CN106755142A - 米根霉菌体全细胞催化制备l‑乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种米根霉菌体全细胞催化制备L‑乳酸的方法，该方法中米根霉菌体培养18‑24小时后，过滤，回收菌体，将回收后的菌体置入催化反应器中，以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，直至反应至菌体培养液基本成固状且糖耗在5g/l以下结束，过滤，分离菌体和乳酸钙，回收的菌体继续在催化反应器中以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，如此循环，直到菌体催化效率明显降低为止。本发明利用米根霉菌体进行全细胞催化制备L‑乳酸，菌体在催化多次循环利用后，L‑乳酸的产量、生产强度、糖酸转化率均未有显著改变。

Description

米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用米根霉菌体进行全细胞催化制备L-乳酸的方法，具体涉及一种利用高密度米根霉细胞，进行全细胞催化，高通量和快速合成L-乳酸的生产工艺。
背景技术
L-乳酸是一种重要的有机酸，在食品行业、材料行业有广泛的应用。其作为一种绿色化学品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料领域备受关注。米根霉是微生物合成纯L-乳酸的主要菌株。目前，米根霉发酵生产L-乳酸最主要的问题是产量低(60-120g/l)，生产强度低(0.7-2.5g/l/h)，糖酸转化率低(90％以下)，从而导致米根霉很难应用于L-乳酸的生产。
传统米根霉生产L-乳酸的技术中，几乎都采用分阶段的策略，如将乳酸的生产分为菌体生长和酸生产阶段，并以此设计开发了相应的工艺，即：通过提供不同的培养基或者培养策略来适应该分阶段培养技术需求。比如，在菌体生长阶段，提供相应的培养基以供孢子的萌发以及菌体最初的需要，该培养基中富含菌体生长的营养，如蛋白胨、酵母膏、以及含氮的各种粉浆；在生长阶段结束以后，富含营养成分的培养基与具有转化能力的菌体被转运至用于生产的培养基中，经过新环境的生长适应期，菌体生长并进行乳酸的生产，直至发酵结束。其中，分阶段发酵策略最明显的特征即进行的移种操作，移种量通常为发酵液体积的5-15％，通常的生长适应期也从12-24小时不等。该发酵策略带来的技术问题在于，环境的改变会带来迟滞期，迟滞期通常认为是对发酵不利的，如延长发酵的周期，部分菌体由于对环境的改变而失去代谢或者催化能力。为了解决迟滞的问题，现有技术也采取了各种工艺调整，如增加移种的量，虽然可以解决部分问题，但是也带来不利的效果，比如移种量的加大会导致产量下降以及糖酸转化率的降低。
发明人而在后期的研究过程中，发现，米根霉菌体培养和产酸可以在同一个培养基中连续进行(可参见发明专利：连续法发酵生产L-乳酸的方法，公开号：CN104498542A)，在这种工艺条件下，米根霉发酵生产L-乳酸的菌体量增加了，同时减少了发酵阶段的延滞期，从而使L-乳酸生产强度和产量得到了极大地提高。然而，该方法虽然能极大地提高乳酸产量和生产强度，但在进行多批次操作过程中，还存在缺陷，不利于菌体多批次循环使用。在一步连续发酵的基础上，还需进一步高效利用米根霉菌体，实现米根霉细胞多批次循环使用。
发明内容
传统的连续发酵的工艺是孢子液接入到培养液中，前期进行米根霉菌体的培养，当培养至18-24h时(此时开始有乳酸生成)，减少发酵液体体积至原体积的50％-70％，菌体量保持不变，即增加菌体密度，继续进行产酸。该工艺经验证能极大地提高乳酸的生产强度，缩短发酵时间，同时，采用连续补料发酵，乳酸的产量也得到了极大的提高，但是该工艺存在如下弊端还有待改进：连续培养过程中，发酵结束后，发酵液较为粘稠，多以乳酸钙为主，在无菌操作条件下，菌体与发酵液分离较为困难，菌体较难回收，不利于后期菌体的二次利用，造成菌体的利用率下降，增加生产成本，存在弊端，不利于工业化生产；在乳酸发酵过程中，氮源量较少(培养开始时，添加2-3g/l蛋白胨，蛋白胨基本上用于菌体生长)，因此，发酵体系中，氮源主要用于米根霉生长，而发酵期，氮源量较少，菌体生成量较低。氮源主要用于维持细胞代谢，基于此，本发明改进一步发酵工艺，提出全细胞催化制备乳酸。
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种高效利用米根霉菌体，实现米根霉细胞多批次循环使用的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，该方法包括将米根霉孢子液接入到菌体培养液中进行米根霉菌体培养，米根霉菌体培养18-24小时后，过滤，回收菌体，将回收后的菌体置入催化反应器中，以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，直至反应至菌体培养液基本成固状且糖耗在5g/l以下结束，过滤，分离菌体和乳酸钙，回收的菌体继续在催化反应器中以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，如此循环，直到菌体催化效率降至50％以下。
该工艺极大地简化乳酸合成工艺，降低生产成本，同时增加菌体的使用次数。
所述的通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应具体为：当葡萄糖耗至5g/l以下，补加葡萄糖，每次补糖30-60g/l，继续在催化反应器中与菌体培养液进行催化反应，直至反应至菌体培养液基本成固状且糖耗在5g/l以下结束。上述补加葡萄糖总量为160-200g/l。
全细胞乳酸催化反应过程中乳酸转化温度30℃，搅拌速度100-150r/min。
米根霉菌体培养采用的条件为5L发酵罐培养，30℃，转速150-300r/min，通气量0.5-1vvm，培养18-24h。得到米根霉细胞。
米根霉菌体培养采用的菌体培养液：葡萄糖20-40g/l，蛋白胨3-5g/l，KH2PO4 0.2-0.4g/l，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g/l。
制备孢子液过程如下：将米根霉菌体放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，在30℃的温度下培养7天，然后用无菌水把PDA表面的真菌孢子洗下来，浓度为1*108个孢子/ml。
米根霉菌种可以为米根霉NRRL-395，来源R.oryzae LA-UN-1；也可以选择通用米根霉菌种。
与现有技术比较本发明的有益效果：一步连续发酵过程中，前期采用无菌发酵培养得到米根霉菌体，后期产酸阶段，本发明改变传统的无菌发酵模式，利用米根霉菌体进行全细胞催化制备L-乳酸，菌体在催化多次循环利用后，L-乳酸的产量、生产强度、糖酸转化率均未有显著改变。因此，利用米根霉全细胞催化制备L-乳酸，具有更大的优势，更有利于大规模生产。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1
米根霉菌体放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，在30℃的温度下培养七天。然后用无菌水把PDA表面的真菌孢子洗下来，浓度为1*108个孢子/ml，并放置在在4℃的环境中保存。
5L发酵罐培养，5L发酵罐装液量为3L培养液，取50ml浓度108个/ml的孢子液加入发酵罐，200-300r/min，通气量1vvm，30℃培养24h后，过滤，得到米根霉菌体细胞，过滤液作为催化体系的催化液继续使用。
菌体培养基：葡萄糖2g/l，蛋白胨3g/l，KH2PO4 0.2g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l。
将得到的米根霉菌体细胞，经过滤后，分别取2g干重/L，4g干重/L，6g干重/L，8g干重/L，10g干重/L的米根霉菌体细胞，置于1000ml的三口反应瓶，装液量为500ml，以菌体培养液(菌体培养液是前述发酵罐培养菌体得到的过滤液)为催化体系，添加碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进入反应瓶，进行全细胞催化实验，每次补糖50g/l，当糖耗至5g/l以下，继续补糖，补糖总量为160g/l(考虑到催化液基本成固状，不利于转化)，反应至糖耗在5g/l以下结束。L-乳酸转化温度30℃，搅拌速度100r/min。
表1不同细胞浓度对细胞催化的影响
可以看出，随着菌体量的增加，其催化效果越好，当菌体量达到10g/l时，其生产强度达到了4.74g/l/h，基本与细菌合成L-乳酸的生产强度相当。以10g/l菌体量为标准，继续考察循环催化生产L-乳酸的效率变化。
每一次催化，都是以总糖160g/l为基准，10g/l菌体干重为催化量，每次催化技术后，用水过滤菌体，后继续置入催化液进行催化，只到循环催化10批次。
表2循环次数对催化的影响
从表2中可以看出，利用米根霉全细胞催化合成L-乳酸，当催化合成10批次后，乳酸的产量，生产强度并未有较大变化，可见，利用米根霉全细胞催化合成L-乳酸，突破了传统的米根霉发酵合成L-乳酸的瓶颈限制，已经具备了工业化生产的能力。
对比例1
按照CN104498542A实施例步骤生产L-乳酸，实验结果如表3：
表3
表4
从表3-4中可以看出，利用一步发酵法生产L-乳酸，在菌体利用一次时，乳酸产量和转化率相对较高，但随着循环批次的进行，乳酸产量和生产强度都明显下降，循环六次时，本工艺的乳酸产量和生产强度都比连续发酵提高了69％和300％。

Claims (7)

1.一种米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，该方法包括将米根霉孢子液接入到菌体培养液中进行米根霉菌体培养，其特征在于米根霉菌体培养18-24小时后，过滤，回收菌体，将回收后的菌体置入催化反应器中，以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，直至反应至菌体培养液成固状且糖耗在5g/l以下结束，过滤，分离菌体和乳酸钙，回收的菌体继续在催化反应器中以菌体培养液为催化体系，过量的碳酸钙作为中和剂，通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应，如此循环，直至菌体催化效率降至50％以下。
2.根据权利要求1所述的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，其特征在于通过补加葡萄糖进行全细胞乳酸催化反应具体为：当葡萄糖耗至5g/l以下，补加葡萄糖，每次补糖30-60g/l，继续在催化反应器中与菌体培养液进行催化反应，直至反应至菌体培养液基本成固状且糖耗在5g/l以下结束。
3.根据权利要求1所述的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，其特征在于，补加葡萄糖总量为160-200g/l。
4.根据权利要求1所述的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，其特征在于全细胞乳酸催化反应过程中乳酸转化温度30℃，搅拌速度100-150r/min。
5.根据权利要求1所述的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，其特征在于米根霉菌体培养采用的条件为30℃，转速150-300r/min，通气量0.5-1vvm，培养18-24h。
6.根据权利要求1所述的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，其特征在于所述的菌体培养液为：葡萄糖20-40g/l，蛋白胨3-5g/l，KH2PO4 0.2-0.4g/l，MgSO4·7H2O 0.2-0.4g/l,5L。
7.根据权利要求1所述的米根霉菌体全细胞催化制备L-乳酸的方法，其特征在于制备孢子液过程如下：将米根霉菌体放在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，在30℃的温度下培养7天，然后用无菌水把PDA表面的真菌孢子洗下来，浓度为1*108个孢子/ml。
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