CN105154360B - 一种睾丸酮丛毛单胞菌hy-08d的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种睾丸酮丛毛单胞菌HY‑08D的培养方法。包括以下步骤：将睾丸酮丛毛单胞菌株HY‑08D接种到斜面中，28‑32℃培养得活化斜面菌种；接种到摇床培养，得到一级种子液；进行扩大培养，通风比0.17‑0.25vvm，相对溶解氧浓度20‑40%，罐压0.08‑0.12MPa，得到睾丸酮丛毛单胞菌株HY‑08D二级种子液；进行扩大培养，控制通风比0.125‑0.21vvm制得高酶活睾丸酮丛毛单胞菌株HY‑08D转化用培养液。本发明单位体积培养液中菌体量较之前提高了40%以上、天冬氨酸脱羧酶酶活力提高了55%以上，效果显著。
Description
（一）技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法。
（二）背景技术
L-丙氨酸又名L-α-氨基丙酸，易溶于水, 微溶于乙醇, 是生命体内与糖代谢密切相关、需求量较多的氨基酸之一。近年来，随着研究开发的不断深入，丙氨酸在医药、食品及化工等行业得到了广泛的应用。在医药工业中，丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的重要成分，也是无机离子的补充剂和心肌功能增强剂。此外，L-丙氨酸还是合成维生素B6及氨基丙醇的重要原料。在食品工业中，L-丙氨酸可以作为甜味剂和提鲜剂, 改善人工甜味剂的味感和有机酸的酸味。
L-丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法逐步发展为用L-天冬氨酸-β-脱羧酶的酶转化法（固定化细胞法或游离整体细胞法）生产。目前，我国主要采用游离整体细胞法生产L-丙氨酸。其生产过程大致如下：首先培养产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌体细胞，然后将L-天冬氨酸加入到培养液中，L-天冬氨酸在L-天冬氨酸-β-脱羧酶的作用下转化生成L-丙氨酸，转化完成后经过滤、浓缩、结晶、干燥等工序得到成品L-丙氨酸。酶转化法效率的高低主要是由单位体积培养液中L-天冬氨酸脱羧酶的酶活力决定的，而提高单位体积培养液中的酶活性主要有两种方法：一是通过菌种诱变提高菌体的产酶能力；二是通过培养基和培养条件的优化，提高单位体积培养液中产酶菌体细胞量和单位培养液总酶活力。
申请人拥有游离整体细胞转化生产L-丙氨酸的专利菌株（睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D，保藏编号为CGMCC No.6083）和技术（专利授权公告号：CN 102690762 B），本发明在原有技术的基础上，提供一种睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D新的培养方法，提高单位体积培养液中L-天冬氨酸脱羧酶活力，进而提高其转化效率。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，通过提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶量，从而提高单位体积细胞培养液的转化效率。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
（1）菌株HY-08D斜面菌种活化：将低温保存的菌株HY-08D接种到装有活化培养基试管斜面中，28-32℃培养，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试管斜面中，28-32℃培养，再转接另一斜面，28-32℃培养即得活化斜面菌种；
（2）制备菌株HY-08D一级种子液：取步骤（1）得到活化斜面菌种，接种到装有培养基的三角瓶中， 28-32℃、进行摇床培养，得到一级种子液；
（3）制备菌株HY-08D二级种子液：取步骤（2）得到的种子液以体积比1-1.5‰接种量转接到装有培养基的发酵罐中进行扩大培养，通风比0.15-0.25vvm，相对溶解氧浓度20-40%，根据溶解氧需求适当调节搅拌转速，罐压0.08-0.12MPa，28-32℃，培养，得到二级种子液；
（4）制备菌株HY-08D转化用培养液：将步骤（3）培养好的二级种子液以体积比5-10%接种量转接到装有养培养基大发酵罐中进行扩大培养，控制通风比0.10-0.2 vvm，相对溶解氧浓度20-40%，根据溶解氧需求适当调节搅拌转速，罐压0.08-0.12MPa，28-32℃培养，制得菌株HY-08D转化用培养液。
步骤（1）中，培养时间均为24-36小时。
步骤（2）中，摇床培养时间为12-18小时，摇床转速为180-200rpm。
步骤（3）中，培养时间为10-16小时。
步骤（4）中，培养时间为8-10小时。
上述的活化斜面培养基所必需的营养物质包括（g/L）：蛋白胨10；牛肉膏5；酵母膏5；氯化钠5；琼脂20，pH 7.0-7.2。
上述菌株HY-08D培养所用培养基所必需的营养物质包括（g/L）：天冬氨酸5-8；谷氨酸钠7-12；葡萄糖3-8；酵母粉5-10；氯化钠3-6；玉米浆干粉5-12，pH 6.0-7.0。更优选的：天冬氨酸6-7；谷氨酸钠8-10；葡萄糖5-6；酵母粉6-8；氯化钠3-5；玉米浆干粉6-8，pH 6.0。
上述细胞培养所用培养基是通过优化得到的，考察指标为单位体积培养液中的菌体浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活力。
上述菌株HY-05C培养的工艺控制参数（接种量、培养时间、通风量、相对溶解氧浓度）是通过优化确定的，考察指标为转化用培养液中单位体积的菌体浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活力。
本发明所述的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D来自烟台恒源生物股份有限公司前期选育的高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌株（记载在授权号：CN 102690762 B，授权日：2013.10.02，发明名称为：“游离细胞法生物转化L-天冬氨酸生产L-丙氨酸的方法”。睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6083，保藏日期为2012年5月7日）。
本发明的有益效果：
1、本发明通过菌株HY-08D培养基和培养条件的优化，提高了菌株HY-08D转化用培养液中的L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活力，进而提高后续转化效率和设备利用率。
2、与原工艺相比，本发明菌株HY-08D培养工艺，通过对培养基和培养条件的优化，单位体积培养液中菌体量较之前提高了40%以上、天冬氨酸脱羧酶酶活力提高了55%以上，效果显著。
3、与原工艺相比，本发明菌株HY-08D培养工艺，采用三级培养，二级培养罐接种采用1-1.5‰的接种量，有效降低扩培次数和染菌几率；三级培养罐采用5-15%的大接种量，大幅缩短了培养时间，同时使得培养液中的菌体生长更加整齐，单位体积酶活力明显增加，转化试验证明，相同体积的培养液转化效率提高60%左右。
（四）附图说明
附图1 接种量对菌株HY-08D生长的影响；
附图2 接种量对菌株HY-08D产酶的影响。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D接种到装有活化培养基试管斜面中（培养基配方：氯化钠5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，琼脂20g/L，pH7.0-7.2），30℃培养24小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化培养基试管斜面中，30℃培养24小时，再转接另一斜面，30℃培养24小时即得活化斜面菌种。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养用培养基：天冬氨酸5g/L，谷氨酸钠10g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉6g/L，氯化钠5g/L，玉米浆干粉6g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至6.0，定容， 118℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
取上述新鲜活化斜面菌种分别接入5L的三角瓶中，培养基装液量1000mL，200rpm，30℃，摇床培养16小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液（2×1000mL）转接到装有1.5 m3培养基的2 m3培养罐中，调整罐压0.08MPa，通风比0.15vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧20%，30℃培养12小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液（1.5 m3），转接到装有15 m3培养基的20 m3培养罐中，调整罐压0.08MPa，通风比0.15vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧20%，30℃培养10小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为55280U/mL。
实施例2
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D接种到装有活化培养基试管斜面中，30℃培养36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化培养基试管斜面中，30℃培养36小时，再转接另一斜面，30℃培养36小时即得活化斜面菌种。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸6 g/L，谷氨酸钠8 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母粉8 g/L，氯化钠4 g/L，玉米浆干粉8 g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至6.0，定容， 118 ℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
取上述新鲜活化斜面菌种分别接入5L的三角瓶中，培养基装液量1200mL，200rpm，30℃，摇床培养14小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液（2×1200mL）转接到装有1.5 m3培养基的2 m3培养罐中，调整罐压0.1MPa，通风比0.15vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30%，30℃培养10小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液（1.5 m3），转接到装有15 m3细胞培养培养基的20 m3培养罐中，调整罐压0.10MPa，通风比0.10vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30%，30℃培养8小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为58650U/mL。该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。
实施例3
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D通过转接斜面活化（培养基配方：氯化钠5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，琼脂20g/L，pH7.0），连续转接三次，培养温度30℃，培养30小时。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸8g/L，谷氨酸钠7g/L，葡萄糖3g/L，酵母粉10g/L，氯化钠6g/L，玉米浆干粉12g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至7.0，定容， 118℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
取上述新鲜活化斜面菌种分别接入5L的三角瓶中，培养基装液量1000mL，200rpm，32℃，摇床培养18小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液（2×1000mL）接种到到装有1.5 m3培养基的2 m3培养罐中，调整罐压0.12MPa，通风比0.2vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧40%，28℃培养16小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液（1.5 m3），转接到装有15 m3培养培养基的20 m3培养罐中，调整罐压0.12MPa，通风比0.1vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧40%，28℃培养9小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为55340U/mL。
实施例4
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D通过斜面转接进行活化。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸7g/L，谷氨酸钠9g/L，葡萄糖6g/L，酵母粉5g/L，氯化钠3g/L，玉米浆干粉10 g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至7.0，定容， 118 ℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
用新鲜活化斜面菌种摇瓶培养培养基，200rpm，28℃，摇床培养16小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液以体积比1.0‰接种量转接到装装液量为70%的二级培养罐中，调整罐压0.09MPa，通风比0.2vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧25%，32℃培养16小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液，以体积比5%接种量转接到装液量为75%的三级培养管中，调整罐压0.09MPa，通风比0.12vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧20%，32℃培养9小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为58715U/mL。该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。
实施例5
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D通过斜面转接进行活化。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸7g/L，谷氨酸钠12g/L，葡萄糖8g/L，酵母粉7g/L，氯化钠3g/L，玉米浆干粉5g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至6.0，定容， 118℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
用新鲜活化斜面菌种摇瓶培养培养基，200rpm，30℃，摇床培养18小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液以体积比1.5‰接种量转接到装装液量为75%的二级培养罐中，调整罐压0.09MPa，通风比0.2vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧25%，32℃培养16小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液，以体积比10%接种量转接到装液量为70%的三级培养管中，调整罐压0.09MPa，通风比0.2vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30%，30℃培养8小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为55174U/mL。该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。
实施例6
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D通过斜面转接进行活化。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸7g/L，谷氨酸钠11g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉4g/L，氯化钠4g/L，玉米浆干粉11g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至7.0，定容， 118℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
用新鲜活化斜面菌种摇瓶培养培养基，200rpm，30℃，摇床培养15小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液以体积比1.2‰接种量转接到装装液量为73%的二级培养罐中，调整罐压0.09MPa，通风比0.2vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧35%，32℃培养14小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液，以体积比8%接种量转接到装液量为70%的三级培养管中，调整罐压0.09MPa，通风比0.15vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧35%，30℃培养10小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为56107U/mL。该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。
实施例7
一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和L-天冬氨酸-β-脱羧酶量的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D培养方法，包括以下步骤：
1、菌种活化
将冷冻保存的菌株HY-08D通过斜面转接进行活化。
2、菌株HY-08D培养用培养基配制
按以下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸8g/L，谷氨酸钠12g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，氯化钠4g/L，玉米浆干粉10g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氢氧化钠调节pH 至7.0，定容， 118℃下灭菌30分钟。
3、一级种子液的制备
用新鲜活化斜面菌种摇瓶培养培养基，190rpm，31℃，摇床培养15小时，得到一级种子液。
4、二级种子液的制备
将经上述培养获得的一级种子液以体积比1.3‰接种量转接到装装液量为75%的二级培养罐中，调整罐压0.09MPa，通风比0.22vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30%，32℃培养12小时，得到二级种子液。
5、转化用培养液制备
将培养好的二级种子液，以体积比15%接种量转接到装液量为70%的三级培养罐中，调整罐压0.09MPa，通风比0.15vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解氧30%，31℃培养8小时，检测培养液L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力为55420U/mL。该培养液用于富马酸/天冬氨酸转化生产。
实施例8菌株HY-08D培养条件优化
1、菌株HY-08D培养基优化
在原有培养基配方的基础上，对菌株HY-08D培养基进行进一步优化，提高单位培养液体积中的细胞数。通过单因素试验的结果选取对菌体生长和产酶影响较大的4个因素：天冬氨酸、谷氨酸钠、玉米干粉和酵母粉进行正交试验优化。表3是培养基优化前后摇瓶培养细胞浓度和酶活变化，可以看出，培养基经优化后培养液的菌体量和酶活均有较大提高，优化效果明显。
表1 优化培养基与原始培养基菌体量和酶活对照
| 种类 | 菌体量（OD640） | 酶活（U） |
| 原始培养基 | 0.562 | 31100 |
| 优化培养基 | 0.787 | 48500 |
2、菌株HY-08D培养过程优化
微生物发酵种子培养通常采用逐级扩培的方式，但在实际生产中，为了降低染菌风险，通常采用二级或三级放大。目前，丙氨酸生产中，睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D转化用培养液采用二级培养。一级种子采用摇瓶培养，二级种子采用发酵罐培养。摇瓶培养规模与发酵罐差距悬殊，接种量小，培养周期长。本发明对接种量和扩培级数进行了优化，实验结果如附图1、2所示。从结果可以看出，提高接种量不仅可以缩短菌种生长周期，同时，可以提高单位发酵液中的L-天冬氨酸脱羧酶活力。所以，确定转化液采用三级扩培，一级种子采用摇瓶培养，二级种子采用2 m3发酵罐培养，一级接二级采用1-1.5‰的低接种量，降低接种染菌风险，三级采用20 m3发酵罐培养，二级接三级采用10%左右的接种量，可以缩短培养周期，提高单位培养液酶活力。
以上所述仅为本发明的一种实施方式，不是全部或唯一的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）菌株HY-08D斜面菌种活化：将低温保存的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D接种到装有活化培养基试管斜面中，28-32℃培养，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试管斜面中，28-32℃培养，再转接另一斜面，28-32℃培养即得活化斜面菌种；
（2）制备菌株HY-08D一级种子液：取步骤（1）得到的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D活化斜面菌种，接种到装有培养基的三角瓶中进行培养， 28-32℃、摇床培养，得到一级种子液；
（3）制备菌株HY-08D二级种子液：取步骤（2）得到的种子液以体积比1-1.5‰接种量转接到装有培养培养基的发酵罐中进行扩大培养，通风比0.15-0.25vvm，相对溶解氧浓度20-40%，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0.08-0.12MPa，28-32℃，培养，得到睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D二级种子液；
（4）制备菌株HY-08D转化用培养液：将步骤（3）培养好的睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D二级种子液以体积比5-10%接种量转接到大发酵罐中进行扩大培养，控制通风比0.1-0.2vvm，相对溶解氧浓度20-40%，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0.08-0.12MPa，28-32℃培养，制得转化用培养液；
所述的活化斜面培养基所必需的营养物质包括（g/L）：蛋白胨10；牛肉膏5；酵母膏5；氯化钠5；琼脂15-20，pH 7.0-7.2；
步骤（2）、步骤（3）、步骤（4）中，所述菌株HY-08D培养所用培养基所必需的营养物质包括（g/L）：天冬氨酸5-8；谷氨酸钠7-12；葡萄糖3-8；酵母粉5-10；氯化钠3-6；玉米浆干粉5-12，pH 6.0-7.0。
2.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特征在于：步骤（1）中，培养时间均为24-36小时。
3.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特征在于：步骤（2）中，摇床培养时间为12-18小时。
4.根据权利要求3所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特征在于：步骤（2）中，摇床转速为180-200rpm。
5.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特征在于：步骤（3）中，培养时间为10-16小时。
6.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特征在于：步骤（4）中，培养时间为8-10小时。
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2015
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