CN105779328A - 一种热纤梭菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热纤梭菌的培养方法，包括以下步骤，步骤一：配制种子液培养基GS-2，将菌种ATCC27405接种于该种子液培养基；步骤二：配制发酵培养基并灭菌；步骤三：将培养好的种子液按一定比例接入到装有发酵培养基的厌氧瓶或发酵罐中；步骤四：温度60℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，控制氢气分压为0.01MPa，间歇性搅拌进行发酵。本发明的优点在于提供了一种快速获取热纤梭菌大量菌体浓度的发酵培养基和培养条件，并通过条件性诱导，获得了高密低的菌体浓度(常规培养的6-9倍)和显著提升的单位质量纤维素酶活力。
Description
技术领域
本发明涉及一种热纤梭菌高密度高酶活培养的方法。
背景技术
能源和环境危机是全世界都面临的重大难题，是目前各国的研究的热点问题。生物资源的能源化开发利用对于解决能源短缺、粮食危机和减少CO2气体排放有极其深远的意义(Tilmanetal，2009；Regalbutoetal，2009)。生物乙醇是目前开展的有前景的可替代能源，但是目前多采用粮食发酵，由于人口膨胀和粮食危机，淀粉乙醇受到诸多限制。
在我国，每年秸秆类农业废弃物产量多达7亿吨以上，是资源量最大，利用潜力最高的一类物质，具有巨大的生物质转化潜力。将秸秆类农业废弃物生物质转化为能源的过程，其限速步骤是纤维素的水解，特别是高度有序结晶的不溶性纤维素水解。早期对纤维素可再生能源的开发利用中主要利用好氧微生物产生纤维素酶，国内外研究主要集中在真菌(特别是瑞氏木霉)等。近年来，厌氧微生物降解纤维素的高效特性引起了广泛的注意(Tracyetal，2011)，由厌氧微生物产生的纤维素酶以胞外复合体的形式存在，被称之为“纤维小体”。纤维小体主要包括：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和其他半纤维素酶。
热纤梭菌是一种高温、厌氧、纤维素降解菌。生长温度在50-70℃。可利用纤维素和半纤维素产生纤维二糖，木糖和木聚二糖等，还可产生乙醇、乙酸、乳酸、H2和CO2。目前研究发现热纤梭菌主要利用六碳糖(葡萄糖)作为能量来源，不能利用五碳糖(木糖)，因而培养热纤梭菌的底物通常是纤维二糖、微晶纤维素和纤维素粉等。热纤梭菌是目前已获得的微生物中每毫克分泌蛋白的酶活性最高的纤维素降解菌(Lynd,2002)，具有巨大的研究价值和实际应用潜力。高密度发酵是快速获取菌体及其主要代谢物的主要方法，也是商业化生产的前提条件，对于提高发酵工业中的生产强度，降低生产成本具有重要意义(陈保立，王世立等，2009)，然而热纤梭菌的高密度培养还未见报道，本发明将填补此方面的空白。
另一方面，虽然现今已有广泛的对纤维素小体功能结构的研究，但是并没有涉及利用多种碳源合理搭配提高热纤梭菌纤维素酶活的培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，以填补热纤梭菌高密度发酵和培养基复合组分诱导高纤维素酶活力方面的空白。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种热纤梭菌的培养方法，包括以下步骤：
步骤一：配制种子液培养基GS-2，所述种子液培养基包括：KH2PO41.5-2.0g/L、K2HPO4(无水)2.9-3.5g/L、氮源2.1-2.5g/L、MgCl2·6H2O1.0-1.5g/L、CaCl2·2H2O150-250mg/L、FeSO4·6H2O1.25-3mg/L、半胱氨酸盐酸盐1.0-2g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、碳源5.0-15.0g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0-15.0g/L、酵母膏4.0-6.0g/L和柠檬酸钠·2H2O3.0-5.0g/L，初始pH为7.0-7.4；将菌种ATCC27405接种于该种子液培养基；
步骤二：配制发酵培养基并灭菌，所述发酵培养基包括：KH2PO41.2-1.5g/L、K2HPO4(无水)4.0-6.0g/L、氮源5.0-15.0g/L、MgCl2·6H2O2.0-3.0g/L、CaCl2·2H2O100-250mg/L、FeSO4·6H2O1.0-3.0mg/L、半胱氨酸盐酸盐1.0-3.0g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、碳源15.0-30.0g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0-15.0g/L、酵母膏10.0-15.0g/L和柠檬酸钠·2H2O0.5-1.5g/L；
步骤三：将培养好的种子液接入到装有发酵培养基的厌氧瓶或发酵罐中；
步骤四：温度60℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，控制氢气分压为0.01MPa，间歇性搅拌进行发酵。
其中，步骤一中所述碳源为纤维二糖。
其中，步骤二中所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的一种以质量比为1：5的比例组成的组合物或所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的两种组成的组合物，其中纤维二糖与所选两种化合物的质量之和的质量比为1:5，其中所选两种化合物的质量比为1:4或4:1。
其中，步骤一中所述氮源为胰蛋白胨。
其中，步骤二中所述氮源为尿素、NH4SO4和胰蛋白胨的组合物。
其中，步骤二中所述氮源为质量比为1:2：1的尿素、NH4SO4和胰蛋白胨的组合物。
其中，所述步骤四中碳源浓度大于15g/L发酵时，控制pH恒定为7.0。
其中，所述步骤四中发酵方式采用分批、补料分批、连续或半连续。
其中，所述步骤四中经24h-48h发酵后菌体浓度达到最大。
其中，所述步骤一中菌种为冻干粉保藏状态的菌种。
本发明的有益效果是：本发明的优点在于提供了一种快速获取热纤梭菌大量菌体浓度的发酵培养基和培养条件，并通过条件性诱导，获得了高密度的菌体浓度(常规培养的6-9倍)和显著提升的单位质量纤维素酶活力；在本发明的发酵培养基中采用无机氮源替代部分有机氮源，节约发酵成本，在同等投入下，具有酶活提高和经济效益增加的优点。
附图说明
图1为不同碳源对菌体生长延迟期和最大菌体浓度影响示意图；
图2为不同氮源对相对酶活性的影响示意图。
具体实施方式
一种热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，以纤维素质生物质二糖降解物，如纤维二糖或木聚二糖为原料，发酵法直接高密度培养，主要包括以下步骤：
步骤一：发酵种子液的制备；
将菌种(clostridiumthermocellum)ATCC27405(冻干粉保藏)接种于种子液培养基GS-2：KH2PO41.5-2.0g/L，K2HPO4(anhydrous)2.9-3.5g/L，氮源2.1-2.5g/L，MgCl2·6H2O1.0-1.5g/L，CaCl2·2H2O150-250mg/L，FeSO4·6H2O1.25-3mg/L，Cysteinehydrochloride(半胱氨酸盐酸盐)1.0-2g/L，Resazurin(刃天青钠盐)2.0mg/L，碳源5.0-15.0g/L，Morpholinopropanesulfonicacid(MOPS，吗啉代丙烷磺酸)10.0-15.0g/L，Yeastextract(酵母膏)4.0-6.0g/L，Sodiumcitrate(柠檬酸钠)·2H2O3.0-5.0g/L，初始pH为7.0-7.4；
步骤二：高密度组合碳源诱导型发酵培养基配方：KH2PO41.2-1.5g/L，K2HPO4(anhydrous)4.0-6.0g/L，氮源5.0-15.0g/L，MgCl2·6H2O2.0-3.0g/L，CaCl2·2H2O100-250mg/L，FeSO4·6H2O1.0-3.0mg/L，Cysteinehydrochloride(半胱氨酸盐酸盐)1.0-3.0g/L，Resazurin(刃天青钠盐)2.0mg/L，碳源15.0-30.0g/L，Morpholinopropanesulfonicacid(MOPS，吗啉代丙烷磺酸)10.0-15.0g/L，Yeastextract(酵母膏)10.0-15.0g/L，Sodiumcitrate(柠檬酸钠)·2H2O10.0-15.0g/L配制发酵培养基，并灭菌。
步骤三：接种、按种子液与发酵培养基的重量比为1：10的比例将培养好的种子液接入到装有发酵培养基的厌氧瓶或发酵罐中；
步骤四：培养、温度60℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，控制氢气分压为0.01MPa，间歇性搅拌。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7.0左右。发酵方式可采用分批，补料分批，连续或半连续等；
步骤五：经24h-48h后菌体浓度达到最大，瓶装条件下OD600达到7.85，发酵罐中OD600达到12.0，纤维素酶酶活最高提升约50％。
作为优选的技术方案，所述步骤二中所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的一种以质量比为1：5的比例组成的组合物或所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的两种组成的组合物，其中纤维二糖与所选两种化合物的质量之和的质量比为1:5，其中所选两种化合物的质量比为1:4或4:1。；所述氮源为尿素、NH4SO4、胰蛋白胨以1:2：1的质量比例组成的组合物。
作为优选的技术方案，所述发酵培养基包括：KH2PO41.2g/L、K2HPO4(无水)6.0g/L、氮源5.0g/L、MgCl2·6H2O2.49g/L、CaCl2·2H2O150mg/L、FeSO4·6H2O1.25mg/L、半胱氨酸盐酸盐2.0g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、碳源20.0g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0g/L、酵母膏12.0g/L和柠檬酸钠·2H2O0.752g/L。
此发酵培养基在碳源的选择和配比上具有独特性，不同于传统的同类培养基，通过碳源的调配，有利的刺激了微生物的纤维素酶活力，使发酵液酶活显著增加。
控制氢气分压为0.01MPa，根据热纤梭菌代谢路径，控制低浓度氢分压有利于碳源向乙醇的转化，减少甚至抑制乙酸的产生，有效降低对菌体生长和代谢活性的抑制。
作为优选的技术方案，所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的一种以质量比为1：5的比例组成的组合物或所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的两种组成的组合物，其中纤维二糖与所选两种化合物的质量之和的质量比为1:5，其中所选两种化合物的质量比为1:4或4:1，，这样的混合碳源能够有效地诱导纤维素酶的产生，同时避免高浓度的纤维二糖对热纤梭菌的反馈抑制作用。
作为优选的技术方案，所述氮源为尿素、NH4SO4、胰蛋白胨以1:2：1质量比例组成的组合物，有机氮源对热纤梭菌的生长具有重要作用，但成本较高，无机氮源能部分满足菌体需求，补充有机氮源的不足。
碳源优化机理：热纤梭菌在利用纤维素底物过程中，由于需要多种酶的协调作用才能实现纤维素的彻底水解，纤维素酶的酶活由三种酶组成，分别为外切葡聚糖苷酶、内切葡聚糖苷酶和葡萄糖苷酶，三种酶中，葡萄糖苷酶因为能够有效的将纤维素水解中间产物彻底水解从而解除这些中间产物对外切酶和内切酶的严重活性抑制，对于提升纤维素酶酶活具有非常重要的作用。而不完全水解的纤维素产生的纤维二糖等寡聚多糖，在低浓度下会产生诱导增强葡萄糖苷酶活性的作用，高浓度下则会抑制该酶的活性。碳源中加入的纤维二糖经过浓度优化，能够对热纤梭菌中的葡萄糖苷酶酶活达到最强的诱导作用，因而能够有效地提升单体酶活性。此外，由于纤维素降解利用困难，直接投入纤维素原料，由于可利用底物匮乏，菌株在初期会存在极长的延迟期，并且会导致最终菌体密度过低，进而严重影响酶活。
采用混合碳源，利用其中的寡聚糖实现纤维素相关酶的诱导，并在发酵初期为菌株提供足够的可直接利用的发酵糖，经验证能够有效地缩短菌株的延迟期，并通过进一步调控氮源，能够实现高浓度和高酶活培养，通过图1可以看出在采用混合碳源后，在两种培养模式(厌氧瓶培养和发酵罐培养)下，不仅延迟期有显著地降低，最大菌体浓度也有了显著地提升。
进一步考察不同氮源对酶活和菌浓的影响我们发现，由于纤维素酶的合成对氮源需求较高，而有机氮源价格高昂，在大规模生产中无法使用，采用合适的无机氮源进行替换，能够有效地在降低培养成本。此外，在实验中我们还发现，当在氮源中进一步添加尿素，形成三种氮源的组合时，由于尿素为碱性氮源，还能够进一步刺激和调控菌体代谢产物向非酸性产物倾斜，能够有效解除酸性物质抑制作用，提升菌体浓度和酶活性，通过图2可以看出不同氮源对相对酶活性的影响，此外，采用三种氮源的组合氮源时，对生长曲线进行监控发现在采用混合碳源的条件下热纤梭菌的生长曲线几乎不受影响，说明采用混合氮源能够在保证菌体高密度生长的前提下，进一步的提升单体酶活，并显著地降低培养成本，具有极为重要的应用价值。
采用间歇性搅拌，根据菌体状态调整搅拌状态，能够在保证剪切力不损伤细胞或影响酶对纤维素吸附的同时，增强传质，增大底物与菌体接触概率，大大提升了菌体生长速度。
与中国专利号为201110189094.8的专利申请(一种热纤梭菌高密度培养的方法)相比，不仅使用的菌种不同，中国专利号为201110189094.8的专利申请中使用的菌种为clostridiumthermocellumJYT01，本专利中使用的菌种为clostridiumthermocellumATCC27405，发酵培养基不同，发酵工艺操作也不相同，中国专利号为201110189094.8的专利申请的培养目的和重点是发酵菌体的高密度增殖，而本发明中的目的和重点在于同时提升菌体浓度和单位菌体的纤维素酶活力，在本发明中发酵培养中采用无机氮源替代部分有机氮源，节约发酵成本，在同等投入下，具有酶活提高和经济效益增加的优点。
实施例1：100ml厌氧瓶发酵
1.用1mL注射器取100μLC.thermocellumATCC27405的甘油管菌种，接种于装有5mL种子培养基的厌氧瓶中，60℃恒温培养，活化菌种。
2.配制种子培养基，包括：KH2PO41.5g/L、K2HPO4(无水)2.9g/L、胰蛋白胨2.1g/L、MgCl2·6H2O1.0g/L、CaCl2·2H2O150mg/L、FeSO4·6H2O1.25mg/L、半胱氨酸盐酸盐1.0g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、纤维二糖5.0g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0g/L、酵母膏6.0g/L和柠檬酸钠·2H2O3.0g/L，调整初始pH为7.4，115℃，30min灭菌。其中，钙、镁、铁盐分别配成100X母液于灭菌后加入。分装培养基100mL于300ml厌氧瓶中，不断通入氮气排净瓶内空气，按10％比例接种菌种后，用聚丁酯塞密封，以保证瓶内厌氧环境。培养36小时后收集菌液作为高密度高酶活发酵种子液。
3.配置高密度组合碳氮源诱导型发酵培养基，包括：KH2PO41.2g/L、K2HPO4(无水)6.0g/L、尿素1.25g/L、NH4SO42.5g/L、胰蛋白胨1.25g/L、MgCl2·6H2O2.49g/L、CaCl2·2H2O150mg/L、FeSO4·6H2O1.25mg/L、半胱氨酸盐酸盐2.0g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、纤维二糖3.33g/L、微晶纤维素16.67g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0g/L、酵母膏12.0g/L和柠檬酸钠·2H2O0.752g/L，调整初始pH为7.4，分装至300ml厌氧瓶中(加100ml培养基)，115℃，30min灭菌。其中，钙、镁、铁盐分别配成100X母液于灭菌后加入。将收集的菌液按照10％的比例接种至灭菌分装好的高密度组合碳氮源诱导型发酵培养基中，温度55℃，厌氧，采用单向阀控制罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa；发酵罐需控制氢气分压为0.01MPa，间歇性搅拌。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7.0左右。
4.约48h后碳源被全部消耗，发酵液中菌体浓度达8.85(OD600)，滤纸酶活约为0.20IU/ml。。
5.检测方法：
滤纸酶活是将滤纸溶液与酶液混匀，50℃下反应30min，然后用DNS法测定还原糖的生成量，并以每分钟水解底物产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个活力单位(IU)。
实施例2：3L发酵罐发酵
1.用1mL注射器取400μLC.thermocellumATCC27405的甘油管菌种，接种于装有20mL种子培养基(配方同实施例1)的厌氧瓶中，60℃恒温培养，活化菌种；将活化好的C.thermocellumATCC27405菌液12mL接种于200mL种子培养基中，60℃，恒温培养箱中培养24小时，得到一级种子液；，计算接种量为1∶10，发酵液总体积为2L时各自所需体积。
2.按配方“KH2PO41.2g/L，K2HPO4(anhydrous)6.0g/L，尿素1.25g/L，NH4SO42.5g/L，胰蛋白胨1.25g/L，MgCl2·6H2O2.49g/L，CaCl2·2H2O150mg/L，FeSO4·6H2O1.25mg/L，Cysteinehydrochloride2.0g/L，Resazurin2.0mg/L，纤维二糖3.33g/L，微晶纤维素13.34g/L，木聚糖3.33g/L，Morpholinopropanesulfonicacid(MOPS)10.0g/L，Yeastextract12.0g/L，Sodiumcitrate·2H2O0.752g/L”配制发酵培养基(钙、镁、铁盐母液灭菌后加入)，115℃，15min湿热灭菌。
3.灭菌结束后，不断向发酵罐中通入氮气，以去除培养基及发酵罐内的氧气。待培养基由淡蓝色或粉红色(刃天青的颜色)变回其自身的颜色后，调节培养基pH恒定为7.0，罐温55℃，同时接入所需体积的ATCC27405一级种子液，停止通气，间歇式搅拌发酵。
4.约48h后碳源被全部消耗，发酵液中菌体浓度达13.25(OD600)，滤纸酶活约为0.20IU/ml。
本发明的有益效果是：本发明的优点在于提供了一种快速获取热纤梭菌大量菌体浓度的发酵培养基和培养条件，并通过条件性诱导，获得了高密度的菌体浓度(常规培养的6-9倍)和显著提升的单位质量纤维素酶活力；在本发明的发酵培养基中采用无机氮源替代部分有机氮源，节约发酵成本，在同等投入下，具有酶活提高和经济效益增加的优点。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种热纤梭菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：配制种子液培养基GS-2，所述种子液培养基包括：KH2PO41.5-2.0g/L、K2HPO4(无水)2.9-3.5g/L、氮源2.1-2.5g/L、MgCl2·6H2O1.0-1.5g/L、CaCl2·2H2O150-250mg/L、FeSO4·6H2O1.25-3mg/L、半胱氨酸盐酸盐1.0-2g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、碳源5.0-15.0g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0-15.0g/L、酵母膏4.0-6.0g/L和柠檬酸钠·2H2O3.0-5.0g/L，初始pH为7.0-7.4；将菌种ATCC27405接种于该种子液培养基；
步骤二：配制发酵培养基并灭菌，所述发酵培养基包括：KH2PO41.2-1.5g/L、K2HPO4(无水)4.0-6.0g/L、氮源5.0-15.0g/L、MgCl2·6H2O2.0-3.0g/L、CaCl2·2H2O100-250mg/L、FeSO4·6H2O1.0-3.0mg/L、半胱氨酸盐酸盐1.0-3.0g/L、刃天青钠盐2.0mg/L、碳源15.0-30.0g/L、吗啉代丙烷磺酸10.0-15.0g/L、酵母膏10.0-15.0g/L和柠檬酸钠·2H2O0.5-1.5g/L；
步骤三：将培养好的种子液接入到装有发酵培养基的厌氧瓶或发酵罐中；
步骤四：温度55～60℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，控制氢气分压为0.01MPa，间歇性搅拌进行发酵。
2.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，步骤一中所述碳源为纤维二糖。
3.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，步骤二中所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的一种以质量比为1：5的比例组成的组合物或所述碳源为纤维二糖与选自α-纤维素、微晶纤维素或木聚糖中的两种组成的组合物，其中纤维二糖与所选两种化合物的质量之和的质量比为1:5，其中所选两种化合物的质量比为1:4或4:1。
4.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，步骤一中所述氮源为胰蛋白胨。
5.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，步骤二中所述氮源为尿素、NH4SO4和胰蛋白胨的组合物。
6.根据权利要求5所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，步骤二中所述氮源为质量比为1:2：1的尿素、NH4SO4和胰蛋白胨的组合物。
7.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，所述步骤四中碳源浓度大于15g/L发酵时，控制pH恒定为7.0。
8.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，所述步骤四中发酵方式采用分批、补料分批、连续或半连续。
9.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，所述步骤四中经24h-48h发酵后菌体浓度达到最大。
10.根据权利要求1所述的热纤梭菌高密度高酶活培养的方法，其特征在于，所述步骤一中菌种为冻干粉保藏状态的菌种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160720 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |