CN105112473A - 一种低聚果糖-新科斯糖的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低聚果糖-新科斯糖的生产工艺，其主要是利用法夫酵母固定化细胞多次重复使用，采用包埋法固定化法夫酵母细胞进行低聚果糖-新科斯糖连续高强度生产，缩短生产周期、提高新科斯糖的产率、降低生产成本，使工业大规模生产低聚果糖-新科斯糖获得成功，具有良好应用前景。

Description

一种低聚果糖-新科斯糖的生产工艺

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种低聚果糖-新科斯糖的生产工艺。

背景技术

蔗果低聚糖又称寡果糖或低聚果糖，广泛存在于天然水果和蔬菜中，不仅口感良好，而且具有优良的生理功能。它能促进肠道双歧杆菌增殖，调节肠道菌群平衡，改善和调节肠道功能，防治便秘和腹泻；另外，具有低能量或无能量、预防龋齿、降低血清胆固醇、降低血脂和血压等功效。通常生产得到的低聚果糖包括有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，都呈线性分子，即都是1F型，对于6G型的低聚果糖(如新科斯糖)研究甚少。目前工业上主要利用黑曲霉Aspergillusniger，青霉Penicilliumcitrinum，运动单胞菌Zymomonasmobilis，乳杆菌Lactobacillusreutri等来生产低聚果糖。日本的Hayashi曾经用桔青霉(Penicilliumcitrinum)发酵产得1-kestose，nystose，neokestose，产量分别为22％，14％和11％。H.Atiyeh用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵得6-kestose，neokestose，1-kestose，产量分别为61.5％，29.7％和8.8％，产量都不高。

新科斯糖(neokestose)是一种蔗果三糖族低聚糖，由果糖基C-2与蔗糖分子中的葡萄糖基C-6位相连所得，它除具有普通低聚果糖所具有的多项生理功能外，又具有更为优越的促双歧杆菌增殖能力，因此被称为高效益生元。目前国内外对于新科斯糖的开发应用都暂时为空白。

固定化细胞(cellimmobilization)培养是20世纪中期兴起的一种新型生物技术，是指利用物理或化学手段将游离的细胞或酶与固态的不溶性载体相结合，使其保持活性并反复使用的一种技术。与传统分批游离发酵相比，利用固定化微生物技术具有细胞负荷高、生物催化高效、细胞可反复使用等优点，并可获得高的目标产量和原料转化率，易于实现细胞与产物分离，有利于实现工艺过程的自动化、连续化，降低成本，具体表现在：(1)生物反应器中可以获得极高的菌体浓度，因而发酵速率可以大大提高，反应器设备的生产强度得以强化；(2)产物分离纯化过程中菌体从发酵液中的分离十分容易；(3)固定化细胞可以重复或长期使用，这样既能够简化游离细胞过程需要不断培养菌体的操作，又减少了营养物质的浪费，提高了生产率。

在各种固定化技术中，天然高分子和合成高分子材料的吸附和包埋是研究最活跃的微生物细胞固定化方法，然而采用固定化细胞制备新科斯糖还未见有专利报道。本发明采用包埋法固定化法夫酵母细胞进行新科斯糖连续高强度生产，工业应用意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用法夫酵母固定化细胞多次重复使用，缩短生产周期、提高新科斯糖的产率、降低生产成本，使大规模生产新科斯糖成为了可能。

本发明的技术方案是：固定化细胞连续生产新科斯糖的方法，包括如下步骤：

(1)法夫酵母SJK01的培养，包括种子培养和发酵罐培养；

(2)固定化法夫酵母的制备；

(3)10L罐单罐连续反应制备新科斯糖；

(4)产物的分离纯化。

本发明的具体工艺步骤及工艺条件如下：

步骤(1)，法夫酵母SJK01菌体的制备：

从斜面上挑一环菌体于含25mL种子培养基的250mL摇瓶中，18～28℃，180r/min摇床培养24～48h，制得一级种子液；再将一级种子培养液接种到含100mL种子培养基的500mL锥形瓶中，18～28℃，180r/min摇床培养24～48h，得二级种子液；以接种量10～15％将二级种子液接入发酵罐，pH6.0～6.5，培养温度18～28℃，通风量为0.6～1.0vvm，搅拌转速为160～220r/min，发酵时间24～48h，发酵液以4℃、5000rpm离心10min获得法夫酵母菌体。

其中：

种子培养基组成为：蔗糖10～50g，蛋白胨3～8g，酵母膏2～8g，麦芽汁2～6g，水1000mL，pH6.0～6.5；

发酵培养基组成为：蔗糖30～100g，蛋白胨3～8g，酵母膏2～8g，麦芽汁2～6g，水1000mL，pH6.0～6.5。

步骤(2)中，法夫酵母固定化：

将质量百分比浓度为4％～8％的聚乙烯醇(PVA)和1％～4％的海藻酸钠(SA)混合溶液高压灭菌，冷却后与等体积细胞浓度为150～300g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约为1.00～4.00mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50～100drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入含有浓度为2％～4％CaCl2无菌溶液的10L搅拌式发酵罐中，控制固定化载体直径2.0-5.0mm范围，固化2～8h后，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得直径2.0-5.0mm的固定化细胞。

步骤(3)中，10L罐连续反应制备新科斯糖：

向含有固定化细胞(约占4L体积)的10L搅拌式发酵罐接入浓度为100～300g/L的无菌蔗糖溶液4L，催化反应温度为18～22℃，通入无菌氧气搅拌，搅拌转速为100～200r/min促进蔗糖转化为新科斯糖。第一批次反应24h，以后连续发酵9个批次，每次反应时间为16h。每个批次反应结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截留固定化细胞，补加新鲜蔗糖溶液，进行下一次反应。每一批次的新科斯糖的转化率均大于56％，杂质少，菌体蛋白浓度小于0.2％，利于后续的分离纯化。

步骤(4)中，新科斯糖的分离纯化包括以下步骤：

A、往发酵液中加入活性炭脱色，活性炭加入量为发酵液体积的0.2～1％，脱色温度为70℃；

B、将脱色液稀释到糖浓度为15-25％，采用截留分子量为300D的滤膜进行纳滤，操作压力4-6psi，可以有效地除去发酵液中的单糖等杂质；

C、将纳滤浓缩液经真空减压浓缩，即可得到纯度为90％以上的新科斯糖浆状物，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60℃；

D、将上步骤的浆状物进行真空冷冻干燥，即得白色或微黄色粉末。

所述的(1)步骤中的发酵培养条件为：发酵液接种量为10～15％，pH6.0～6.5，培养温度18～28℃，通风量为0.6～1.0vvm，搅拌转速为160～220r/min，发酵时间24～48h。

本发明提供的利用法夫酵母固定化细胞连续生产新科斯糖的方法，适用于以海藻酸钠、海藻酸钙、明胶、聚乙烯醇凝胶、琼脂、聚氨酯、光硬化树脂或聚丙烯酸凝胶等为固定化介质，固定化法夫酵母细胞催化合成新科斯糖。本发明采用聚乙烯醇和海藻酸钠混合载体包埋细胞，克服了这两种单一载体的缺点，具有传质性能好，固定化可操作性好，包埋活菌活性高的特点。本发明固定化酵母具有反应迅速、抗污染能力强、可连续使用、产物分离方便等优点，非常适合工业化生产，本发明为工业化生产新科斯糖提供了一种有效的方法。

本发明所取得的技术进步在于：

第一，固定化细胞使用寿命长，以固定化细胞为催化剂，可以连续催化合成新科斯糖至少长达170h，至少是游离细胞(24h)的7倍，这不但降低了原料消耗，而且节约了能耗，大大降低了生产成本；

第二，产物纯度较高，利用固定化细胞转化合成新科斯糖，一方面可以避免游离细胞在催化过程中因破碎、死亡所产生的蛋白和其他氨基酸杂质；另一方面，可以避免细胞与反应液直接混合，给后续产物分离纯化带来困难；

第三，本发明中重复发酵10批次均能保持较高的发酵强度，每一批次的新科斯糖的转化率大于56％，且持续发酵10批次后没有检测到杂菌，完全适应工业化规模发酵要求。

附图说明

图1显示出本发明的使用法夫酵母制取新科斯糖的新技术工艺。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)菌体的制备：

从斜面上挑一环菌体于含25mL培养基的250mL摇瓶中，18℃，180r/min摇床培养48h，制得一级种子液；再将一级种子培养液接种到含100mL上述培养基的500mL锥形瓶中，18℃，180r/min摇床培养48h得二级种子液；以接种量10％将二级种子液接种发酵罐，pH6.0，培养温度18℃，通风量为0.6vvm，搅拌转速为160r/min，发酵时间24h，发酵液以4℃、5000rpm离心10min获得法夫酵母菌体。

种子培养基组成为：蔗糖10g，蛋白胨3g，酵母膏2g，麦芽汁2g，水1000mL，pH6.0；

发酵培养基组成为：蔗糖30g，蛋白胨3g，酵母膏2g，麦芽汁2g，水1000mL，pH6.0。

(2)细胞的固定化：

将质量百分比浓度为4％的聚乙烯醇(PVA)和4％的海藻酸钠(SA)混合溶液高压灭菌，冷却后与等体积细胞浓度为150g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约为1.00mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调剂蠕动泵速度至50drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入含有浓度为4％CaCl2无菌溶液的10L搅拌式发酵罐中，控制固定化载体直径2.0-3.0mm范围，固化2h后，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得直径2.0-3.0mm的固定化细胞。

(3)10L罐连续反应生产新科斯糖：

向含有固定化细胞(约占4L体积)的10L搅拌式发酵罐接入浓度为100g/L的无菌蔗糖溶液4L，催化反应温度为18℃，通入无菌氧气搅拌，搅拌转速为100r/min促进蔗糖转化为新科斯糖。第一批次反应24h，以后连续发酵9个批次，每次反应时间为16h。每个批次反应结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截留固定化细胞，补加新鲜蔗糖溶液，进行下一次反应。每一批次的新科斯糖转化率均大于56％，该糖浓度大于83.1g/L，菌体蛋白浓度小于0.2％。

(4)新科斯糖的分离纯化，包括以下步骤：

A、向10L发酵罐反应液中加入0.5％体积的活性炭脱色，脱色温度为70℃；

B、将脱色液稀释到糖浓度为15％，采用截留分子量为300D的滤膜进行纳滤，操作压力4psi，可以有效地除去发酵液中的单糖等杂质；

C、将纳滤浓缩液经真空减压浓缩，即可得到纯度为90％以上的新科斯糖浆状物，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60℃；

D、把经过C步骤的浆状物进行真空冷冻干燥，即得白色或微黄色粉末。

实施例2

(1)菌体的制备：

从斜面上挑一环菌体于含25mL培养基的250mL摇瓶中，22℃，180r/min摇床培养32h，制得一级种子液；再将一级种子培养液接种到含100mL上述培养基的500mL锥形瓶中，22℃，180r/min摇床培养32h得二级种子液；以接种量12％将二级种子液接种发酵罐，pH6.2，培养温度22℃，通风量为0.8vvm，搅拌转速为200r/min，发酵时间32h，发酵液以4℃、5000rpm离心10min获得法夫酵母菌体。

种子培养基组成为：蔗糖30g，蛋白胨5g，酵母膏4g，麦芽汁4g，水1000mL，pH6.2；

发酵培养基组成为：蔗糖60g，蛋白胨5g，酵母膏4g，麦芽汁4g，水1000mL，pH6.2。

(2)细胞的固定化：

将质量百分比浓度为6％的聚乙烯醇(PVA)和2％的海藻酸钠(SA)混合溶液高压灭菌，冷却后与等体积细胞浓度为200g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约为3.00mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调剂蠕动泵速度至75drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入含有浓度为3％CaCl2无菌溶液的10L搅拌式发酵罐中，控制固定化载体直径3.0-4.00mm范围，固化4h后，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得直径3.0-4.00mm的固定化细胞。

(3)10L罐连续反应生产新科斯糖：

向含有固定化细胞(约占4L体积)的10L搅拌式发酵罐接入浓度为200g/L的无菌蔗糖溶液4L，催化反应温度为20℃，通入无菌氧气搅拌，搅拌转速为150r/min促进蔗糖转化为新科斯糖。第一批次反应24h，以后连续发酵9个批次，每次反应时间为16h。每个批次反应结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截留固定化细胞，补加新鲜蔗糖溶液，进行下一次反应。每一批次的新科斯糖转化率大于56％，该糖浓度大于110.9g/L，菌体蛋白浓度小于0.2％。

(4)新科斯糖的分离纯化，包括以下步骤：

A、向10L发酵罐反应液中加入0.7％体积的活性炭脱色，脱色温度为70℃；

B、将脱色液稀释到糖浓度为20％，采用截留分子量为300D的滤膜进行纳滤，操作压力5psi，可以有效地除去发酵液中的单糖等杂质；

C、将纳滤浓缩液经真空减压浓缩，即可得到纯度为90％以上的新科斯糖浆状物，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60℃；

D、把经过C步骤的浆状物进行真空冷冻干燥，即得白色或微黄色粉末。

实施例3

(1)菌体的制备：

从斜面上挑一环菌体于含25mL培养基的250mL摇瓶中，28℃，180r/min摇床培养24h，制得一级种子液；再将一级种子培养液接种到含100mL上述培养基的500mL锥形瓶中，28℃，180r/min摇床培养24h得二级种子液；以接种量15％将二级种子液接种发酵罐，pH6.5，培养温度28℃，通风量为1.0vvm，搅拌转速为220r/min，发酵时间24h，发酵液以4℃、5000rpm离心10min获得法夫酵母菌体。

种子培养基组成为：蔗糖50g，蛋白胨8g，酵母膏8g，麦芽汁6g，水1000mL，pH6.5；

发酵培养基组成为：蔗糖100g，蛋白胨8g，酵母膏8g，麦芽汁6g，水1000mL，pH6.5。

(2)细胞的固定化：

将质量百分比浓度为8％的聚乙烯醇(PVA)和1％的海藻酸钠(SA)混合溶液高压灭菌，冷却后与等体积细胞浓度为300g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约为4.00mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调剂蠕动泵速度至100drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入含有浓度为4％CaCl2无菌溶液的10L搅拌式发酵罐中，控制固定化载体直径4.0-5.0mm范围，固化2～8h后，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得直径4.0-5.0mm的固定化细胞。

(3)10L罐连续反应生产新科斯糖：

向含有固定化细胞(约占4L体积)的10L搅拌式发酵罐接入浓度为300g/L的无菌蔗糖溶液4L，催化反应温度为22℃，通入无菌氧气搅拌，搅拌转速为200r/min促进蔗糖转化为新科斯糖。第一批次反应24h，以后连续发酵9个批次，每次反应时间为16h。每个批次反应结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截留固定化细胞，补加新鲜蔗糖溶液，进行下一次反应。每一批次的新科斯糖转化率大于57％，该糖浓度大于168.5g/L，菌体蛋白浓度小于0.2％。

(4)新科斯糖的分离纯化，包括以下步骤：

A、向10L发酵罐反应液中加入0.5％体积的活性炭脱色，脱色温度为70℃；

B、将脱色液稀释到糖浓度为25％，采用截留分子量为300D的滤膜进行纳滤，操作压力6psi，可以有效地除去发酵液中的单糖等杂质；

C、将纳滤浓缩液经真空减压浓缩，即可得到纯度为90％以上的新科斯糖浆状物，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60℃；

D、把经过C步骤的浆状物进行真空冷冻干燥，即得白色或微黄色粉末。

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种新科斯糖的制备方法，主要包括如下步骤：

步骤(1)，法夫酵母SJK01菌体的制备：

从斜面上挑一环菌体于含25mL种子培养基的250mL摇瓶中，18～28℃，180r/min摇床培养24～48h，制得一级种子液；再将一级种子培养液接种到含100mL种子培养基的500mL锥形瓶中，18～28℃，180r/min摇床培养24～48h，得二级种子液；以接种量10～15％将二级种子液接入发酵罐，pH6.0～6.5，培养温度18～28℃，通风量为0.6～1.0vvm，搅拌转速为160～220r/min，发酵时间24～48h，发酵液以4℃、5000rpm离心10min获得法夫酵母菌体；

其中：种子培养基组成为：蔗糖10～50g，蛋白胨3～8g，酵母膏2～8g，麦芽汁2～6g，水1000mL，pH6.0～6.5；

发酵培养基组成为：蔗糖30～100g，蛋白胨3～8g，酵母膏2～8g，麦芽汁2～6g，水1000mL，pH6.0～6.5；

步骤(2)，法夫酵母固定化：

将质量百分比浓度为4％～8％的聚乙烯醇(PVA)和1％～4％的海藻酸钠(SA)混合溶液高压灭菌，冷却后与等体积细胞浓度为150～300g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约为1.00～4.00mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50～100drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入含有浓度为2％～4％CaCl2无菌溶液的10L搅拌式发酵罐中，控制固定化载体直径2.0-5.0mm范围，固化2～8h后，无菌正压排出剩余氯化钙液体，制得直径2.0-5.0mm的固定化细胞；

步骤(3)，10L罐连续反应制备新科斯糖：

向含有固定化细胞的10L搅拌式发酵罐接入浓度为100～300g/L的无菌蔗糖溶液4L，催化反应温度为18～22℃，通入无菌氧气搅拌，搅拌转速为100～200r/min促进蔗糖转化为新科斯糖；第一批次反应24h，以后连续发酵9个批次，每次反应时间为16h；每个批次反应结束时，通过罐体内置旋浆过滤器正压无菌操作截留固定化细胞，补加新鲜蔗糖溶液，进行下一次反应；每一批次的新科斯糖的转化率均大于56％，杂质少，菌体蛋白浓度小于0.2％，利于后续的分离纯化；

步骤(4)，新科斯糖的分离纯化包括以下步骤：

A、往发酵液中加入活性炭脱色，活性炭加入量为发酵液体积的0.2～1％，脱色温度为70℃；

B、将脱色液稀释到糖浓度为15-25％，采用截留分子量为300D的滤膜进行纳滤，操作压力4-6psi，可以有效地除去发酵液中的单糖等杂质；

C、将纳滤浓缩液经真空减压浓缩，即可得到纯度为90％以上的新科斯糖浆状物，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60℃；

D、将上步骤的浆状物进行真空冷冻干燥，即得白色或微黄色粉末。