CN102174600B

CN102174600B - 一种连续发酵生产l-乳酸的方法

Info

Publication number: CN102174600B
Application number: CN 201010624057
Authority: CN
Inventors: 李荣杰; 崔刚; 杨丽
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102174600A

Abstract

本发明提供了一种连续发酵生产L-乳酸的方法。该方法以农作物废弃物糖化液为碳源通过乳酸菌(Lactobacillus)连续发酵生产L-乳酸，一次接种增殖，菌体多次重复利用，减少了菌种制备的工作量，简化了发酵工艺，降低了劳动强度；另外，菌种经过连续发酵驯化，L-乳酸发酵周期由50～55小时缩短至24～30小时，L-乳酸的发酵强度显著提高，生产效率提高了50％以上。本发明过程简单，连续性强，易应用于工业生产，可显著降低L-乳酸的生产成本。

Description

一种连续发酵生产L-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种连续发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

乳酸是一种重要的有机酸，学名α-羟基丙酸，在分子结构中有一个不对称碳原子，因此乳酸存在两种异构体，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作为一种重要的生物化工原料，L-乳酸被广泛应用于食品、医药、现代农业、日用化工、有机化工等领域，覆盖大量产品。

乳酸可以通过化学合成或碳水化合物发酵得到，但是基于发酵法能够专一性地得到L-乳酸或D-乳酸，因此发酵法被广泛用于L-乳酸的生产。乳酸杆菌发酵生产乳酸具有光学纯度高、发酵强度显著提高等特点，因此，利用乳酸杆菌发酵生产乳酸成为大规模生产L-乳酸的趋势。

目前用于L-乳酸生产的原料主要有淀粉、糖蜜、乳清水等。为了降低L-乳酸的制备成本，提高乳酸生产质量，国内外对乳酸生产的研究，主要集中在低价原料的开发利用、提高发酵强度、优化乳酸分离提取工艺这三个方面。

农作物废弃物如作物秸秆、玉米芯等可作为低价原料的开发对象。我国是玉米生产大国，也是玉米纤维资源浪费大国，仅玉米芯每年就浪费掉1000万吨，同时也引发了许多环境问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种连续发酵生产L-乳酸的方法，用以解决现有乳酸生产发酵成本高的问题。

为实现上述目的，本发明以农作物废弃物的糖化液为碳源，利用乳酸菌(Lactobacillus)连续发酵生产L-乳酸。具体地，该方法包括如下步骤：

1)将农作物废弃物粉碎后，采用稀碱液、稀酸液、纤维素酶依次处理，制得含糖质量百分比为10％～20％的糖化液；

2)将乳酸菌接种到发酵培养基中，接种量5～10％，发酵温度为30～50℃，200rpm进行厌氧搅拌发酵；当乳酸含量不再增加时发酵结束，停止搅拌，放出80％～85％体积的发酵液，补入新发酵培养基继续发酵，连续循环发酵5～10批次作为一代；其中，以步骤1)制得的糖化液为碳源，第一代连续发酵培养基的质量百分比配置如下：总糖10％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％；

3)以上一代的发酵液按5～10％的接种量接种到新鲜的发酵培养基中，按步骤2)的方法连续发酵5～10批次；连续发酵驯化3～4代；其中，以步骤1)制得的糖化液为碳源，第二代连续发酵培养基的质量百分比配置如下：总糖15％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％；以步骤1)制得的糖化液为碳源，第三或四代连续发酵培养基的质量百分比配置如下：总糖20％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％。

如无特别说明，本发明培养基中未注明的其它成分为水。

所述农作物废弃物包括但不限于作物秸秆、玉米芯等。

所述步骤1)制备糖化液的方法为，于反应器中按固液比1∶4～6(w/w)向粉碎的农作物废弃物中加入2％(w/v)的稀碱液，封口后在125℃条件下加热处理50分钟，所得浆液在2000rpm离心机内离心；所得固相经水洗后加入容器中，按固液比1∶5～8(w/w)加入2％(v/v)的稀酸液，调节温度到50℃处理1h，再按照20单位/g纤维素加入纤维素酶，搅拌转速100rpm，酶解时间控制在60～70小时。

所述稀碱液可以是氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水中的一种或几种。

所述稀酸液可以是盐酸、硫酸、醋酸中的一种或几种。

上述优选的发酵条件是：按8％的接种量接入乳酸菌种子液，在35～45℃、200rpm厌氧条件下发酵，发酵至乳酸含量不再增加，结束发酵。

其中，乳酸菌种子液可按照如下方法制备：

平板培养：将乳酸菌种接种到活化培养基中，30℃培养40小时；

摇瓶种子培养：将平板培养的乳酸菌种接种到种子液体培养基中，38℃厌氧培养20小时，摇床转速200rpm，检测OD₆₀₀为4.0。

其中，以上述步骤1)制得的糖化液为碳源，平板培养使用的活化培养基的质量百分比配制为：总糖1％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、琼脂2％；

其中，以上述步骤1)制得的糖化液为碳源，摇瓶种子培养使用的液体培养基的质量百分比配制为：总糖3％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、玉米浆0.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.06％、硫酸锰0.003％。

本发明方法具有如下优点：

(1)以大量的农作物废弃物为主要原料制备L-乳酸，显著降低L-乳酸的生产成本，其产业前景非常广阔。

(2)采用乳酸菌(Lactobacillus 1.2131)一次接种增殖，菌体多次重复利用生产L-乳酸，减少菌种制备，简化发酵工艺，降低劳动强度。

(3)菌种经过连续发酵驯化，L-乳酸发酵周期由50～55小时缩短至24～26小时，L-乳酸的发酵强度显著提高，生产效率提高了50％以上。

(4)本发明不仅实现了秸秆糖化液连续发酵生产乳酸的目的，而且在发酵过程中达到了驯化菌种的目的，过程简单，连续性强，易于工业放大应用于生产。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1农作物废弃物糖化液的制备

将玉米芯粉碎，加入到反应釜中，然后按固液比1∶5(w/w)的比例加入2％(w/v)的NaOH，封好口后，在125℃条件下加热处理50分钟，得到的浆液在2000rpm离心机内离心，离心后的黑液经膜处理以回收其中的碱；所得固相经水洗后加入容器中，按固液比1∶6(w/w)加入2％(v/v)的稀HCl，调节温度到50℃处理1h，再按照20单位/g纤维素加入纤维素酶，搅拌转速100rpm，酶解时间控制在65小时，酶解终点后，将料液离心过滤，液相为酶解糖液，利用DNS法测酶解液的总糖浓度，利用高效液相色谱法测酶解液中的葡萄糖及木糖浓度。结果总糖浓度达10～20％(w/v)。

实施例2第一代L-乳酸连续发酵

以乳酸菌(Lactobacillus 1.2131)(购自中科院微生物所)为例，来说明本发明的发酵过程。

对于保藏的乳酸菌，首先经过如下过程制备种子液：

平板培养：将乳酸菌种接种活化培养基中，30℃培养40小时；

其中，以实施例1制得的糖化液为碳源，平板培养使用的活化培养基的质量百分比配制为：总糖1％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、琼脂2％；

其中，以实施例1制得的糖化液为碳源，摇瓶种子培养使用的液体培养基的质量百分比配制为：总糖3％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、玉米浆0.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.06％、硫酸锰0.003％。

通过上述培养得到发酵种子液，检测种子液OD₆₀₀为4.0即可。

以实施例1制得的糖化液为碳源，第一代连续发酵培养基的质量百分比配置为：总糖10％、酵母膏0.3％、牛肉膏0.4％、磷酸二氢钾0.04％、磷酸氢二钾0.04％、氯化钠0.02％、硫酸镁0.05％、碳酸钙4％。

L-乳酸连续发酵：将发酵种子液中的乳酸菌(Lactobacillus1.2131)接种至上述发酵培养基中，接种量8％，在40℃、200rpm进行厌氧搅拌发酵；发酵至乳酸含量不再增加，结束发酵，停止搅拌，放出5/6体积的发酵液，补入上述配方新发酵培养基继续发酵；连续循环发酵10批次，发酵周期为50～55小时，平均53小时。

实施例3第二代L-乳酸连续发酵

使用实施例2中发酵10批次后的乳酸菌接种至发酵培养基中，其中，以实施例1制得的糖化液为碳源，第二代连续发酵培养基的质量百分比配置为：总糖15％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％，在40℃、200rpm进行厌氧搅拌，连续发酵；发酵至乳酸含量不再增加，结束发酵，停止搅拌，放出5/6体积的发酵液，补入新发酵培养基继续发酵；连续循环发酵10批次，发酵周期为40～45小时，发酵周期缩短为平均42小时。

实施例4第三代L-乳酸连续发酵

使用实施例3中发酵10批次后的乳酸菌接种至发酵培养基中，其中，以实施例1制得的糖化液为碳源，第三代连续发酵培养基的质量百分比配置为：总糖20％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％，在40℃、200rpm进行厌氧搅拌，连续发酵；发酵至乳酸含量不再增加，结束发酵，停止搅拌，放出5/6体积的发酵液，补入新发酵培养基继续发酵；再连续循环发酵10批次，发酵周期为26～32小时，发酵周期缩短为平均28小时。

实施例5第四代L-乳酸连续发酵

使用实施例4中发酵10批次后的乳酸菌接种至实施例4所述发酵培养基中，在40℃、200rpm进行厌氧搅拌，连续发酵；发酵至乳酸含量不再增加，结束发酵，停止搅拌，放出5/6体积的发酵液，补入新发酵培养基继续循环发酵20批次，发酵周期为24～30小时；发酵周期缩短为平均25小时。

上述四代连续发酵培养的结果表明，在经过三代连续发酵培养驯化后，菌种就能基本保持其发酵特性，菌种性能比较稳定，可作为进一步连续发酵生产的菌种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种连续发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)将乳酸菌(Lactobacillus)接种到发酵培养基中，接种量5～10％，发酵温度为30～50℃，200rpm进行厌氧搅拌发酵，当乳酸含量不再增加时发酵结束，停止搅拌，放出80％～85％体积的发酵液，补入新发酵培养基继续发酵，按上述步骤连续发酵5～10批次作为第一代；其中，以步骤1)制得的糖化液为碳源，第一代连续发酵培养基的质量百分比配置如下：总糖10％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％；

3)以上一代的发酵液按5～10％的接种量接种到新鲜的发酵培养基中，按步骤2)的方法连续发酵5～10批次；连续发酵驯化3～4代；其中，以步骤1)制得的糖化液为碳源，第二代连续发酵培养基的质量百分比配置如下：总糖15％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％；以步骤1)制得的糖化液为碳源，第三或四代连续发酵培养基的质量百分比配置如下：总糖20％、酵母膏0.2％～0.4％、牛肉膏0.3％～0.5％、磷酸二氢钾0.03％～0.05％、磷酸氢二钾0.03％～0.05％、氯化钠0.02％～0.03％、硫酸镁0.04％～0.06％、碳酸钙3％～5％；

所述乳酸菌为Lactobacillus 1.2131，购自中科院微生物所。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农作物废弃物为秸秆或玉米芯。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1)糖化液的制备方法为，按固液重量比1∶4～6向粉碎的农作物废弃物加入重量体积比为2％的稀碱液并置于反应器中，封口后在125℃条件下加热处理50分钟，所得浆液于2000rpm离心；所得固相经水洗后加入容器中，按固液重量比1∶5～8加入体积比为2％的稀酸液，调节温度到50℃处理1小时，再按照20单位/g纤维素加入纤维素酶，搅拌转速100rpm，酶解时间控制在60～70小时，将料液离心过滤，液相为酶解糖化液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀碱液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水中的一种或几种。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述稀酸液为盐酸、硫酸、醋酸中的一种或几种。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为35～45℃。