CN112322672A - 一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，将赖氨酸生产菌株产生的赖氨酸实时从赖氨酸发酵罐中移到脱羧酶发酵罐中生成戊二胺，脱羧酶发酵罐中的戊二胺也实时从发酵体系中异位分离出来，在多菌联合发酵制备戊二胺时不断的向赖氨酸生产菌株发酵罐中补充营养物质，让已经具有生物量种群优势的赖氨酸菌株持续合成赖氨酸，再将赖氨酸移出到脱羧酶发酵罐中生成戊二胺同时异位分离。利用发酵分离过程技术，将两步发酵过程组合起来，中间产物赖氨酸和产品戊二胺在各自的体系异位分离，提高了两株菌株的产量和原料的利用效率，单位菌体的生产能力也明显提高，提升戊二胺产品的产率和经济性，具有良好的放大前景和放大空间。

Description

一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法
技术领域
本发明涉及生物来源戊二胺的发酵分离工程技术领域，具体涉及一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法。
背景技术
1,5-戊二胺是一种广泛存在于生物体中、具有多种生物活性的生物多胺，广泛应用于农业、医疗和工业产品中，特别是用于合成生物基聚酰胺产品。
目前合成1,5-戊二胺的方法有化学合成法、生物合成法。化学合成法条件苛刻、污染环境，不适合大规模推广。而生物法合成1,5-戊二胺具有原料来源广、生产条件温和、环境友好等优势。
生物法合成戊二胺主要有三种方式：酶转化法、微生物发酵法、全细胞催化。但有研究表明，在3g/L的1,5-戊二胺溶液中，赖氨酸脱羧酶的活力会降低50％。同时在发酵生产戊二胺的过程中，当产物积累达到一定程度时，存在严重的产物抑制现象，此现象严重制约了纯酶催化生产1,5-戊二胺的应用，因而对于1,5-戊二胺的生物合成研究主要集中在利用微生物直接发酵生产或添加前体L-赖氨酸通过全细胞催化生产。因此，若能在戊二胺生产的同时，有效的分离产物，降低其在发酵体系中的浓度，则能大大降低产物的抑制作用，最终提高反应速率，有利于产物的积累。
在CN105950601A中采用的将赖氨酸脱羧酶菌株固定化来提高菌株的产物耐受能力和生产能力，但直接以赖氨酸发酵液为底物没有很好的与赖氨酸的发酵过程联合；在CN106011216A中采用的将产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌培养后作为发酵菌种；向装有发酵培养基的发酵罐中通入无菌空气或纯O2，接入产丁二酸菌和产赖氨酸脱羧酶菌作为出发菌株，并加入葡萄糖补料培养液、甘油补料培养液和乳糖诱导液，控制菌体比生长速率发酵；厌氧转化阶段，控制葡萄糖浓度和用赖氨酸控制pH即得产物1,5-戊二胺，将发酵和转化有机结合在一起来进行，该方法不仅节约发酵成本，而且省略了收集菌体这一步骤。并且该方法可以直接得到丁二酸戊二胺盐，可用于聚酰胺5.4合成，同样的也是直接以赖氨酸发酵液为底物没有很好的与赖氨酸的发酵过程联合，且赖氨酸脱羧菌株的生产能力不高；在CN109082448A采用紫外诱变和ARTP诱变相结合，筛选获得一株高产1,5戊二胺的大肠杆菌NT1006：以葡萄糖作为碳源，经过48h的发酵1,5戊二胺产量达到了50g/L，而同等条件培养的出发菌株1,5戊二胺产量仅有12.27g/L。NT1006连续传代7次后发酵液中1,5戊二胺的含量仍维持在50g/L左右，遗传稳定性好，该发明中将赖氨酸发酵和生成戊二胺两步在同一菌种上实现，简化过程生产经济，但是同一菌种行驶着赖氨酸发酵和生成戊二胺两大功能导致其戊二胺含量维持在50g/L，其生产能力较单一细胞的戊二胺产量两百多克每升还有差距。
全细胞催化生产1,5-戊二胺具有原料成本高、细胞重复利用率低等问题。发酵法生产1,5-戊二胺虽然相对原料成本较低，然而其产量和生产强度均因戊二胺对菌株的抑制而受限。如何将两者方法有效的结合，且仅取各自的优势，是值得探究的。
发明内容
在生物法生产1,5-戊二胺时，采用的工艺是先用菌株1发酵生产戊二胺的前体物质氨基酸，再利用菌株2生产赖氨酸脱羧酶。在菌株生产赖氨酸脱羧酶的作用下，可以将菌株发酵生产的赖氨酸转化成戊二胺，该工艺需要两种菌株根据各自的工艺分别进行发酵生产，俗称两步法。现通过基因工程在一株菌种实现氨基酸的发酵和转化生成二元胺两个步骤，即一步发酵生产二元胺。但由于发酵生氨基酸产菌株普遍的不耐受二元胺，一导致步法产量不高。
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，本发明在两步法的基础上，结合发酵分离工程技术在两种菌株发酵过程中，将赖氨酸生产菌株产生的赖氨酸实时的从发酵罐中移出到赖氨酸脱羧酶发酵罐中生成戊二胺，赖氨酸脱羧酶发酵罐中生成戊二胺也是实时从发酵体系中异位分离出来，在发酵过程中不断的向赖氨酸生产菌株发酵罐中补充营养物质，让已经具有生物量种群优势的赖氨酸菌株持续的合成赖氨酸，再移出到赖氨酸脱羧酶发酵罐中生成戊二胺，赖氨酸脱羧酶发酵罐中生成戊二胺也是实时从发酵体系中异位分离出来依次循环。一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，利用发酵分离过程过程技术，将两步发酵过程组合起来，在把中间产物赖氨酸及时转化成产品戊二胺的同时还将戊二胺从体系中异位分离出来，同时提高了两株菌株的产量和原料的利用效率，单位菌体的生产能力也明显提高，整体提升戊二胺产品的产率和经济性，具有良好的放大前景和放大空间。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，包括以下步骤：
步骤1，按需要搭建发酵分离耦合装置，向装置的发酵罐内加入发酵培养基升温至121℃维持20分钟后后降温至28-40℃、0.1-2.0vvm通入空气；
步骤2，取赖氨酸生产菌株的种子液，按体积比1：10接入赖氨酸发酵罐中，取脱羧酶生产菌株的种子液，按体积比1：10接入脱羧酶发酵罐中，先开启赖氨酸发酵罐进行发酵，发酵温度为28-40℃、通气量0.1-2.0vvm下发酵24-72h，当赖氨酸发酵罐发酵进行10-44小时后，再开启脱羧酶发酵罐进行发酵，发酵参数28-40℃、通气量0.1-2.0vvm下发酵2-8h，向脱羧酶发酵罐中加入诱导剂后，继续发酵16-70h；
步骤3，赖氨酸发酵罐内的赖氨酸浓度处于100-200g/L时，过滤发酵液，并将发酵清液通入脱羧酶发酵罐中，同时启动分离吸附装置，将脱羧酶发酵罐中的发酵液滤掉菌体后，进入吸附装置中分离得到的转化液，再回到赖氨酸发酵罐中继续发酵或者在戊二胺浓度高于100g/L流向储罐；
步骤4，当流经吸附装置的转化液中戊二胺浓度变化值小于5g/L时，结束发酵过程；整个发酵过程中在发酵0h和36h时，发酵体系添加终浓度20-500单位的抗生素，结束后发酵液中的二元胺进行分离，对耦合装置吸附的二元胺进行洗脱分离，分离后，清洗装置内的各个部件，即可重新组装循环利用；
上述发酵过程中，pH控制在6.8-7.2，溶氧控制在20％-40％。当赖氨酸发酵罐中溶氧从40％快速上升至高于80％时，立即加入补料培养基，且过程中保证发酵培养基中碳源浓度以还原性糖为单位处于0.3-1％之间和氮源以氨氮含量为单位处于0.1-0.4％之间。
作为改进的是，步骤2中赖氨酸发酵罐的发酵采用半连续发酵培养基或连续发酵的形式进行。
作为改进的是，赖氨酸生产菌株和脱羧酶菌株的发酵液体积比为为5-15:1。
作为改进的是，赖氨酸生产菌株和脱羧酶菌株的发酵液体积比为5-8:1。
作为改进的是，所述分离吸附装置为树脂吸附装置或树脂流化床装置。
作为改进的是，树脂吸附装置内选用D152或D724的树脂。
作为改进的是，步骤2和步骤3中发酵培养基的碳源为葡萄糖或蔗糖水溶液中的任意一种或两种的组合；所述有机氮源为蛋白胨、酵母提取物中的任意一种或几种的组合；发酵培养基的无机氮源为硫酸铵水溶液、氯化铵水溶液或尿素水溶液；发酵培养基的无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐和钙盐中的任意一种或几种的组合；补料培养基中碳源质量百分比为20-70％，；补料培养基中无机氮源在发酵培养基中的质量百分数为20-50％。
进一步改进的是，步骤2和步骤3中所述发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖或蔗糖1-3％、蛋白胨1-2％、硫酸铵0.5-2％、磷酸氢二钾0.5-1％、硫酸锰0.02-0.08％、硫酸亚铁0.02-0.08％、硫酸镁0.1-0.3％、L-苏氨酸0.04-0.1％、L-甲硫氨酸0.04-0.1％、维生素B1 0.04-0.1％、烟酰0.04-0.1％、生物素0.04-0.1％，余量为水，pH为6.8-7.2。
作为改进的是，步骤2和步骤3中，温度控制在32-37℃，pH控制在6.5-7.5，溶氧控制在20％-40％。
作为改进的是，赖氨酸发酵过程中和赖氨酸脱羧酶发酵过程中的pH都通过体积比为25％的氨水来调节。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，具有如下优势：
采用发酵分离过程技术，将生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程组合起来，在发酵过程中就把中间产物赖氨酸及时转化成产品戊二胺，同时还将戊二胺从体系中异位分离出来，同时提高了两株菌株的产量和发酵设备的利用效率，整体提升戊二胺的产率和经济性，减少了产物抑制的同时提高两株菌株单位菌体生产能力。
附图说明
图1为实施例2使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，14-陶瓷膜，4-第一料液泵，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，14-陶瓷膜；
图2为实施例3使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，14-陶瓷膜，4-第一料液泵，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，14-陶瓷膜,15-吸附柱；
图3为实施例4使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，14-陶瓷膜，4-第一料液泵，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，14-陶瓷膜，10-储罐；
图4为实施例5使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，14-陶瓷膜，5-料液泵，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，14-陶瓷膜,9-吸附装置，11-储罐管路阀门，10-储罐，12-赖氨酸发酵罐回路阀门；
图5为实施例6使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，4-第一料液泵，5-第一纤维膜管装置，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，14-陶瓷膜,9-吸附装置，10-储罐，11-储罐管路阀门，12-赖氨酸发酵罐回路阀门；
图6为实施例7使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，4-第一料液泵，5-第一中空纤维膜管装置，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，7-第二料液泵，8-第二中空纤维膜管装置，9-吸附装置，10-储罐，11-储罐管路阀门，12-赖氨酸发酵罐回路阀门；
图7为实施例8使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，4-第一料液泵，5-第一中空纤维膜管装置，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，7-第二料液泵，8-第二中空纤维膜管装置，9-1-第一吸附装置，9-2--第二吸附装置,10-储罐，11储罐管路阀门，12-赖氨酸发酵罐回路阀门；
图8为实施例9使用的发酵分离耦合装置的结构示意图，1-补料罐，2-补料泵，3-赖氨酸发酵罐，4-第一料液泵，5-第一中空纤维膜管装置，6-赖氨酸脱羧酶发酵罐，7-第二料液泵，8-第二中空纤维膜管装置，9-1-第一吸附装置，9-2-第二吸附装置,10-储罐，11储罐管路阀门，12-赖氨酸发酵罐回路阀门。
具体实施方式
赖氨酸菌种命名为大肠杆菌(Escherichia coli)NT1003△Met△Thr，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：NO：M2013239。
脱羧酶菌种(Escherichiacoli)，菌株号为NT1006，已保藏于中国典型培养物保藏中心(详情见专利：一种大肠杆菌及其在发酵生产1,5-戊二胺中的应用，公开号：CN201810947735.3)
实施例1
本实施例为赖氨酸发酵、赖氨酸脱羧酶发酵作为两个单独的发酵过程，作为一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法的对照，赖氨酸发酵、赖氨酸脱羧酶单独发酵的过程如下：
1、培养基配制
其中，本实施例使用的培养基的配方如下：
(1)LB平板培养基，按质量百分比包括如下组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、琼脂粉2％、余量为水。
(2)种子培养基，包含如下质量百分比组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2。
(3)7.5L发酵培养基，包含如下质量百分数组分：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、L-苏氨酸0.04-0.1％、L-甲硫氨酸0.04-0.1％、维生素B1 0.04-0.1％、烟酰0.04-0.1％、生物素0.04-0.1％，余量为水，pH 6.8-7.2。
2、平板培养
赖氨酸发酵菌种和赖氨酸脱羧酶发酵菌种，在37℃下活化24h；
3种子培养
将平板培养基上活化的赖氨酸发酵菌种和赖氨酸脱羧酶发酵菌种接种于种子培养基中，500mL摇瓶中装液量为50mL，培养温度为37℃，200rpm摇床转速下培养8-12h；
4发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h用SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为630.0g，得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液加入赖氨酸脱羧酶发酵罐中催化4h，经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为450.36g，用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为210.4,赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为23.88；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为2.99g,赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为18.86g。
实施例2赖氨酸发酵联合赖氨酸脱羧酶发酵过程
如图1所示，搭建发酵分离耦合装置，将陶瓷膜14置于赖氨酸发酵罐3之内与发酵罐的出料口连接，将陶瓷膜14置于赖氨酸脱羧酶发酵罐6之内与发酵罐的出料口连接，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、赖氨酸脱羧酶发酵罐6和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的发酵清液、经过第一料液4的加压后，进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液，再返回赖氨酸发酵罐3继续发酵。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于对应的发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液在滤掉菌体后，再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为637.5g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为461.42g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为211.5，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.3；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.01g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为18.99g。
实施例3生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图2所示，搭建发酵分离耦合装置，将陶瓷膜14置于赖氨酸发酵罐3之内与发酵罐的出料口连接，将陶瓷膜14置于赖氨酸脱羧酶发酵罐6之内与发酵罐的出料口连接，树脂放置于树脂吸附柱15内，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、赖氨酸脱羧酶发酵罐6、树脂吸附柱15和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的发酵清液、经过第一料液泵4的加压后，进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液，经过吸附柱15吸附后的料液再返回赖氨酸发酵罐3继续发酵。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于对应的发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液夜在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为696.6g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为497.97g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数212.4，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.0；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.28g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为20.47g。
实施例4生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图3所示，搭建发酵分离耦合装置，将陶瓷膜14置于赖氨酸发酵罐3之内与发酵罐的出料口连接，将陶瓷膜14置于赖氨酸脱羧酶发酵罐6之内与发酵罐的出料口连接，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、赖氨酸脱羧酶发酵罐6和储罐10用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的发酵清液、经过第一料液泵4的加压后，进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液，直接进去储罐10。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液夜在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为702.0g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为501.83g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为211.5,赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.48；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.32g,赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为20.50g。
实施例5生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图4所示，搭建发酵分离耦合装置，将陶瓷膜14置于赖氨酸发酵罐3之内与发酵罐的出料口连接，将陶瓷膜14置于赖氨酸脱羧酶发酵罐6之内与发酵罐的出料口连接，树脂置于吸附装置9内，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、赖氨酸脱羧酶发酵罐6、吸附装置9分别和储罐10和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的发酵清液、经过第一料液泵4的加压后，进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液，经过吸附装置9吸附后的料液经过赖氨酸发酵罐回路阀门12再返回赖氨酸发酵罐继续发酵；当赖氨酸发酵罐内的装液量达到额定装液量的75％时，则赖氨酸脱羧酶发酵罐6后在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液经过储罐管路阀门11，流进储罐12。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，的戊二胺料液夜在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为783.0g，得经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为559.74g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为213.5，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.66；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.67g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为22.70g。
实施例6生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图5所示，搭建发酵分离耦合装置，第一中空纤维膜装置5的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接，且其浊液出口与赖氨酸发酵罐3相连接，将陶瓷膜14置于赖氨酸脱羧酶发酵罐6内与该发酵罐的出料口之间，树脂置于吸附柱9内，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、第一中空纤维膜装置5、赖氨酸脱羧酶发酵罐6、吸附装置9分别和储罐10和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液经过第一料液泵5的加压后在第一中空纤维膜装置5的作用下含菌体的浊液直接回赖氨酸发酵罐3而滤除菌体的发酵清液则进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后，在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液，经过吸附装置9吸附后的料液经过赖氨酸发酵罐回路阀门12再返回赖氨酸发酵罐继续发酵；当赖氨酸发酵罐内的装液量达到额定装液量的75％时，则赖氨酸脱羧酶发酵罐6后在陶瓷膜14的作用下滤除菌体的戊二胺清液经过储罐管路阀门11，流进储罐10。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为794.0g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为554.71g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为213.8，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.44；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.71g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为22.70g。
实施例7生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图6所示，搭建发酵分离耦合装置，第一中空纤维膜装置5的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接，且其浊液出口与赖氨酸发酵罐3相连接，第二中空纤维膜装置8的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接，且其浊液出口与吸附装置9相连接，吸附装置9内装有吸附柱，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、第一中空纤维膜装置5、赖氨酸脱羧酶发酵罐6、第二料液泵7、第二中空纤维膜装置8、吸附装置9分别和储罐11和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液经过第一料液泵4的加压后在第一中空纤维膜装置5的作用下含菌体的浊液直接回赖氨酸发酵罐3而滤除菌体的发酵清液则进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后，赖氨酸脱羧酶发酵罐6的料液经过第二料液泵7的加压后在第二中空纤维膜装置8的作用下含菌体的浊液直接回赖氨酸脱羧酶发酵罐6而滤除菌体的发酵清液，则经过吸附装置9吸附后的料液经过赖氨酸发酵罐回路阀门13再返回赖氨酸发酵罐继续发酵；当赖氨酸发酵罐内的装液量达到额定装液量的75％时，则赖氨酸脱羧酶发酵罐6的料液经过泵7的加压后在中空纤维膜装置8的作用下的戊二胺清液经过储罐管路阀门12，流进储罐11。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为799.40g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为588.48g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为214.1，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.97；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.73g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为22.37g。
实施例8生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图7所示，搭建发酵分离耦合装置，第一中空纤维膜装置5的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接，且其浊液出口与赖氨酸发酵罐3相连接，第二中空纤维膜装置8的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接，且其浊液出口与树脂吸附装置相连接，所述数值吸附装置由第一吸附装置9-1和第二吸附装置9-2串联而成，且两个吸附装置内装有吸附，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、第一料液泵4、第一中空纤维膜装置5、赖氨酸脱羧酶发酵罐6、第二料液泵7、第二中空纤维膜装置8、第一吸附装置9-1、第二吸附装置9-2分别和储罐10和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液经过泵5的加压后在中空纤维膜装置5的作用下含菌体的浊液直接回赖氨酸发酵罐3而滤除菌体的发酵清液则进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后，赖氨酸脱羧酶发酵罐6的料液经过泵7的加压后在中空纤维膜装置8的作用下含菌体的浊液直接回赖氨酸脱羧酶发酵罐6，而滤除菌体的发酵清液，则经过串联连接的第一吸附装置9-1、第二吸附装置9-2，吸附后的料液经过赖氨酸发酵罐回路阀门13再返回赖氨酸发酵罐继续发酵；当赖氨酸发酵罐内的装液量达到额定装液量的75％时，则赖氨酸脱羧酶发酵罐6的料液经过泵7的加压后在中空纤维膜装置8的作用下的戊二胺清液经过储罐管路阀门12，流进储罐11。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为813.0g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为567.99g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为213.5，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为25.01；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.81g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为22.71g。
实施例9生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程联合
如图8所示，搭建发酵分离耦合装置，第一中空纤维膜装置5的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接，且其浊液出口与赖氨酸发酵罐3相连接，第二中空纤维膜装置8的清液出口与赖氨酸脱羧酶发酵罐6连接且其浊液出口与树脂吸附装置相连接，其中树脂吸附装置是由第一吸附装置9-1和第二吸附装置9-2并联后与第二中空纤维膜装置8的浊液出口连接，第一吸附装置9-1和第二吸附装置9-2设有树脂，然后补料罐1、补料泵2、赖氨酸发酵罐3、料液泵4、第一中空纤维膜装置5、赖氨酸脱羧酶发酵罐6、第二料液泵7、第二中空纤维膜装置8、第一吸附装置9-1、第二吸附装置9-2分别和储罐10和赖氨酸发酵罐3用可灭菌的硅胶管依次连接。
一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，依次包括赖氨酸发酵罐3的料液经过第一料液泵4的加压后在第一中空纤维膜装置5的作用下，含菌体的浊液直接回赖氨酸发酵罐3中，而滤除菌体的发酵清液则进入赖氨酸脱羧酶发酵罐6后，赖氨酸脱羧酶发酵罐6的料液经过第二料液泵7的加压后，在第二中空纤维膜装置8的作用下，含菌体的浊液直接回赖氨酸脱羧酶发酵罐6，而滤除菌体的发酵清液，则经过并联连接的第一吸附装置9-1、第二吸附装置9-2吸附后的料液经过赖氨酸发酵罐回路阀门12返回赖氨酸发酵罐继续发酵；当赖氨酸发酵罐3内的装液量达到额定装液量的75％时，则赖氨酸脱羧酶发酵罐6的料液经过第二料液泵7的加压后在第二中空纤维膜装置8的作用下的戊二胺清液经过储罐管路阀门11，流进储罐10。
按如下步骤发酵合成戊二胺：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，平板培养
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，发酵培养
将赖氨酸发酵种子培养液和赖氨酸脱羧酶发酵菌种子培养液接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在20-40％，赖氨酸脱羧酶发酵时长30h且中间过程不补料。赖氨酸发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。赖氨酸发酵时间为60h得到的赖氨酸滤发酵液掉菌体后发酵清液流入赖氨酸脱羧酶发酵罐中进行催化反应，戊二胺料液在滤掉菌体后再返回赖氨酸发酵罐继续发酵。
最后SBA-40E生物传感分析仪测得赖氨酸总量为808.0g，得到的经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的总量为564.49g。用分光光度计在600nm条件下测量赖氨酸发酵菌体的OD总数为214.2，赖氨酸脱羧酶发酵菌体的OD总数为24.62；赖氨酸发酵菌体单位OD赖氨酸的产量为3.77g，赖氨酸脱羧酶发酵菌体单位OD戊二胺的产量为22.93g。
为了更直观的反应，本发明的优势，特将各实施例的实验数据记录入表格中。
Figure BDA0002780046730000141
从上述数据可以看出，本发明利用发酵分离过程技术，将生产赖氨酸过程、赖氨酸脱羧生产戊二胺过程和戊二胺吸附过程组合起来，在发酵过程中就把中间产物赖氨酸及时转化成产品戊二胺，同时还将戊二胺从体系中异位分离出来，同时提高了两株菌株的产量和设备的利用效率，整体提升戊二胺的产率和经济性，减少了产物抑制的同时提高两株菌株单位菌体生产能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，按需要搭建发酵分离耦合装置，向装置的发酵罐内加入发酵培养基升温至121℃维持20分钟后后降温至28-40℃、0.1-2.0vvm通入空气；
步骤2，取赖氨酸生产菌株的种子液，按体积比1：10接入赖氨酸发酵罐中，取脱羧酶生产菌株的种子液，按体积比1：10接入脱羧酶发酵罐中，先开启赖氨酸发酵罐进行发酵，发酵温度为28-40℃、通气量0.1-2.0vvm下发酵24-72h，当赖氨酸发酵罐发酵进行10-44小时后，再开启脱羧酶发酵罐进行发酵，发酵参数28-40℃、通气量0.1-2.0vvm下发酵2-8h，向脱羧酶发酵罐中加入诱导剂后，继续发酵16-70h；
步骤3，赖氨酸发酵罐内的赖氨酸浓度处于100-200g/L时，过滤发酵液，并将发酵清液通入脱羧酶发酵罐中，同时启动分离吸附装置，将脱羧酶发酵罐中的发酵液滤掉菌体后，进入吸附装置中分离得到的转化液，再回到赖氨酸发酵罐中继续发酵或者在戊二胺浓度高于100g/L流向储罐；
步骤4，当流经吸附装置的转化液中戊二胺浓度变化值小于5g/L时，结束发酵过程；整个发酵过程中在发酵0h和36h时，发酵体系添加终浓度20-500单位的抗生素，结束后发酵液中的二元胺进行分离，对耦合装置吸附的二元胺进行洗脱分离，分离后，清洗装置内的各个部件，即可重新组装循环利用；
上述发酵过程中，pH控制在6.8-7.2，溶氧控制在20％-40％。当赖氨酸发酵罐中溶氧从40％快速上升至高于80％时，立即加入补料培养基，且过程中保证发酵培养基中碳源浓度以还原性糖为单位处于0.3-1％之间和氮源以氨氮含量为单位处于0.1-0.4％之间。
2.根据权利要求1所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，步骤2中赖氨酸发酵罐的发酵采用半连续发酵培养基或连续发酵的形式进行。
3.根据权利要求1所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，赖氨酸生产菌株和脱羧酶菌株的发酵液体积比为为5-15:1。
4.根据权利要求3所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，赖氨酸生产菌株和脱羧酶菌株的发酵液体积比为5-8:1。
5.根据权利要求1所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，所述分离吸附装置为树脂吸附装置或树脂流化床装置。
6.根据权利要求5所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，树脂吸附装置内选用D152或D724的树脂。
7.根据权利要求1所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，步骤2和步骤3中发酵培养基的碳源为葡萄糖或蔗糖水溶液中的任意一种或两种的组合；所述有机氮源为蛋白胨、酵母提取物中的任意一种或几种的组合；发酵培养基的无机氮源为硫酸铵水溶液、氯化铵水溶液或尿素水溶液；发酵培养基的无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐和钙盐中的任意一种或几种的组合；补料培养基中碳源质量百分比为20-70％，；补料培养基中无机氮源在发酵培养基中的质量百分数为20-50％。
8.根据权利要求1所述的一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于，步骤2和步骤3中所述发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖或蔗糖1-3％、蛋白胨1-2％、硫酸铵0.5-2％、磷酸氢二钾0.5-1％、硫酸锰0.02-0.08％、硫酸亚铁0.02-0.08％、硫酸镁0.1-0.3％、L-苏氨酸0.04-0.1％、L-甲硫氨酸0.04-0.1％、维生素B1 0.04-0.1％、烟酰0.04-0.1％、生物素0.04-0.1％，余量为水，pH为6.8-7.2。
9.根据权利要求7所述一种多菌联合发酵制备戊二胺的方法，其特征在于：赖氨酸发酵过程中和赖氨酸脱羧酶发酵过程中的pH都通过体积比为25％的氨水来调节。
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