合成泛酸的氮源。
实验室保藏菌株Escherichia coli DPA11A种子液，以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶（装液量50 mL/250 mL）培养，37 ℃，180 r/min摇床培养12 h，获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基，30 ℃ ，150 rpm，培养48 h，进行取样离心，测量OD值及泛酸含量。
氮源种类考察结果如附图4所示，摇瓶结果显示合成泛酸产量大小依次为：硫酸铵> 酵母粉 > 胰蛋白胨 > 尿素 > 玉米浆 > 大豆蛋白胨 > 氯化铵。氮源对菌体生长OD值大小影响为：酵母粉>胰蛋白胨 >玉米浆> 大豆蛋白胨> 硫酸铵> 尿素>= 氯化铵。
从上述的结果中发现，硫酸铵是所有的氮源中对Escherichia coli DPA11A合成泛酸最有利。对于菌株生长有利有机氮源都优于无机氮源，但是泛酸产量相对较低。为了促进菌体产生更多的泛酸，首先要使菌体的生物量增加，保证足够多的“微生物工厂”产生泛酸，因此在后期选取较优的酵母粉和胰蛋白胨作为考察对象。
实施例6：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度30℃，pH 6.8，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，维持溶氧在15%-25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水硫酸镁1 g/L，β-丙氨酸 1.5 g/L，异亮氨酸0.04 g/L，VB12 0.002 g/L，VB1 0.005 g/L，盐溶液1 mL/L，异亮氨酸80~200 mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L，硫酸卡那霉素50 mg/L；
补料培养基：葡萄糖500 g/L，硫酸铵10 g/L，酵母粉2 g/L，胰蛋白胨2 g/L，磷酸二氢钾14 g/L，七水硫酸镁16 g/L，β-丙氨酸40 g/L，VBl 0.01 g/ L，VB12 0.004 g/L，异亮氨酸160 m g/L，盐溶液2 mL/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L，硫酸卡那霉素100mg/L；
发酵84 h结束，OD值51.24，泛酸产量为23.90 g/L。
实施例7：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度33℃，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到5 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值71.4，泛酸产量为12.76 g/L。
实施例8：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度35℃，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到5 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值111.45，泛酸产量为16.95 g/L。
实施例9：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度37℃，pH 6.8，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%~25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值106.95，泛酸产量为19.82 g/L。
实施例10：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度30℃，pH 7.0，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>7.01开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值67.3，泛酸产量为29.32 g/L。
实施例11：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度30℃，pH 7.2，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值145.8，泛酸产量为14.99 g/L。
实施例12：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度37℃，pH 7.2，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值75.60，泛酸产量为31.18 g/L。
实施例13：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度37℃，pH 7.2，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控，14h降温30℃。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值93.80，泛酸产量为39.86 g/L。
实施例14：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度37℃，pH 7.2，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控，14h降温30℃，36 h降温28℃，48 h降温26℃。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值107.1，泛酸产量为42.27 g/L。
实施例15：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，初始培养温度37℃，pH 7.2，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%；pH>7.21开始补料与pH联控。控制策略：14h降温30℃；36h降温28℃，pH调至6.8 ，pH>6.81补料联控；48h降温26℃，pH调至6.5，pH>6.51补料联控。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：与实施例6相同；
补料培养基：与实施例6相同；
发酵84 h结束，OD值126.6，泛酸产量为28.39 g/L。
实施例16：
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建，从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h，得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基（装液量100 mL/500 mL），37℃，150 rpm，培养9-10 h，再以10%接种到发酵罐。
发酵培养：接种量10%，发酵罐装液量1 L/2 L，培养温度37℃，pH 7.2，初始转速300 rpm，初始通气量2 L/min，搅拌溶氧联控，适当提高通气量，最大到4 L/min，维持溶氧在15%-25%；pH>7.21开始补料与pH联控。控制策略：F3培养条件37℃，pH7.2，12h降温30℃，36h降温28℃，48h降温26℃。
发酵84h结束后，用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基：葡萄糖20 g/L，硫酸铵16 g/L，酵母粉10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水硫酸镁1 g/L，β-丙氨酸 1.5 g/L，异亮氨酸0.04 g/L，VB12 0.002 g/L，VB1 0.005 g/L，盐溶液1 mL/L，异亮氨酸40 mg/ L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L，硫酸卡那霉素50 mg/L；
补料培养基：葡萄糖500 g/L，硫酸铵10 g/L，酵母粉5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，磷酸二氢钾14 g/L，七水硫酸镁16 g/L，β-丙氨酸40 g/L，VBl 0.01 g/ L，VB12 0.004 g/L，异亮氨酸0.16 g/L，盐溶液2 mL/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L，硫酸卡那霉素100mg/L；
发酵84 h结束，OD值102，泛酸产量为48.54 g/L。
将实施例1、6~12数据进行对比，结果如下表1所示：
表1：2L发酵罐实施例数据对比
备注：实施例1所用培养基及发酵条件为最初的工艺，实施例6~16为逐步改进工艺。
实施例6与实施例1相比，增加一定的有机氮源有利于D-泛酸合成，泛酸提高了44.4%。
在实施例6的基础上，考察温度对菌体生长及泛酸合成影响，结合实施例7、8、9发现温度越高，越利于菌体生长，相对的泛酸合成会随之下降；考察pH对菌体生长及泛酸合成影响，结合实施例10、11发现pH增大，有利于菌体生长，但是对合成泛酸不利。结合泛酸合成过程相关酶的特性，设计实施例12，将温度37℃和pH7.2结合，泛酸合成达到31.18 g/L，突破30 g/L。
大肠杆菌因为原核生物，37℃发酵培养，虽利于生长，但不利于表达酶的正确折叠，易形成包涵体，因此，在保证生长的前提下，通过阶段性降温减缓生长速率有利于泛酸合成。以实施例13发酵工艺控制，泛酸合成达到39.86 g/L。以实施例14工艺进一步降温，泛酸产量达到42.27 g/L，突破40 g/L。
后一步继续提高有机氮源含量，适当降低NH4+的量，有效补充生长所需的营养物质，减少NH4+对菌体生长的抑制。以实施例16为例，泛酸产量达到48.54 g/L。改进后培养基可以提前一天实验产量在40g/L，生长较快，产量较之前有一定提高，提高了10.59%，如附图1所示。

Claims (3)

1.一种发酵生产D-泛酸的方法，所述方法包括：
（1）将菌株活化后进行种子培养，得到种子液；
（2）将种子液接种至发酵培养基，发酵时搅拌初始转速300~500 r/ min；通过搅拌和通风控制溶氧在15%~25% ；通过流加氨水控制pH；培养温度26.0℃~37℃；补料在pH>6.81时开始流加补料培养基，直至发酵结束；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖18~22g/L，硫酸铵5~15 g/L，酵母粉1~8 g/L，胰蛋白胨3~6 g/L，磷酸二氢钾0.6~0.8 g/L，七水硫酸镁0.4~0.6g/L，β-丙氨酸 1.2~2 g/L，VB12 0.002 g/L，VB1 0.005 g/L，盐溶液0.5~2 mL/L，异亮氨酸80~200 mg/ L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L，硫酸卡那霉素50 mg/L，溶剂为水；所述补料培养基组成如下：葡萄糖500 g/L，硫酸铵10 g/L，酵母粉1~8 g/L，胰蛋白胨1~8 g/L，磷酸二氢钾14 g/L，七水硫酸镁16 g/L，β-丙氨酸40 g/L，VBl 0.01 g/ L，VB12 0.004 g/L，异亮氨酸160 mg/L，盐溶液2 mL/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L，硫酸卡那霉素100mg/L；
发酵过程温度控制如下：发酵0~12 h，控制温度37℃；发酵12~36 h，控制温度30℃；发酵36~48 h，控制温度28℃；发酵48h直至发酵结束，控制温度26℃；
发酵过程pH控制如下：发酵0~36h，控制pH7.2；发酵36~48 h，控制pH6.8；发酵48h直至发酵结束，控制pH6.5。
2.如权利所述要求1所述的方法，其特征在于所述活化培养基组成如下：蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.8~7.0。
3.如权利所述要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基组成如下：蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.8~7.0。
CN202210373314.0A 2022-04-11 2022-04-11 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法 Active CN114990002B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210373314.0A CN114990002B (zh) 2022-04-11 2022-04-11 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210373314.0A CN114990002B (zh) 2022-04-11 2022-04-11 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114990002A CN114990002A (zh) 2022-09-02
CN114990002B true CN114990002B (zh) 2023-10-20

Family

ID=83023573

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210373314.0A Active CN114990002B (zh) 2022-04-11 2022-04-11 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114990002B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747268B (zh) * 2022-11-28 2024-03-26 黑龙江新和成生物科技有限公司 D-泛酸的发酵方法
CN117327747B (zh) * 2023-12-01 2024-05-03 内蒙古金达威药业有限公司 采用微生物发酵生产d-泛酸的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624513A (zh) * 2018-06-15 2018-10-09 成都本则生科技有限公司 一种高密度培养d-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法及应用
CN112126662A (zh) * 2020-09-24 2020-12-25 浙江工业大学 一种发酵生产d-泛酸的方法
CN112195143A (zh) * 2020-09-24 2021-01-08 浙江工业大学 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624513A (zh) * 2018-06-15 2018-10-09 成都本则生科技有限公司 一种高密度培养d-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法及应用
CN112126662A (zh) * 2020-09-24 2020-12-25 浙江工业大学 一种发酵生产d-泛酸的方法
CN112195143A (zh) * 2020-09-24 2021-01-08 浙江工业大学 一种用于发酵法生产d-泛酸的菌株及发酵法生产d-泛酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114990002A (zh) 2022-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114990002B (zh) 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法
CN102517239B (zh) 具有提高的l-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产l-缬氨酸的方法
KR102015829B1 (ko) 온라인 산소 소비율과 전도율의 통합 제어를 기반으로 한 코엔자임 q10 발효 생산 공정
CN109082448B (zh) 一种大肠杆菌及其在发酵生产1,5-戊二胺中的应用
JPS6143996B2 (zh)
CN102604904B (zh) 一种葡萄糖脱氢酶的生产方法
CN100467607C (zh) 一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的方法
CN112322673B (zh) 一种谷氨酸的发酵方法
CN109536542A (zh) 1,5-戊二胺的制备方法
DK180437B1 (en) Method for Fermentative Production of Oxidized Coenzyme Q10 and High-content Oxidized Coenzyme Q10 Prepared therefrom
CN103525881B (zh) 用于20m3大罐发酵培养大肠埃希氏菌再转化富马酸生产L-天冬氨酸的方法
CN112501221A (zh) 一种提高苏氨酸糖酸转化率的方法
Asun et al. Production of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Bacillus subtilis BBEL02 fermentation using nitrogen-rich industrial wastes as crude feedstocks
FI71766C (fi) Framstaellning av etanol genom hoegeffektiv bakteriejaesning.
CN113502308B (zh) 一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素b12的方法
CN102747114A (zh) 一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法
CN110885774A (zh) 一种优化谷氨酸发酵的方法
US10774350B2 (en) Method for fermentative production of oxidized coenzyme Q10
CN115637276B (zh) 采用盐单胞菌株生产四氢嘧啶的方法
CN110468051A (zh) 一种k252a发酵培养基及其制备方法
CN101319235B (zh) 一种添加葡萄糖酸钠提高发酵法生产丙酮酸产量的方法
CN117987485A (zh) 一种发酵生产l-苏氨酸的方法、培养基及其应用
CN117625706A (zh) 一种提高l-脯氨酸发酵产量的方法
CN117844706A (zh) 麦角硫因生产菌发酵培养基
JP6391956B2 (ja) ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant