CN104498542A - 连续法发酵生产l-乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种连续法发酵生产L-乳酸的方法，采用连续法发酵生产L-乳酸，可有效提高乳酸的产量、产率以及生产强度；降低投资的强度。

Description

连续法发酵生产L-乳酸的方法

技术领域

   本发明为生物发酵领域，特别涉及利用微生物发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

L-乳酸是一种重要的有机酸，在食品行业、材料行业有广泛的应用。其作为一种绿色化学品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料领域备受关注。目前，L-乳酸一般采用生物法合成，生产的菌种多为根霉属微生物，如少根根霉Rhizopus arrizhus、米根霉Rhizopus oryzae等。其中，米根霉作为美国FDA认证的安全生产菌株，具有生长迅速、环境适应能力强、分泌有机酸及蛋白质能力强等优势，为有机酸的优秀生产菌种。

传统米根霉生产 L-乳酸的技术中，几乎都采用分阶段的策略，如将乳酸的生产分为菌体生长和酸生产阶段，并以此设计开发了相应的工艺，即：通过提供不同的培养基或者培养策略来适应该分阶段培养技术需求。比如，在菌体生长阶段，提供相应的培养基以供孢子的萌发以及菌体最初的需要，该培养基中富含菌体生长的营养，如蛋白胨、酵母膏、以及含氮的各种粉浆；在生长阶段结束以后，富含营养成分的培养基与具有转化能力的菌体被转运至用于生产的培养基中，经过新环境的生长适应期，菌体生长并进行乳酸的生产，直至发酵结束。其中，分阶段发酵策略最明显的特征即进行的移种操作，移种量通常为发酵液体积的5-15%，通常的生长适应期也从12-24小时不等。该发酵策略带来的技术问题在于，环境的改变会带来迟滞期，迟滞期通常认为是对发酵不利的，如延长发酵的周期，部分菌体由于对环境的改变而失去代谢或者催化能力。为了解决迟滞的问题，现有技术也采取了各种工艺调整，如增加移种的量，虽然可以解决部分问题，但是也带来不利的效果，比如移种量的加大会导致产量下降以及糖酸转化率的降低。

米根霉产L-乳酸的产率、转化率、以及生产强度都可以进一步提高。

发明内容

发明人发现，在较高的葡萄糖浓度下，满足微生物的生长要求，残糖可快速的转化为乳酸。因此，为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种连续法发酵生产L-乳酸的方法。

本发明的技术方案为：连续法发酵生产L-乳酸的方法，其采用（1）经过活化原始菌株，在（2）固体培养原始菌株获得菌株孢子（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触（4）培养菌株并产生含乳酸的培养基（5）分离纯化获得乳酸，其中，步骤（3）至步骤（4）在同一发酵罐中进行。

本发明优选的一种技术方案为：（1）活化原始菌株（2）采用固体培养原始菌株获得菌株孢子（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触培养至（4）菌体生长阶段结束，其中在菌体生长阶段结束以后，通过固液分离，（5）分离部分培养基，（6）继续培养菌株并产生含乳酸的培养基并（7）分离纯化获得乳酸；从而使得在同一发酵罐中进行的发酵过程进一步提高产率、转化率、以及生产强度。

本发明优选的另一中技术方案为：（1）活化原始菌株（2）采用固体培养原始菌株获得菌株孢子（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触培养至（4）菌体生长阶段结束，其中在菌体生长阶段结束以后，通过固液分离，（5）分离部分培养基，在分离后的培养基中，流加入糖含量高于原培养基的糖溶液（6）继续培养菌株并产生含乳酸的培养基并（7）分离纯化获得乳酸；

固液分离所得的培养基，在一个优选的方案中，将该培养基用于下一批次发酵培养基的配置；在另一优选的方案中，将该培养基用于该批次发酵培养基流加糖液的配置。经过该优选方案，实现了培养基的全利用。

本发明的技术方案中，菌株的活化采用平板进行培养，活化后的菌株接入固体培养基，其中采用PDA培养基进行孢子培养，于25-30℃培养5-14天，至平板表面布满气生菌丝并变为褐色或者黑褐色。用无菌生理盐水冲洗获得菌株孢子液，放置于放有无菌玻璃珠的三角瓶中，调节孢子浓度为1-9×10⁹个/mL，4℃保存待用。

在发酵培养时，培养基中含有碳源、氮源与其他营养源。选择的氮源为培养中常见的氮源，包括尿素、硝酸铵、碳酸铵、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏等，其含量根据氮源选择的不同，最适含量在0.5-4 g/L之间，如，优选2 g/L的尿素，或者1 g/L的蛋白胨，或者2 g/L的牛肉膏/L作为氮源进行培养发酵。其他营养源，如磷酸盐，无机盐等营养因子的加入可在不同程度上改变乳酸的产量。

选择的碳源为富含葡萄糖的培养液，本发明的关键还在于提供了连续法生产乳酸的葡萄糖供应的方案。一种方案中，原始培养基中以折合葡萄糖浓度含量计，含有含量为10-80 g/L的葡萄糖，优选60-80 g/L的葡萄糖，在菌体培养生长培养阶段结束后，培养基中的葡萄糖含量为1-20 g/L，优选1-10 g/L，氮源含量为0.01-0.1 g/L。在生长阶段结束以后，采用连续法生产，用固液分离的方法分离出部分培养基，如分离出培养基体积比的5-80%，优选20-50%，再优选20-30%；其中分离培养基体积的比例取决于培养基中葡萄糖的浓度以及流加糖液的浓度的设置。如，在剩余葡萄糖浓度为40 g/L时，选择分离出30%的培养基，至发酵结束。如，在剩余葡萄糖浓度为10 g/L时，选择分离出50%的培养基，并流加600 g/L的糖液，至发酵结束。在另一种方案中，原始培养基中含以折合葡萄糖浓度含量计，含有含量为80-100 g/L的葡萄糖，在菌体培养生长培养阶段结束后，培养基中的葡萄糖含量为1-20 g/L，氮源含量为0.01-0.1 g/L；可选择分离20%发酵液继续发酵。上述方案中，分离后的菌体含量为1.6-2.5g/L（干重），流加糖后的发酵液葡萄糖浓度为50-100 g/L。

本发明中的培养方法方面，通过固体培养获得孢子以后，发酵阶段将孢子接入培养基，其接种的浓度可控制在1.0×10⁶ -1.0×10⁸个/mL，培养温度为25-30℃，通气量为0.2-1 vvm，搅拌速度为200-400 转/分钟。同时，在培养基中加入充足的碳酸钙，以用于保证发酵培养过程中pH值保证在5-6。其中，发酵液占发酵罐总体积的量不超过70%。

本发明中，判断生长阶段与发酵阶段的指标为发酵液中糖浓度、碳氮比以及菌体含量；通常按照发酵时间计，发酵12-24 h即可。同时，在发酵过程中菌体会呈现出不同的发酵形态，本发明中优选球状或者絮状与球状混合的形态。

另外，从经济性的角度来考虑，固液分离获得的培养基，在本发明中可用于下一批次培养基的配置，或者本批次流加糖液的配置，从而实现了培养基的再利用。

本发明中所使用的菌种为米根霉。另外米曲霉、少根根霉等产乳酸的菌种也可实现本发明。

通过以上技术方案，可达到以下有益效果。

（1）实现了乳酸的连续法生产，消除或者缩短了迟滞期，从而提高了乳酸生产的产率、产量以及生产强度。

（2）降低了设备投资的强度，使得能耗降低。

（3）连续法乳酸的生产，有利于后提取工艺。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明所述工艺以及材料进行详细说明。

实施例1

本实施例说明本发明中所使用的菌种的来源。

米根霉 R.oryzae LA-UN-1，该米根霉菌种来源于NRRL-395，经本实验诱变保存。

实施例2

本实施例说明各菌种制备孢子液的过程

各菌种采用PDA培养基进行孢子培养，于25-30℃培养5-14天，至平板表面布满气生菌丝并变为褐色或者黑褐色。用无菌生理盐水冲洗获得菌株孢子液，放置于放有无菌玻璃珠的三角瓶中，调节孢子浓度为1-9×10⁹个/mL，4℃保存待用。

米根霉 R.oryzae LA-UN-1，孢子液编号为R1

其中，PDA的配方为：马铃薯 200克 、葡萄糖 20克、琼脂 15克、 无菌水 1000毫升。121℃灭菌15 min，冷却待用。

实施例3

本实施例说明连续法发酵产乳酸的实施的步骤

     本实施例中，取用实施例2中编号为R1孢子液，在7L的NBS搅拌式发酵罐中进行，其装液量为5L左右。将孢子液在无菌条件下接种在发酵培养液中，于30 ℃培养24 h，通风为0.5 vvm，搅拌速度为300 转/分钟；在培养过程中加入过量灭菌后的碳酸钙，接种后培养基中的孢子浓度为1 × 10⁶个/mL。

发酵24小时后，原位抽滤分离20%的发酵液，流加600g/L的糖液，间歇补料，发酵一定时间后结束发酵。其中，总发酵时间为50 h。

发酵培养液配方为浓度（g/l）：葡萄糖 26，蛋白胨4，磷酸二氢钾 0.2，硫酸镁 0.5。

在接种后，生长阶段结束后，流加高浓度糖液后，以及发酵结束后，分别取样检测发酵过程中的糖浓度、乳酸及生物量含量。

发酵结束以后，根据实际流加糖液浓度与流加重量，并检测残糖浓度，测得总糖流加共计935 g。

其中，糖浓度、乳酸及生物量含量采用文献Fu, Y.Q., Yin, L.F., Zhu, H.Y., Jiang, R., Li, S., Xu Q., 2014. Effects of Pellet characteristics on L-lactic acid Fermentation by R.oryzae: Pellet Morphology, Diameter, Density, and Interior Structure. Appl. Biochem. Biotech., DOI: 10.1007/s12010-014-1146-1.报道的方法。

实施例4

本实施例说明连续法发酵产乳酸的实施的步骤

本实施例与实施例3的区别在于，培养基中的初始糖浓度为20，蛋白胨含量为1.5 g/l，流加的糖浓度情况见检测结果，其他培养条件不变。

发酵结束以后，根据实际流加糖液浓度与流加重量，并检测残糖浓度，测得总糖流加共计955 g。

实施例5

 本实施例说明连续法发酵产乳酸流加糖液的实施的步骤

本实施例与实施例3的区别在于，培养基中的初始糖浓度为22，蛋白胨含量为1.5 g/l，流加的糖浓度情况见检测结果，其他培养条件不变。

发酵结束以后，根据实际流加糖液浓度与流加重量，检测残糖浓度，测得总糖流加共计995 g。

实施例6

 本实施例说明连续法发酵产乳酸流加糖液的实施的步骤

本实施例与实施例3的区别在于，培养基中的初始糖浓度为18，蛋白胨含量为2 g/l，流加的糖浓度情况见检测结果，其分离出的培养液体积为总培养液体积的30%，其他条件不变。

发酵结束以后，根据实际流加糖液浓度与流加重量，并检测残糖浓度，测得总糖流加共计945 g。

   实施例7

本实施例说明连续法发酵产乳酸流加糖液的实施的步骤

本实施例与实施例3的区别在于，培养基中的初始糖浓度为10，蛋白胨含量为2 g/L，流加的糖浓度情况见检测结果，其分离出的培养液体积为总培养液体积的30%，其他条件不变。

发酵结束以后根据实际流加糖液浓度与流加重量，并检测残糖浓度，测得总糖流加共计950 g。

实施例3-7实施结果

注：生产阶段的生产强度以总发酵时间计，耗糖强度以生产阶段时间计

注：生产强度1以总发酵时间计，生产强度2以生产阶段时间计，耗糖强度以生产阶段时间计

  对比实施例1

对比实施例1说明二级扩配发酵产乳酸的实施步骤及结果

在对比实施例1中，也选取实施例2中编号为R1孢子液。在一级培养阶段，在3L NBS搅拌式培养罐中，采用与实施例3完全一致的培养基与培养条件培养24h，发酵液体积为1L。

在培养结束后，将所有培养液以及菌体转入另一7L NBS搅拌式培养罐中，7L罐中的培养基含量为4L。且保证接入菌体后，该培养液的糖含量为180 g/L左右。按照实施例3的培养条件发酵至结束。其中，总发酵时间为72h。

  对比实施例2

对比实施例2说明分离出培养液用于糖流加液配制对连续法发酵产乳酸的影响

本实施例与实施例3的区别在于，选用的糖流加液采用同一批次分离所得的培养基经灭菌、过滤、糖液配制获得，其他条件不变。

发酵结束以后，根据实际流加糖液浓度与流加重量，并检测残糖浓度，测得总糖流加共计1005 g。

对比实施例3

对比实施例3说明不同的培养基分离量对连续法发酵产乳酸的影响

本实施例与实施例3的区别在于，其分离出的培养液体积为总培养液体积的50%，其他条件不变。

发酵结束以后，根据实际流加糖液浓度与流加重量，并检测残糖浓度，测得总糖流加共计1070 g。

对照实施例，重复实施例3作为对照试验

对比实施例1-3实施结果

注：生产强度1以总发酵时间计，生产强度2以生产阶段时间计，耗糖强度以生产阶段时间计。

Claims (9)

1.连续法发酵生产L-乳酸的方法，采用如下步骤进行乳酸的合成

（1）活化原始菌株

（2）采用固体培养原始菌株获得菌株孢子

（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触

（4）培养菌株并产生含乳酸的培养基

（5）分离纯化获得乳酸

其特征在于，步骤（3）至步骤（4）在同一发酵罐中进行。

2.根据权利要求1所述的方法，采用如下步骤进行乳酸的合成

（1）活化原始菌株

（2）采用固体培养原始菌株获得菌株孢子

（3）将所 述孢子与发酵罐中的原始培养基接触培养

（4）菌体生长阶段结束

其特征在于：（5）分离部分培养基，（6）继续培养菌株并产生含乳酸的培养基并（7）分离纯化获得乳酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，分离部分的培养基占总培养基体积比的5-80%，优选20-50%，再优选20-30%。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

步骤（3）所述原始培养基含葡萄糖，以折合葡萄糖浓度含量计，含量为10-80 g/L，优选60-80 g/L；

步骤（3）所述原始培养基还含有氮源，且氮源含量折合无机氮含量为0.5-4 g/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

步骤（4）所述菌体生长阶段结束时，培养基中的糖分含量，以折合葡萄糖浓度含量计，含量为1-20 g/L，优选1-10 g/L。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（5）分离部分培养基后，在培养基中加入糖含量高于分离部分培养基的糖溶液，流加糖后的培养基中葡萄糖含量为50-100 g/L。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将步骤（5）分离出的培养基用于下一批次或者该批次发酵培养基的配置。

8.权利要求1-7任一所述的培养基中还包括碳酸钙，培养基的pH值保持在5-6之间。

9.上述任一权利要求所述的菌为米根霉。