CN109536542A - 1,5-戊二胺的制备方法 - Google Patents

1,5-戊二胺的制备方法 Download PDF

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李乃强
于丽珺
周豪宏
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Abstract

本发明涉及一种1,5‑戊二胺的制备方法。该方法在赖氨酸发酵过程中接入含有赖氨酸脱羧酶菌株的种子液，进行混合发酵，适于产业化生产1,5‑戊二胺。本发明尽可能减少戊二胺对微生物毒性从而造成对发酵不利的影响，同时使得后续的工艺更简化，具有一定的商业化价值。

Description

1,5-戊二胺的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及1,5-戊二胺的制备方法。
背景技术
1,5-二氨基戊烷(也称为1,5-戊二胺，简称戊二胺)是化学工业中重要的5 碳平台化合物，主要用途是制造聚酰胺、聚氨酯等，另外还可以用来制造异 氰酸酯、吡啶、哌啶等重要化工原料。
利用生物法合成戊二胺的方法主要有两种。一种是微生物利用葡萄 糖通过复杂的代谢调控，合成戊二胺。这种方法代谢调控复杂，并且戊 二胺对微生物具有毒性，影响生产效率。2007年Takashi等报道了通过对 具有较高赖氨酸合成能力的谷氨酸棒杆菌进行赖氨酸脱羧酶过量表达， 使菌体直接在发酵过程中生产戊二胺，产量为2.9g/l，戊二胺对葡萄糖摩 尔转化率为9.1％。在提高戊二胺产量研究中，研究人员尝试使用了具有 过量表达宿主同源的赖氨酸脱羧酶(cadA)质粒的大肠杆菌菌株(见专 利JP2002-223770，JP2008104453A等)。赢创德固赛在申请号为 200810005332.3的专利中采用过量表达赖氨酸脱羧酶的产赖氨酸谷氨酸 棒杆菌发酵生产戊二胺，戊二胺在培养液上清中含量约为3.4g/L。综上所 述，由微生物经过葡萄糖直接发酵生产戊二胺，代谢调控复杂，发酵周 期长，且戊二胺对微生物毒性大，效率低，需要做的工作还有很多。
生物法制备戊二胺的另外途径是利用赖氨酸脱羧酶对赖氨酸或其盐 进行生物催化，脱羧生产戊二胺见JP2002-223771、JP2004-000114、 EP1482055、JP2005-060447等)。例如，三菱化学株式会社在申请号为 200880001874.1中采用过量表达了cadA的大肠杆菌催化赖氨酸己二酸盐。 之后三菱化学株式会社在申请号为200980121108.3中采用赖氨酸碳酸盐 为底物进行催化生产戊二胺。三井化学株式会社在申请号为 201180010677.8的专利申请中将表达cadA的菌株进行处理后催化外源赖 氨酸生产戊二胺，用于提高戊二胺的产率。此方法特点为先进行赖氨酸 发酵，制备得到纯度较高的赖氨酸或其盐，再利用赖氨酸脱羧酶进行催 化，该方法工艺流程长，而且反应体系中主要采用纯化后的赖氨酸或赖 氨酸盐，成本高。
发明内容
为克服上述技术不足，本发明提供一种混合发酵的方法，以解决戊 二胺对微生物菌株毒性的问题，其工艺简单、成本低廉、发酵周期短， 适于产业化生产的1,5-戊二胺的制备方法。
本发明在赖氨酸发酵过程中，加入产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液， 进行混合发酵。通过工艺优化，可以有效生产1,5-戊二胺。这种方法不同 于已报道的生物法戊二胺的两个途径，不需要用纯化的赖氨酸为底物进 行催化，并尽可能的降低戊二胺对生产菌株的毒性影响，生产周期短， 工艺简单成本低，利于实现戊二胺的产业化生产。
本发明技术方案如下：
一种1,5-戊二胺的制备方法，包括向赖氨酸发酵液中接入产赖氨酸脱 羧酶菌株的种子液，进行混合发酵。
本发明所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液是指将产赖氨酸脱羧酶菌 株接种于液体种子培养基中培养而制得。
所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液处于快速生长期，活力较高，但 是还没开始大量产酶(赖氨酸脱羧酶)，还处于发酵前期的细胞培养阶 段，主要表现为细菌个数(或还包括细菌重量)的增加。发明人发现， 将该种子液加入赖氨酸发酵培养基中形成发酵液时，菌株快速增殖并生 成目标产物，使整个发酵体系中发酵生产赖氨酸过程、发酵生产赖氨酸脱羧酶过程以及转化制备戊二胺过程同步进行，可达到最高效率，获得 较高产量的戊二胺，并可充分高效利用发酵液中营养成分，利于节约成 本，缩短发酵周期，大大简化了发酵工艺。
在本发明一些实施例中，所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液中赖氨 酸脱羧酶的含量为≤20U/mL。在本发明一些实施例中，所述产赖氨酸脱 羧酶菌株的种子液的培养时间为10-25h，进一步优选15-20h。
本发明所述赖氨酸脱羧酶(简称LDC，EC4.1.1.18)是指可将赖氨酸 转化为1,5-戊二胺的酶，没有特别限制，可举出例如来自公知的生物酶。 本发明所述产赖氨酸脱羧酶菌株，可举出例如来自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、毛链霉菌(Streptomyces pilosus)、啮蚀艾肯 氏菌(Eikenella corrodens)、嗜氨基酸真杆菌(Eubacterium acidaminophilum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等微生 物的酶。
在本发明具体实施方式中，所述产赖氨酸脱羧酶菌株采用蜂房哈夫 尼菌(Hafniaalvei)作为宿主菌，可以市售购得。在本发明一些优选的实施 例中，使用蜂房哈夫尼菌Am607(Hafnia alvei Am607)，该菌株已于2018 年11月1日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址： 中国.武汉，邮编430072)，保藏编号：CCTCC NO：M 2018737。
本发明所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液可采用本领域常规方法制 备。例如，当采用蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)时，可取200uL该菌株的甘 油保存菌液，接种于装有100mL液体种子培养基的500mL种子瓶(例如 三角瓶)内，在20-40℃、如果是在摇瓶阶段，培养搅拌例如为150-200rpm 摇床培养15-20小时，获得产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液。
可采用本领域常规液体种子培养基，例如LB培养基(蛋白胨1％， 酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH 7.0)。
具体地，向赖氨酸发酵液中接入产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液的时 机可为赖氨酸发酵周期从开始到结束的任意阶段，也可以为赖氨酸发酵 结束后。
进一步的研究发现，在赖氨酸生产菌株发酵的中后期阶段，或者优 选在赖氨酸发酵液中赖氨酸含量达到最高值的50-80％时加入产赖氨酸脱 羧酶菌株的种子液，1,5-戊二胺的转化率最高。
在本发明一些具体的实施方式中，所述赖氨酸生产菌株发酵的中后 期阶段是指发酵至20-80h。
在本发明具体的实施方式中，当赖氨酸的发酵周期是68h时，加入 产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液的时机可以是赖氨酸发酵到20-80h中的任 意一个时间点，例如发酵至20h、30h、40h、50h、60h、70h或80h；优 选赖氨酸发酵到30-70h中的任意一个时间点，更优选赖氨酸发酵到 50-60h中的任意一个时间点。
优选地，当赖氨酸发酵周期为68h时，发酵周期中后期是指赖氨酸 发酵至40-80h；或者是指赖氨酸发酵液中赖氨酸含量达到最高值的50-80％ 时。
一般地，在确定赖氨酸发酵周期时，可以发酵液中赖氨酸的含量从0 到不再增加为标准判断赖氨酸发酵的起点和终点。
一般地，在加入产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液之后的混合发酵过程 中，主要依据发酵液中戊二胺的含量变化来判断发酵结束终点，即当戊 二胺的含量不再变化时，可以确定赖氨酸产生和赖氨酸脱羧酶催化反应 结束。
优选地，所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液与所述赖氨酸发酵液的 体积比(简称接种量)为1％-7％，具体可为1％、2％、3％、4％、5％、 6％或7％；优选为3％-6％，更优选为4％-5％。
优选地，接入产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液后混合发酵时，控制体 系pH值为5.0-7.5，具体可为5.0、6.0、6.5、7.0或7.5；更优选为6.5-7.0。
优选地，接入产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液后混合发酵时，还包括 向反应体系加入适量辅酶，所述辅酶可选自吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆 醇、吡哆胺中的一种或多种，更优选为5’-磷酸吡哆醛。优选控制所述辅 酶在反应体系中的浓度为0.05-0.5mM。
优选的，所述辅酶的加入时间为混合发酵的5-30h中的任意一个时间 点，例如发酵至5h、10h、15h、20h、25h或30h。
优选地，上述方法中，所述混合发酵温度可为30-40℃。
本发明所述赖氨酸发酵液可通过现有技术制备，例如可参见 CN104762336A。
本发明中所用到的赖氨酸生产菌株，可列举出黄色短杆菌、谷氨酸 棒杆菌、大肠杆菌等微生物。
在本发明一个具体的实施方式中，所述赖氨酸发酵液采用大肠杆菌 ELa6116(Escherichia coli ELa6116)进行制备，该菌株已于2018年11 月1日进行生物保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中 国.武汉，邮编430072)，保藏编号：CCTCC NO：M2018736。
另外，作为培养上述微生物的方法，没有特别限制，可采用公知的 方法。更具体而言，例如，当培养微生物时，作为培养基，可使用含有 碳源、氮源及无机离子的培养基。作为碳源，可举出例如葡萄糖、乳糖、 蔗糖、半乳糖等糖类；例如甘油、甘露醇或山梨糖醇等醇类；例如葡糖 酸、富马酸、柠檬酸或琥珀酸等有机酸类等。上述碳源可单独使用或并 用两种以上。作为氮源，可举出例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵 盐；例如大豆水解物等有机氮；例如氨气、氨水等。上述氮源可单独使 用或并用两种以上。作为无机离子，可举出例如钠离子、镁离子、钾离 子、钙离子、氯离子、锰离子、铁离子、磷酸离子、硫酸离子等。上述无机离子可单独使用或并用两种以上。另外，根据需要，也可向培养基 中添加其他有机微量营养素，作为上述有机成分，可举出例如各种氨基 酸和酵母提取物等。除这些以外，还可根据需要少量含有磷酸钙、硫酸 镁、铁离子、锰离子等。
在本发明一些具体的实施方式中，例如，当培养大肠杆菌时，培养 温度例如为25-40℃，优选为30-40℃；培养pH值例如为5.0-8.5，优选 为6.0-7.5；培养时间例如为20-80小时。如果是在摇瓶阶段，搅拌转速 为50-250rpm。
本发明较佳的实施方式是，一种1,5-戊二胺的制备方法，包括向发酵 至发酵周期中后期的赖氨酸发酵液中接入赖氨酸脱羧酶含量≤20U/mL 的产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液，控制体系pH值为6.5-7.0；在混合培养 15-20h时加入辅酶5’-磷酸吡哆醛至终浓度0.05-0.5mM，混合发酵周期为 30±5h。
本发明另一较佳的实施方式是，一种1,5-戊二胺的制备方法，包括向 发酵至发酵周期中后期的赖氨酸发酵液中接入培养时间为10-25h的产赖 氨酸脱羧酶菌株的种子液，控制体系pH值为6.5-7.0；在混合培养15-20h 时加入辅酶5’-磷酸吡哆醛至终浓度0.05-0.5mM，混合发酵周期为30±5h。
上述方法中，混合发酵结束后得到含有戊二胺的混合液，可采用本 领域常规方法进一步提取制备戊二胺，例如可参考CN104762336A。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件， 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可 通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明中所用的检测溶液中赖氨酸和戊二胺含量的方法采用本领域 中公知的方法。如下实施例中，赖氨酸的含量使用高效液相色谱检测， 戊二胺的含量使用气相色谱检测。
下面通过制备实施例对本发明进行详细说明，使本发明的特征和优点 更清楚，但本发明并不局限于本文中列出的实施例。
实施例1制备赖氨酸发酵液
(1)斜面：用LB培养基
LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏1％，氯化钠0.5％，pH值7.2。
(2)一级种子培养基(摇瓶种子培养基)
所用赖氨酸生产菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)ELa6116(保藏 编号：CCTCCNO：M 2018736)。
取一环大肠杆菌(Escherichia coli)ELA6116斜面菌种，接种于装有100毫升液体培养基(肉汤培养基：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％， 氯化钠0.5％，pH值7.0)的500毫升种子瓶内，在33℃，200rmp摇床培 养15-20小时，获得赖氨酸一级种子液。
(3)赖氨酸发酵条件
在500mL三角瓶内，加入100mL发酵培养基，接入4mL上述赖氨 酸一级种子液，于温度33℃，摇床转速250rmp下开始发酵。
发酵培养基组成为：4％葡萄糖,0.2％KH2PO4,0.1％MgSO4,1.4％ (NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.3％酵母提取物,0.01％L-苏 氨酸,0.005％L-异亮氨酸。121℃灭菌20分钟。
实施例2制备产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液
所用菌株：蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)菌株Am607(保藏编号：CCTCC NO：M2018737)。
方法：取200uL该菌株的甘油保存菌液，接种于装有100mL液体种 子培养基的500mL种子瓶内，在35℃、170rmp摇床培养15小时，获得 产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液。经检测，该种子液中赖氨酸脱羧酶的含 量不超过20U/mL。
LB培养基:蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH 7.0。
若无特殊说明，以下实施例及对比例采用实施例1、2方法制备赖氨 酸发酵液及产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液。
实施例3
分别取1mL培养15h的产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液，转接入发酵 至20h、30h、40h、50h、60h、70h和80h的赖氨酸发酵液中，不控制发 酵过程pH值，在200rpm，35℃振荡培养，当戊二胺含量不再增加时判 断为发酵结束，实际培养时间为20h，并测定发酵结束时发酵液中戊二胺 含量。结果见表1。
表1
实施例4赖氨酸发酵液和产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液混合比例对 戊二胺产量的影响
在培养至50h的赖氨酸发酵液中，分别接入培养15h的产赖氨酸脱 羧酶菌株的种子液，接种量分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％和7％； 发酵过程不控制发酵液pH值，在200rpm、35℃振荡培养20h，当戊二胺 含量不再增加时判断为发酵结束，并测定发酵结束时发酵液中戊二胺含 量。结果见表2。
表2
实施例5混合发酵过程中pH值的控制对戊二胺产量的影响
将4mL培养15h的产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液转接入100mL培养 50h的赖氨酸发酵液中，在200rpm、35℃振荡培养；采用振荡流加三角 瓶，控制混合发酵过程pH值分别为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5； 继续培养直至发酵液液中戊二胺的含量不再增加为止，实际培养时间为 20h，测定发酵液中戊二胺产量，结果见表3：
表3
混合发酵过程pH 5.0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
戊二胺产量(g/kg) 1.73 2.18 4.64 4.27 1.97 0.33 未检出
实施例6添加辅酶对戊二胺产量的影响
将4mL培养15h的产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液转接入100mL培养 50h的赖氨酸发酵液中，在200rpm、35℃振荡培养，培养过程中控制发 酵液pH至6.5；分别在混合发酵5、10、15、20、25、30h添加辅酶5’- 磷酸吡哆醛，使混合发酵液中5’-磷酸吡哆醛的终浓度为0.1mM，混合发 酵周期为30h，发酵结束后戊二胺产量见表4。
表4
辅酶添加时间h 5 10 15 20 25 30
戊二胺产量(g/kg) 2.32 3.78 4.88 4.56 4.29 4.11
从以上实施例可以得出，本发明优选的实施方式为在发酵生产赖氨 酸的赖氨酸菌株发酵培养50h时加入培养了15h的产赖氨酸脱羧酶菌株 的种子液，在200rpm、35℃振荡培养，培养过程中控制发酵液pH至6.5， 在混合培养15h时加入辅酶至终浓度0.1mM，最终得戊二胺产量为 4.88g/kg，混合发酵周期为30h，总发酵时间为95h。
对比例1赖氨酸脱羧酶发酵液和赖氨酸发酵液混合培养
(1)按照实施例1方法制备赖氨酸发酵液，发酵结束时发酵液中赖氨 酸浓度约为3％。实际发酵周期为68小时。
(2)赖氨酸发酵液的纯化：采用过滤的方式除去步骤(1)赖氨酸发酵 液中的菌体(所述过滤方式为板框过滤、离心和/或陶瓷膜过滤均可)，得到 澄清的赖氨酸发酵液，控制澄清的发酵液中赖氨酸浓度约为3％。
(3)单独培养赖氨酸脱羧酶发酵液：
将4mL按照实施例2方法获得的产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液接入 100mL发酵培养基，发酵培养30h后结束发酵，获得赖氨酸脱羧酶发酵液。
发酵培养基成分为：葡萄糖20g/l，玉米浆10g/l、硫酸铵2g/l、氯化钠 3g/l、硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，酵母膏1.5g/l。发酵培养条件：控制 pH为6.5、温度为35℃、200rpm振荡。
(4)取步骤(2)中的澄清的赖氨酸发酵液100mL于500mL三角瓶中， 再加入4mL步骤(3)获得的赖氨酸脱羧酶发酵液，在200rpm、并使赖氨酸 脱羧酶细胞的重量与赖氨酸重量比为0.015，35℃进行生物催化，催化过程 中控制pH为6.5；并添加辅酶5’-磷酸吡哆醛0.1mM，催化时间为24h，以 戊二胺的含量不再增加，终止催化反应。测得体系中戊二胺含量为4.91g/kg。
对比例2赖氨酸脱羧酶发酵液和赖氨酸发酵液混合培养
(1)按照实施例1方法制备赖氨酸发酵液，发酵结束时发酵液中赖氨 酸浓度约为3％。实际发酵周期为68小时。
(2)赖氨酸发酵液的纯化：膜过滤除菌体，离子交换处理，使用氨水 洗脱，然后用盐酸中和，得到纯的赖氨酸盐溶液。
(3)单独培养赖氨酸脱羧酶发酵液：
将4mL按照实施例2方法获得的产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液接入 100mL发酵培养基，发酵培养30h后结束发酵，获得赖氨酸脱羧酶发酵液。
发酵培养基成分为：葡萄糖20g/l，玉米浆10g/l、硫酸铵2g/l、氯化钠 3g/l、硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，酵母膏1.5g/l。发酵培养条件：控制 pH为6.5、温度为35℃、200rpm振荡。
(4)取步骤(2)中纯的赖氨酸盐溶液120mL于500mL三角瓶中，再 加入4mL步骤(3)获得的赖氨酸脱羧酶发酵液，在200rpm、35℃进行生物 催化，催化过程中控制pH为6.5；并添加辅酶5’-磷酸吡哆醛0.1mM，催化 时间为24h，以戊二胺的含量不再增加，终止催化反应。测得体系中戊二胺 含量为5.09g/kg。
对比可知，本发明方法能够达到与对比例1、对比例2相当的戊二胺产 量，但是本发明方法操作步骤简单，不需要用纯化的赖氨酸为底物进行催化， 尽可能的降低了戊二胺对生产菌株的毒性影响，具有优异的技术效果。
以上描述了本发明的可选实施方式，以教导本领域技术人员如何实施和 再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。在 阅读本发明说明书之后，本领域技术人员根据化学领域中的公知常识可以容 易地想到可以达到本发明目的的本发明技术方案的变型或替代方式，本发明 本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替代方式将落在本发 明的范围内。

Claims (9)

1.一种1,5-戊二胺的制备方法，其特征在于，在赖氨酸发酵过程中接入产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液，进行混合发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液的培养时间为10-25h，优选为15-20h；或者所述种子液中赖氨酸脱羧酶的含量≤20U/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，赖氨酸发酵过程中接入所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液的时机为在赖氨酸生产菌株发酵的中后期阶段，或者在赖氨酸发酵液中赖氨酸含量达到最高值的50-80％时。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，接入所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液的时机为赖氨酸发酵到20-80h时，优选为30-70h时，更优选为50-60h时。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述混合发酵时控制体系pH值为5.0-7.5，优选为6.5-7.0。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述产赖氨酸脱羧酶菌株的种子液与所述赖氨酸发酵液的体积比为1％-7％，优选为3％-6％，更优选为4％-5％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述混合发酵时，还包括向反应体系加入适量辅酶，所述辅酶选自吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺中的一种或多种，优选为5’-磷酸吡哆醛；优选控制所述辅酶在反应体系中的终浓度为0.05-0.5mM。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述混合发酵温度为30-40℃。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，所述混合发酵周期为30±5h。
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