CN1117854C - 一种产生菊粉酶的酵母菌株及其在制作高果糖浆中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产生菊粉酶的酵母菌株，由这种酵母菌株产生的菊粉酶，以及利用这种酵母菌株和该菌株分泌的菊粉酶降解菊粉生产高果糖浆的方法。利用本发明可提高菊粉酶产量并缩短产酶发酵高峰期，克服生产实践中菊粉酶产量低、成本高的问题。

Description

一种产生菊粉酶的酵母菌株及其在制作高果糖浆中的应用

本发明涉及一种产生菊粉酶的酵母菌株；由酵母菌产生的菊粉酶；通过酵母菌株高密度发酵生产菊粉酶的方法，以及由所述的菊粉酶糖化降解菊粉生产高果糖浆的方法。

由葡萄糖和果糖组成的蔗糖因其价廉、味甜作为甜味剂在食品、饮料、医药行业中广为应用，在人类物质条件尚欠发达的时代与地区，蔗糖以其高能量与高甜度在补充人体能量与满足调味需求方面起过并仍然起着十分重要的作用。

随着社会经济的发展进步、人类生活水平的提高，蔗糖、葡萄糖的营养弊端日益显现出来。大量营养与医学研究表明：长期食用蔗糖容易引起肥胖症、糖尿病、龋齿、高血压和心血管疾病等。有些国家营养学家甚至提出了限用或禁用蔗糖的建议。因此，研究、寻找新的甜味剂替代品一直是热门课题。

果糖是自然界最甜的天然甜味剂，其甜度比蔗糖高80％。单从甜味剂功能与经济效益来看，果糖明显优于蔗糖。也比目前广泛使用的糖尿病食物专用甜味剂山梨醇的甜度也高出50％。

果糖还具有比葡萄糖、蔗糖明显优越的保健与营养功效。果糖在人体肝脏内的磷酸化不象葡萄糖那样受胰岛素的控制，绝大部分果糖磷酸化后直接进入糖酵解三羧酸循环，果糖不仅是糖尿病患者积极有效的碳素营养来源；食用果糖还能够避免诱发糖尿病，饭后血糖高峰和低血糖症，避免产生乳酸引起肌肉酸痛和疲乏感以及儿童龋齿病和肥胖病。

此外，果糖因其高于蔗糖1倍的渗透压而具有更好的保湿性能，和更好的溶解性能，这会带来生产与应用方面的优势。

因此，果糖资源的研究与开发具有重要意义。果葡糖浆一直是多数国家尤其是发展中国家食用和医用果糖的主要产品。果葡糖浆的生产历经了一代、二代和三代产品，分别是果葡糖浆(FGS)、富果葡糖浆(RFS)和高果糖浆(HFS)，三代产品的核心质量指标标志是产品中果糖含量分别达到42％、55％和90％以上，其相应的生产技术特征分述如后：

1)FGS：淀粉→葡萄糖→葡萄糖+果糖，从底物到产物均是由一系列的酶催化反应完成的，产品果糖含率的理论值＝＜50％，生产实践上这一指标一般为42％，这条途径在国内外广为采用；

2)RFS：淀粉→葡萄糖→葡萄糖+果糖→吸附分离出果糖→剩下的葡萄糖→葡萄糖+果糖，终产物果糖含量可达到55％；由于RFS产品生产无需新添任何设备，近年国内外有很多果葡糖厂已陆续新上第二代果葡糖浆产品RFS，与一代产品共同生产。

3)HFS：多聚果糖→低聚果糖→果糖，终产物果糖含量＞90％，只含有不到5％的葡萄糖，多聚果糖底物来自富含多聚果糖的菊科植物如菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(Chicory)的块根中。HFS生产途径的生化原理与相应的工艺与前两种果糖产品明显不同，  相对而言更为简单，前两种果糖FGS和RFS生产至少需要三种以上淀粉降解酶、6碳糖异构酶及相应不同的工艺流程段，而HFS只需要一种菊糖酶，从底物到产物由一步酶催化反应完成；由于目前没有多聚果糖降解酶系的规模生产，因此生产厂家必须自产菊粉酶，相应就要求有产酶和酶解两个工艺段。由于原料廉价易得、工艺相对简化、产品果糖含量比远远高于一、二代产品，提高近1倍，因此这是生产果糖最有前途和吸引力的一条途径。但现有技术中产酶菌株菊粉酶产量低，产酶成本高。

关于菊粉酶酶学性质的研究结果表明：根据菊粉酶酶切多聚果糖的方式分为外切和内切菊粉酶，作用后分别得到果糖和果糖与低聚糖混合物，已知一种来自曲霉(Aspergillus)内切菊粉酶商品酶粗试剂的分子量53KDa，Km＝19mM，而同一种来源的外切菊粉酶分子量81KDa，Km＝60mM，纯化后内切酶和外切酶Km分别降为6和10mM；Fe³⁺可以使纯化的内切菊粉酶活性提高20倍，Mn⁺和Mg⁺则能部分抑制此二种酶的活性；很多菊粉酶几乎都同时具有转化酶活性，内切型酶的菊粉酶与转化酶活性比I/S＝1/0.2，外切酶的I/S＝1/8(Rosa Azhari，Alada M.Szlak，EhudIlan，Samuel Sideman，and Noah Lotan.，Purification andcharacterization of endo-and exo-inulinase Biotechnology andApplied Biochemistry，1989，11：105-117.)；更早一些时候，就有报道曲霉菊粉酶最适反应温度为60℃，最适反应pH值为4.4(Starch.1981，33：373-377，Enzymatic hydrolysis of inulin-analternative way to fructose production，L.Zittan)；另据报道，一种产菊粉酶的黑曲霉在摇床水平下，30℃*140rpm，至第5天(120h)酶活达到27U/ml，第7天(168h)酶活达到高峰为48.4U/ml，生物量达到28.8g/l(Kazuyoshi Ohta，Shigeyuki Hamada，and Toyohiko Nakamura.Production of high concentrations of ethanol from inulin bysimultaneous Saccharification and fermentation using Aspergillusniger and Saccharomyces cerevisiae.Applied and EnvironmentalMicrobiology，1993，59：729-733)。最近报道认为：一种产菊粉酶的黑曲霉在摇瓶水平下，28℃*200rpm，菊粉酶在0-120h之间从0直线上升至48U/ml，之后则保持稳定，至第7天(168h)达到50U/ml的高峰值，＞55℃的耐温性较差，60℃*1h下，残余活性仅78％，70℃*1h下酶活几乎为0，60℃的菊粉酶半衰期为71min；最适反应pH值为5.0，在pH5.0-5.8范围内菊粉酶稳定性很好；Na⁺能够使酶活性提高15％，Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺无明显影响，Ba²⁺、Mn²⁺、pb²⁺、Ag¹⁺使酶活性显著下降(Gaye Ongen-Baysal，S.Suha Sukan，Nikolay Vassilev.，Productionand properties of inulinase from Aspergillus niger.BiotechnologyLetters，1994，16：275-280).

另一个产菊粉酶的热点菌种就是克鲁维酵母Kluyveromyces.据报道Kluyveromyces marxianus CBS6556能够分泌菊粉酶，所产菊粉酶分子量64KDa，糖基化程度达26-37％，分泌至培养基中的菊粉酶为二聚体，与细胞壁结合的菊粉酶为四聚体(Rouwenhorst R.J.et al.Structure andproperties of the extracellular inulinase of Kluyveromycesmarxianus CBS6556，Applied and Environmental Microbiology 1990，56：3337-3345.)，该菌株最适生长与产酶温度为40-45℃，在1L的发酵罐中采用无机培养基进行连续培养，培养基C源限制为0.25％蔗糖，发酵参数为pO₂控制在50-70％，由1MKOH和0.5MH₂SO₄控制pH4.5，在0.1/h的稀释速率下，生物量最高达到1.05mg(DW)/ml，最高胞外酶活达到32U/ml，I/S＝1/15，胞外酶与胞内酶比例依培养时间大致为：50-65％/50-35％，酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH值为4.5-5.0；培养基中残余蔗糖浓度与酶产量呈负相关(Rouwenhorst R..J.et al.，1988)。另一种Kluyveromyces marxianus NCYC587在摇床条件，28℃*200rpm，菊粉酶活性在培养120h时达到34.5U/ml，I/S＝1/0.6(Ongen-Baysal G and Sukan S S.Production of inulinase nymixed culture of Aspergillius niger and Kluyveromyces marxianus.Biotechnology Lett.1996，18：1431-1434)。国内最新报道一种产菊粉酶的Kluyveromyces菌株在由牛肉膏、玉米浆、尿素和菊芋汁组成的有机培养基上经摇瓶产酶条件正交试验所得结果：最高菊粉酶胞外酶活性为15U/ml，继而在15L和1000L国产发酵罐上试验所得最高胞外酶产量分别为17.63和18.7U/ml，胞内酶与胞外酶的分布比例为0.2561∶0.7439(魏文铃，郑忠辉、郑志成等，克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究，微生物学报，1998，38：208-212；郑忠辉、刘月英、蔡文铮、魏文铃、郑志成.菊粉酶高活力菌株的筛选和发酵条件的研究，厦门大学学报1993，32：360-364.)。关于克鲁维酵母菊粉酶Km值多因菊粉溶解性较差而未作测定，只有NegoroH报道Km测定值为7.4mM(Purification andcharacterization of inulinase from Kluveromyces fraglis.J.Ferment.Techno1978，1.56：102-107).魏文铃等报道约为14.0-15.7mM。

关于多聚果糖降解酶系的分子生物学研究始于90年代，1991年比利时Vandenhaute小组首次从克鲁维马科斯酵母Kluyveromyces marxianus中克隆到菊粉外切酶(EC3.2.1.7)基因inul并测序，由1.668Kb编码555个AA，与转化酶同源性达到67％；1996年日本的Onodera小组首次从青霉(Penicillium purprogenum)中克隆到菊粉内切酶(EC3.2.1.7)基因inuA并测序，发现该酶的结构基因含有1548bp，编码515个氨基酸，其中25AA为信号肽，490AA为成熟酶蛋白，分子量为54KDa。以E.coli为宿主菌所作的表达初步研究表明，inuA表达的酶蛋白产量很低，几乎检测不到；通过比较分析DNA核苷酸序列发现：青霉(Penicilliumpurprogenum)菊粉内切酶基因与克鲁维马科斯酵母(Kluyveromycesmarxianus)菊粉外切酶基因、与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)转化酶基因、和与枯草芽孢杆菌(Bacillius subtilis)果聚糖酶的同源性分别为27％、29％和39％。说明菊粉内切酶基因与上述酶基因同源性都较低。总之，构造菊粉酶高产工程菌株和进一步筛选性能优良的菊粉酶高产天然菌株都是十分必要的。

关于菊粉酶降解菊粉制备HFS的应用研究较多，据报道，曲霉菊粉酶以2U/g(菊粉)在60℃下进行降解反应，24h降解率达到86.7％，48h达到99.2％，鲁维酵母菊粉酶以6U/g(菊粉)在55℃下进行降解反应，1h降解率达到30.6％，24h达到82.2％，48h达到89.6％(Starch.1981，33：373-377，Enzymatic hydrolysis of inulin-an alternative way tofructose production，L.Zittan)，另据报道黑曲霉菊粉酶在50℃下降解含糖量16％的菊芋汁在1-6h间降解率稳定在12％，降解产物为单糖和低聚果糖的混合物，而克鲁维酵母菊粉酶降解4h后，降解率达到43％，产物以果糖为主(Gaye Ongen-Baysal，S.Suha Sukan，1996)。黑曲霉商品菊粉酶粗制剂纯化后的内切酶降解60，120，240mM(糖苷键)菊粉4h后降解率分别达到36.7，28.3和21.7％，24h后降解率达到90％以上，产物中GF4-GF6占80％以上，而G，F和蔗糖占8％，菊糖占8％，外切酶用于降解60，120和240mM(糖苷键)菊粉4h后降解率分别达到20，12.5和10.4％，24h后降解率达到90％以上，产物中低聚果糖6％，F占85％以上，菊糖占8％(Rosa Azhari，Alada M.Szlak，Ehud Ilan，SamuelSideman，and Noah Lotan. Biotechnology and AppliedBiochemistry，1989，11：105-117.Purification and characterizationof endo-and exo-inulinase)。另据报道，青霉(Penicillium purprogenum)内切菊粉酶，降解菊粉产物以F3，F4和F5低聚果糖为主，降解率为32％，另一种青霉的内切菊粉酶用于降解菊粉在24h前产物以GF2，GF3，GF4为主，降解率达到50％，至72h降解率达到70％，产物以F3为主(NakamuraT，Shitara A，Matsuda S.，et al.，1997，Production，purification and properties of an endoinulinase of Penicilliumsp.TN-88 that liberates inulotriose.J.Ferment.Bioeng.84：313-318)。总之，现有技术中应用菊粉酶降解菊芋生产HFS较为理想的条件为：10-15％菊粉浓度，2-5U INU(纯菊粉酶)/g(菊粉)，50℃，15-20h。菊粉内切酶降解产物以低聚果糖为主，外切酶降解产物以果糖为主。

目前关于曲霉菊粉酶的研究比酵母菊粉酶的多，且已经报道的曲霉菊粉酶产量比酵母的也高。但本发明认为，撇开具体酶种不论，尤其是在产业化方面曲霉在应用于发酵工业生产时大大逊色于克鲁维酵母。

首先，曲霉通过液体发酵进行工业化生产有两个问题无法有效解决，一是菌体与酶液分离困难；二是产酶周期太长，酶活高峰期在5-8天出现，这在发酵工业成本上是很不经济的；第二，霉菌的营养生长是通过菌丝体尖端的伸长生长实现的，这种生长特性尤其适合固体培养，而并不适合现代发酵工艺所常用的液态发酵，一般而言固体发酵工效低，周期长，成本高，由此使获得大量发酵产品的成本比之液态发酵要增加很多。相比之下，酵母细胞繁殖特性十分适合液态发酵；第三，霉菌营养体在生长发育期间需要提供足够的较复杂的碳氮有机养分，这也会增加发酵成本，克鲁维酵母营养体的生长发育可以利用廉价的简单养分无机盐、蔗糖和氨水等，获得同等量的营养体克鲁维酵母比霉菌消耗的养分要便宜得多。酵母的高细胞密度、低成本发酵方法已经建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，1989，34：403-404)，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素和维生素等都很便宜；第四，霉菌特有的霉味会影响菊粉酶及其降解产物的风味，而克鲁维酵母发酵无此弊端；第五，克鲁维酵母含有多种大量的促进生长的有机化合物，如低聚糖、核苷酸、各种氨基酸、短肽等，具有多方面的开发前景。这些优势都是霉菌比不上的或所不具有的。

为提高菊粉酶产量和缩短产酶发酵高峰期，解决HFS生产实践中菊粉酶产量低、成本高的问题，本发明的一个目的是筛选一种新的克鲁维酵母菌株。

本发明人已筛选到一种马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxinus)菌株，IW9801，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京，中关村，100080)进行了保藏，保藏号为：CGMCCNO.0360，保藏日期为：1998年9月23日。

本发明的另一个目的是提供一种由所述的酵母菌株产生的菊粉酶。本发明的菊粉酶具有以下特征：Km(菊糖)为13.3mM，Km(蔗糖)62.6mM，I/S＝1/24.72；最适pH值为4.4，并且在pH3.8-6.4范围内均保持了90％以上的残余酶活性；最适反应温度为55℃，在50-57.5℃范围内均有较高的菊粉酶反应活性，50℃下的半衰期为16小时；镁离子能够提高菊粉酶活性11.28％。本发明的菊粉酶在产酶酵母发酵后存在于发酵液中，将发酵液与酵母菌体分离后可直接用于菊粉的酶解，如果需要，也可将菊粉酶通过常规方法，如柱层析，从发酵液中分离出来。

本发明的再一个目的是提供一种由酵母菌株高密度发酵生产菊粉酶的方法(除非特别说明，本发明所用的百分比均为重量百分比)，包括：

(1)将菌株接种到含有0.6-1.4％(重量)氮化合物为氮源，0.8-1.2％有机碳化合物为碳源的无机盐基础培养基中，在25-40℃下通气培养，使pO₂＞25％，pH4-5；

(2)培养至4-7小时，当pO₂值突然上升时开始流加补充料，补充料与基础培养基相同，只是其中大量元素含量增加5-10倍，微量元素含量增加10-30倍，碳源含量增加30-50倍；

(3)流加补充料过程中，始终使pO₂＞30％，pH4-5，前5-30小时加速流加，后阶段30-70小时匀速流加，最终发酵液体积增加40-80％，菌体生物量湿重达到150-300g/升；

(4)将酶液从菌体中分离出来。

在上述发酵方法中，最好使用蔗糖或棉籽糖或葡萄糖或菊芋汁为唯一碳源，使用无机氮化合物或尿素为培养基氮源。并且优选碳源为蔗糖，氮源为硫酸铵。

在上述发酵方法中，基础培养基和补充料成份主要参考Shau L.K和G.H.Wegner方法(J.Dairy Sci.，1986，69：676～683)，并加以改进。一是将培养基浓度增加1倍，二是增加生物素、烟酸和泛酸钙等维生素类营养成份及EDTA，三是将碳源乳清改为蔗糖。优选基础培养基中C源浓度为0.8-1.2％；流加补充料中C源浓度为35-60％，并在流加过程中保持发酵液中C源浓度为1.5-3.0％。其中更优选基础培养基中C源浓度为1.0％；流加补充料中C源浓度为50％，并在流加过程中保持发酵液中C源浓度为2.5％。

在此发酵方法中，碳源与氮源的选择范围主要基于产酶效应与原料成本这两方面因素。碳源浓度如果低于0.8％，则不足以满足菌株早期生长繁殖的需求，延缓对数生长期，若高于1.2％，则会产生明显的产酶阻遏效应，即不利于产酶，还造成C源浪费。

在上述发酵方法中，优选培养基装量为罐有效总体积的40-60％；流加补充料体积为基础料体积的40-80％。更优选培养基装量为罐有效总体积的50％；流加补充料体积为基础料体积的70％。

在上述发酵方法中，优选发酵过程中将pH控制在4.5，用氨水控制pH值。

在上述发酵方法中，所述的无机盐培养基可使用通常用于酵母发酵的无机盐培养基，但优选除含有0.6-1.4％(重量)氮化合物为氮源，0.8-1.2％有机碳化合物为碳源以外，最好至少还含有0.4-0.7％磷酸盐，0.8-1.2％镁盐，1.5-4.0ppm的铁、锰盐、硼酸盐、维生素物质和0.2-1.10ppm的铜、锌、钴和碘盐。

在上述发酵方法中，优选将发酵过程中的pO₂值控制在25-50％，最好为30-40％，转速为450-1000rpm。

在上述发酵方法中，优选将菌体湿重控制在180-300g/L，最好为230g/L。

在上述发酵方法中，优选使发酵液中最高胞外菊粉酶活性达到45-75U/ml，并且发酵温度最好为38℃，发酵液中最高胞外菊粉酶活性达到60U/ml。

在本发明的发酵方法中，补充料流加速度的表观依据是pO₂值＞30％，实质依据是菌体生物量和发酵液通气量，在发酵早期，当通气量一定时，补充料菌体生物量与流加速度呈正比例，故采取加速流加措施，在发酵后期当生物量湿重达到120-180g/L时，生物量增加随着流加量增大而减小，故采取匀速流加措施。在发酵罐转速一定时，pO₂值如果太高(＞50％)，说明培养基养分不足，应加大补充料流加速度，反之，pO₂值如果太低(＜30％)，说明生长繁殖过旺的菌体将培养基中氧气消耗过多，从而迫使菌体在氧气不足时转入无氧发酵，将碳水化合物转化为酒精，于产酶不利，于菌体存活也不利，此时应降低补充料流加速度。补充料流加量的多少还与发酵温度有关，25-32℃时，总流加量相当于基础料体积的35-45％，35-40℃时，总流加量相当于基础料体积的55-80％。

发酵中转速，实际上是越高越好，因此应该综合考虑设备性能、能耗效率、产酶量与产酶效率等因素优选决定通气量大小的转速。

发酵过程中由氨水控制pH4.5，该菌株正常发酵条件下，分泌较多有机酸使培养基pH值＜3.0，这首先不利于菊粉酶的产生，也不利于菌体繁殖。氨水一方面易于控制pH4.5，另一方面还能补充适量N源。

一般地，单位发酵液酶产量与菌体湿重呈正比，但单位发酵罐里的菊粉酶总产量与菌体湿重的关系是复杂的，在0-250g/L菌体湿重范围内，二者呈正比例关系，＞300g/L菌体湿重，总酶产量增加减少，直至出现零增长甚至负增长，导致单位菌体产酶达到最大限度，发酵原料产酶效率下降，产酶成本增加。因此，本发明中的高密度发酵方法表明：基于获得最大量的总的菊粉酶产量和最好的产酶经济效益的目的，菌体密度的优选范围是180-300g/L，最适230g/L。

本发明的高密度发酵方法不仅可以用于本发明的酵母菌株CGMCC0360 IW9801，也可以用于酵母菌株。

本发明的又一个目的是提供一种利用本发明的方法生产的菊粉酶降解菊粉生产高果糖浆的方法，包括：菌体与酶液分离后，将菊粉酶液与含糖量8-17％的菊粉溶液按照1∶8～17的体积比混合，在45-55℃下酶解糖化30-40小时，得到高果糖浆。

在上述方法中，菊粉酶降解菊粉的优选条件为：菊糖浓度15％，酶液与8-17％菊粉液混合比例为1∶15，酶解温度为50℃，酶解时间为36小时。

糖化降解菊粉时，菊粉浓度＞17％，超过了菊粉最大溶解度导致糖化罐有菊粉沉淀析出，自然不可能彻底糖化，如果菊粉浓度＜8％，于菊粉完全溶解和糖化固然好而且快，但这样势必增加糖化罐容积，增加浓缩成本，最终抬高产品成本。因此本发明优选糖化菊粉浓度为15％。

本发明的菌株在6.6L发酵罐最高菊粉酶产量达到64.43U/ml。菊粉酶产量比90年代国际上报道的曲霉菊粉酶最高产量为50U/ml(Ongen-Baysal et al.1996)高29％，比克鲁维酵母菊粉酶最高产量37U/ml(GrootWassnik et al.1980)高74％。

用本发明的酵母菌株可缩短发酵周期和菊粉酶产量高峰出现的时间，本发明采用酵母高密度发酵方法，使菌株产酶高峰实际上在60h即已经出现，与曲霉比较这个时间提前或缩短了60-120h，与克鲁维酵母摇瓶发酵相比提前或缩短了48h(表1)。

用本发明的方法可降低发酵成本。由于本发明菌株产酶发酵优选采用无机培养基，所以发酵成本比有机培养基要低约30％，不仅如此，采用无机培养基还有另外两个优势：一是不易产生泡沫，降低消泡成本与难度，有利于通气，二是不易污染杂菌。加上由于发酵周期大为缩短，所以产品成本比90年代研究的最好水平至少低1倍以上。

本发明菌株菊粉酶最适反应温度为55℃，在50-57.5℃范围内稳定性好、能够保持较高活性(图7)。本发明菊粉酶在50℃下的耐温性尚可，50℃下酶的半衰期约为16h，6h后残余酶活性有83.02％，12h后仍有53.74％，至36h仍保持32.09％(图9)。Mg²⁺提高活性11.28％(表3)为本发明菌株菊粉酶首次发现。作为一种提高现有酶活性的措施是有实用价值的。

                        表1.本发明与现有技术中的菊粉酶高产菌株与产酶结果比较

菌种	C源	N源	培养方式	高峰时间(h)	胞外酶活性(U/ml)	文献
							AspergillusnigerAspergillusnigerAspergillusphoenicisKluyveromycesfragilisKluyveromyeesmarxianusKluyveromycesmarxianusKluyveromycesY-85KluyveromycesIW9801	蔗糖玉米浆菊芋菊粉菊粉菊芋粉菊粉玉米浆，菊芋汁蔗糖	蛋白胨+无机氮酵母培养物+无机氮酵母培养物+无机氮酵母培养物无机氮无机氮牛肉膏，尿素无机氮	摇瓶摇瓶摇瓶5L发酵罐摇瓶1L发酵罐1000L发酵罐6.6L发酵罐	168120192恒化器120恒化器3072	48.450363734.53218.762.43	Ohta et al.1993Ongen-Baysal ct al.1994Peters et al.1983Groot Wassnik et al.1980Ongen-Baysal et al.1996Rouwenhorst et al.1988魏文铃等，1998本发明，1998

四、附图简要说明：

图1.Kluyveromyces IW9801在摇瓶发酵中菊粉酶和生物量增长的时间曲线

图2.Kluyveromyces IW9801在32℃补料发酵中菊粉酶与蛋白质分泌量，生物量增长的时间曲线

图3.Kluyveromyces IW9801在38℃补料发酵中菊粉酶与蛋白质分泌量，生物量增长的时间曲线

图4.菊糖浓度与Kluyveromyces IW9801菊粉酶反应速度之间的关系

图5.蔗糖浓度与Kluyveromyces IW9801菊粉酶反应速度之间的关系

图6.Kluyveromyces IW9801菊粉酶的pH适性范围

图7.Kluyveromyces IW9801菊粉酶的温度适性范围

图8.Kluyveromyces IW9801菊粉酶的耐温性观察

图9.Kluyveromyces IW9801液体菊粉酶在50℃下的稳定性观察

图10(A).Kluyveromyces IW9801菊粉酶降解菊粉的结果观察

图10(B).Kluyveromyces IW9801菊粉酶降解菊粉的结果观察

图11.菊粉酶降解菊粉所得产物的HPLCl图谱。其中，上，中，下图分别为标准样品，10％菊粉+40UINU/g(菊粉)和11％菊粉+22UINU/g(菊粉)降解产物的图谱

图12.菊粉酶发酵生产、降解菊粉制备HFS的工艺流程

在完成本发明的过程中本发明人进行的实验：菌株、培养基、菊粉酶活性单位定义与测定

1.菌株

克鲁维酵母IW9801(Kluyveromyces)，为发明者从实验室保存克鲁维酵母菌株和湖北酒曲中分离、筛选、诱变、稳定所得。

2.培养基：

(1)菌株保持斜面培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母抽提物10g，蔗糖20g，琼脂20g；

(2)筛选培养基(1L)：与产酶无机培养基相同，只是将其中蔗糖改为菊糖；

(3)摇瓶产酶有机培养基YIP(1L)：蛋白胨20g，酵母抽提物10g，菊糖5g；

(4)摇瓶产酶无机培养基MG(1L)：(NH₄)₂SO₄5g，KH₂PO₄3g，MgSO₄·7H₂O0.5g，EDTA15mg，ZnSO₄·7H₂O 0.45mg，FeSO₄·7H₂O 1.5mg，CuSO₄·5H₂O0.3mg，CaCl₂·2H₂O 0.45mg，MnCl₂·4H₂O 1.0mg，CoCl₂·6H₂O 0.3mg，H₃BO₃ 1.0mg，KI 0.1mg，NaMoO₄·2H₂O 0.04mg，泛酸钙1.0mg，烟酸1.0mg，生物素0.4mg，葡萄糖2.5g；

(5)发酵罐产酶培养基的种子液培养基(1L)：与摇瓶产酶有机培养基成份相同；

(6)发酵罐产酶无机培养基基础料(1L)：(NH₄)₂SO₄ 10g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，EDTA 30mg，ZnSO₄·7H₂O 0.9mg，FeSO₄·7H₂O 3.0mg，CuSO₄·5H₂O 0.6mg，CaCl₂·2H₂O 0.9mg，MnCl₂·4H₂O 2.0mg，CoCl₂·6H₂O0.6mg，H₃BO₃ 2.0mg，KI 0.2mg，NaMoO₄·2H₂O 0.08mg，泛酸钙2.0mg，烟酸2.0mg，生物素0.8mg，消泡剂GE和GPE各0.075ml，蔗糖10g；

(7)发酵罐产酶无机培养基补充料(1L)：(NH₄)₂SO₄ 10g，KH₂PO₄ 20g，MgSO₄·7H₂O 5.0g，EDTA 0.50g，ZnSO₄·7H₂O 0.225g，FeSOO₄·7H₂O 0.15mg，CuSO₄·5H₂O 0.015g，CaCl₂·2H₂O 0.225g，MnCl₂·4H₂O 0.05g，CoCl₂·6H₂O0.015g，H₃BO₃ 0.05mg，KI 5.0mg，NaMoO₄·2H₂O 0.02g，泛酸钙0.10g，烟酸0.10g，生物素0.8mg，消泡剂GP和GPE各0.075ml，蔗糖500.0g。

所有有机培养基均经121℃灭菌40min，无机培养基经121℃灭菌30min，糖溶液经105℃灭菌20min，维生素及微量元素过滤除菌。

酶活定义与测定：依据国际上绝大多数惯例本发明菊粉酶活性单位定义为一反应体系中每毫升每分钟产生1μM己糖所需酶量即为1个酶活性单位。

本发明菊粉酶反应条件为：经过适当稀释的酶液0.50ml和2.5-3.0％菊糖(上海化学试剂二厂)在55℃反应10min，反应体系为1ml，反应体系pH值为4.5，由0.02mM乙酸-乙酸钠缓冲液提供。沸水5min终止酶反应后，加入斐林试剂A，B混合显色液4ml，置沸水显色15min，冷却后离心5000rpm*6min，取上清于590nm测定吸光值。根据标准曲线求出酶解产物中还原糖含量及酶活性。实验1.产生菊粉酶的天然菌株的诱变与筛选

从本实验室保存的克鲁维酵母菌株与酒曲中筛选分离产菊粉酶菌株，以菊粉酶降解菊粉形成的透明圈的直径大小为依据，进行平板分离和初筛。

初筛当选菌株的菌落细胞直接在敞开的初筛平皿中，接受20W*39CM的紫外光诱变10-20min，诱变菌落再在初筛平板上进行诱变初筛，当选菌株进一步进行摇瓶复筛，并测定菊粉酶活性大小，而后选定高产菌株一株暂定名为Kluyveromyces IW9801，该菌株继代20代以上，产菊粉酶性能及其它主要生物学特性稳定。实验2.克鲁维IW9801菌株生产胞外菊粉酶的条件

1，摇瓶产酶时间曲线

(1)在无机盐-葡萄糖培养基上的产酶时间曲线

在无机盐-葡萄糖培养基上的产酶发酵条件为：32℃*200rpm，250ml三角瓶培养基装量60ml。从图1可知：摇瓶产酶在30h即达到高峰，酶产量为10.4U/ml，此后下降并在100h保持4.0U/ml左右的低水平。相应地生物量始终均未超过1.3mg(DW)/ml。

(2)在有机培养基上的产酶时间曲线

在有机培养基上的产酶条件与无机盐-葡萄糖培养基上的相同。结果显示：在0-42h内培养基中酶的分泌量直线增加至18.12U/ml，并一直保持18U/ml左右这一水平直至88h；相应地生物量从0h直线上升至30h，达到14.25mg/ml，此后一直稳定在12mg(DW)/ml左右(图1)。显示出：菌体生物量与菊粉酶分泌量有密切正比例关系。2，模式发酵罐中补料发酵产酶的时间曲线(1)32℃下无机培养基补料发酵产酶时间曲线

装量及发酵条件：补料发酵在6.6LBraun自控发酵罐中进行，基础料中无机盐在121℃下灭菌30min，蔗糖在105℃下灭菌20min，微量元素和维生素过滤除菌，初装培养基总量为2.2L，接种量为7.5％，种子液提前1天在32℃*200rpm下采用有机培养基摇瓶培养。装料前校正pH和pO₂电极，发酵温度32℃，转速1000rpm，通气量9L/min，由转速和补加料流速控制pO₂＞30％，由2M HCl和氨水控制pH值4.5。培养至5h基础料中C源消耗完毕，开始补料，补料流速从5h至36h匀速增加，初始流速为0.56ml/l/min，36-60h稳定流速为11.19ml/l/min，发酵结束时发酵液体积每升增加433ml，增加43.3％，总发酵液体积约为2.80L。

如图2所示，在0-18h之间菊粉酶活性直线上升，至18h达到33.54U/ml，18-52h保持在37-40U/ml之间，之后上升至46-47U/ml。相应地，菌体生物量，在0-30h之间几乎从0直线上升至53mg/ml(DW)，至42h达到61mg/ml(DW)，基本上保持这一水平至60h，同样地，菌体生物量与胞外菊粉酶产量之间具有明显正比例关系，这一点从图2中可以直观地看出。至于菊粉酶的比活性，除了12h之前维持较高水平150-180U/mg蛋白质外，此后一直稳定在27-31U/mg蛋白质左右。(2)38℃下无机培养基补料发酵产酶时间曲线

38℃下其它发酵条件与32℃下的基本相同，发酵温度38℃，通气量9L/min，转速0-10h为900rpm，此后为1000rpm，由转速和补加料流速控制pO₂＞30％，由2MHCl和氨水控制pH值4.5。培养至4.5h基础料中C源消耗完毕，开始补料，补料流速从4.5-11h匀速增加，初始流速为1.40ml/l/min，至11h达到12.87ml/l/min，11-48h仍然保持这一流速，48-60h保持10.3ml/l/min，60-72h保持7.38ml/l/min，发酵结束时，发酵液体积每升增加723.65ml，增加72.4％，总发酵液体积约为3.40L。实际观察表明：pO₂值在4.5-11h期间保持80-90％，在11-72h基本保持在40％左右。

如图3所示，在6-30h之间菊粉酶活性直线上升，从7.11上升到53.45U/ml，至54h基本保持稳定，之后到72h进一步缓慢上升至64.43U/ml，至于3h酶活性11.43U/ml反而6h的高出约40％，则是因为补料前相对C饥饿的诱导效应所致。至于菊粉酶的比活性，除了3-6h维持较高水平142-155U/mg蛋白质外，此后从12h的5.54U/mg蛋白质一直缓慢下降至60h的15.4U/mg蛋白质；事实上单从蛋白质总分泌量来看，与生物量增长的相关性更高，从8h的50mg/ml几乎直线上升到56h的31.83mg/ml，之后在58-72h基本保持37-40mg/ml的高水平。相应地，菌体生物量，在整个发酵期间都是直线上升的，在12，24，36，48，60和72h生物量分别达到12.5，27.0，36.5，55.0，61.5和65mg(DW)/ml，菌体生物量与胞外菊粉酶产量之间具有很高的正相关性，这一点从图3中可以直观地看出。

总之，菌体菊粉酶及蛋白质总分泌量、生物量相互之间均具有较好的正相关性。尤其是，菊粉酶分泌量在28h即达到了较高水平＞50U/ml，最高水平达到64.43U/ml。实验3.胞外菊粉酶酶学性质

1，菊粉酶的底物特异性及其反应速度与底物浓度的关系

(1)菊粉酶的底物特异性

                  表2.菊粉酶的底物特异性

底物及其浓度	酶活性(U/ml)	相对酶活性(％)	I/S
				菊糖，5.0mM蔗糖，73.04mM	28.20696.97	100.002471.52	1/24.72

由表2资料可见，该菌株分泌的菊粉酶可以同时作用于菊糖和蔗糖，I/S值为1/24.72。

(2)底物为菊糖时的菊粉酶Km值

依据菊糖聚合度一般为30则可计算出菊糖分子量约为5000，因此配制0-30mM浓度梯度的菊糖溶液同时测定菊粉酶催化反应所得单糖产物得率，根据实测值建立直角双曲线方程所得Vmax＝24.4mg/ml/min，Km＝13.3mM(图4)。

(3)底物为蔗糖时的Km值

设置0-600mM浓度梯度的蔗糖溶液，实验测得Vmax＝234.6mg/ml/min，Km＝62.6mM(图5)。

本发明比较两种底物所得Km值，可以肯定该酶作用的最适底物是菊糖而不是蔗糖，尽管I/S为1/24.72，因此判断该酶是菊粉酶而不是转化酶。

2，菊粉酶反应pH值适性范围

如图6所示，菊粉酶最适反应pH值为4.4，但在pH3.8-6.4的范围内均保持了较高的活性，相当于最适pH值下活性的90％。

3，菊粉酶最适反应温度、温度适性范围与耐温性能

(1)菊粉酶最适反应温度

本发明菌株菊粉酶最适反应温度为55℃，在50-57.5℃范围内稳定性好、能够保持较高活性(图7)。

(2)菊粉酶温度适性范围与耐温性能

本发明菌株菊粉酶的耐温性能研究(图8)：在不同温度环境下储藏液体菊粉酶1h，后在55℃下测定酶活性。结果表明：耐温性随温度升高而下降，25，35与45℃下的耐温性相差很小，55℃*1h残余酶活性只有67.91％(5℃下酶活性为100％)，65*1h残余酶活性更低至26.11％。总之，菊粉酶＞50℃的耐温性差。

从图9可知：本发明菊粉酶在50℃下的耐温性尚可，50℃下酶的半衰期约为16h，6h后残余酶活性有83.02％，12h后仍有53.74％，至36h仍保持32.09％。

4，金属离子对菊粉酶活性的影响

从表3资料可以看出，金属离子对本发明菊粉酶活性有明显影响，其中除Mg²⁺提高活性11.28％外，Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺则分别使酶活性降低15.72，22.41和27.60％。

             表3.金属离子对菊粉酶活性的影响

金属离子及其浓度(mM)	酶活性(U/ml)	相对酶活性(％)
			对照MgCl2，25mMCaCl2，25mMMnCl2，25mMFeCl3，25mM	58.5965.2049.3845.4642.42	100111.2884.2877.5972.40

实验5.用菊粉酶降解菊粉

降解条件为50℃，在封口三角瓶中进行。

图10(A)显示，6.0％菊糖在200U/g(S)的菊粉酶作用下5h即可完全降解；10.0％菊糖在40U/g(S)的菊粉酶作用下24h即可完全降解；11.0％菊糖在22U/g(S)的菊粉酶作用下40h可以完全降解。

图10(B)显示，2.5％，5.0％和7.5％菊糖分别在400U/g(S)，200U/g(S)和133U/g(S)的菊粉酶作用下，6h降解率均超过100％。10％，12.5％和15％菊糖分别在100U/g(S)，80U/g(S)和67U/g(S)的菊粉酶作用下降解率超过100％的时间相应是24h，24h和36h。

从经济有效的角度来看，综合图10(A，B)结果，合适的降解条件是：菊糖浓度15.0％，酶作用剂量22U/g，作用时间30-36h，底物降解率95％左右。

具体作法是：取产酶发酵30-36h的酶液(50U/ml)与15％菊糖混合，底物预先灭菌，在50℃*30-36h条件下进行糖化酶解，酶液与菊糖混合比例为：1/15。相当于整个酶解体系中，菊粉酶活性3.0U/ml，菊糖浓度14.1％，产物得率95％。实验6.菊粉降解产物定性与定量分析

表4和图11资料是菊粉酶降解菊粉的定性与定量分析结果。图11是菊粉酶降解菊粉所得产物的高效液相色谱分析图谱。HPLC分析条件：采用氨基柱和Waters401示差检测器，流动相中乙晴∶水＝70∶30，流动相流速为1.0ml/min，柱温为25℃。HPLC和葡萄糖氧化酶法等多种方法测定的结果清楚表明：降解产物中果糖占95％以上，葡萄糖占5％以下，不含其它糖。降解产物总糖含量高于底物含量的原因是：多聚果糖降解为单糖时每产生一个单糖就结合一个水分子，结果使产物量比底物量增加约10％。

     表4.菊粉酶降解菊粉所得产物的高效液相色谱分析结果(％，W/V)^*

菊粉浓度(％)	酶剂量(U/g菊粉)	果糖含量	葡萄糖含量**	蔗糖含量	总糖含量	降解率(％)	果糖率(％)
								1011	4022	10.9811.80	0.16(0.545)0.22(0.530)	00	11.14(11.53)12.02(12.33)	111.4109.3	98.56(95.27)98.17(95.70)

^*底物菊糖用pH4.5的0.02M乙酸缓冲液热溶解，再经115℃*15min灭菌后与过滤除菌的菊粉酶液密封保温，降解条件是50℃*36h。^**扩弧内的数据系根据葡萄糖氧化酶法测定的样品葡萄糖含量结果所计算出的相应数据。

降解产物说明本发明菊粉酶属于外切酶。实验7.菊粉酶发酵生产、降解菊粉制备HFS

本发明菌株菊粉酶发酵生产、降解菊粉制备HFS的工艺流程如图12所示。第一阶段：种子液培养、接种和基础料配制与灭菌

提前一天在有机培养基上摇瓶培养种子液，在32℃*200rpm下培养24小时，第二天配制基础培养基并在121℃下灭菌0.5-1.0小时，其中食用蔗糖按照终浓度达到1％预配后在105℃下灭菌0.5-1.0小时，冷却后加入基础料中，维生素过滤除菌后加入基础料中，种子液接种量为基础料的10％。第二阶段：发酵产酶

1，转速800-1000rpm，通气量9L/min，由转速和补料流速控制pO₂＞＝30％，由氨水控制发酵液pH值保持4.5，温度32-38℃，时间4-6小时。

2，补料培养基配制、灭菌与流加补料

(1)32℃下，培养至5h基础料中C源消耗完毕，开始补料，补料流速从5h至36h匀速增加，36-60h稳定流速为11.19ml/l/min，发酵结束时发酵液体积每升增加433ml，总发酵液体积约为2.80L。在0-18h之间菊粉酶活性直线上升，至18h达到33.54U/ml，18-52h保持在37-40U/ml之间，之后上升至46-47U/ml。菌体生物量，在0-30h之间几乎从0直线上升至53mg/ml(DW)，至42h达到61mg/ml(DW)，基本上保持这一水平至60h，至于菊粉酶的比活性，除了12h之前维持较高水平150-180U/mg蛋白质外，此后一直稳定在27-31U/mg蛋白质左右。

(2)38℃下：除温度38℃外其它发酵条件与32℃下的基本相同。培养至4.5h基础料中C源消耗完毕，开始补料，补料流速从4.5-11h匀速增加，至11h达到12.87ml/l/min，11-48h仍然保持这一流速，48-60h保持10.3ml/l/min，60-72h保持7.38ml/l/min，发酵结束时，发酵液体积每升增加723.65ml，总发酵体积约为3.40L。在6-30h之间菊粉酶活性直线上升，从7.11上升到53.45U/ml，至54h基本保持稳定，之后到72h进一步缓慢上升至64.43U/ml。菊粉酶的比活性，除了3-6h维持较高水平142-155U/mg蛋白质外，此后从12h的5.54U/mg蛋白质一直缓慢下降至60h的15.4U/mg蛋白质；菌体生物量在整个发酵期间是直线上升的，在12，24，36，48，60和72h生物量分别达到12.5，27.0，36.5，55.0，61.5和65mg(DW)/ml。第三阶段：酵母菌体与酶液离心分离

在10℃，3000rpm，离心15分钟，上清为酶液，沉淀为纯的湿菌体细胞。第四阶段：菊粉酶降解菊粉制备高果糖浆

菊粉酶液(1份)+热溶解的15％菊糖(15份)，降解条件：50℃，30-36h，降解率达到95％以上，产物果糖率达到95％以上。4倍蒸发浓缩后使HFS中果糖绝对含量＞90％。

Claims (22)

1、一种产菊粉酶的克鲁维酵母菌株，其保藏号为：CGMCC NO.0360。

2、一种由权利要求1所述的酵母菌株产生的菊粉酶。

3、按照权利要求1所述的菊粉酶，其特征在于，其Km(菊糖)为13.3mM，Km(蔗糖)为62.6mM，I/S＝1/24.72，最适pH值为4.4，并且在pH3.8-6.4范围内均保持了90％以上的残余酶活性，最适反应温度为55℃，50℃下的半衰期为16小时，镁离子能够提高菊粉酶活性11.28％。

4、一种由保藏号为CGMCC NO.0360的可鲁维酵母菌株高密度发酵生产菊粉酶的方法，包括：

(1)将菌株接种到含有0.6-1.4％(重量)氮化合物为氮源，0.8-1.2％(重量)有机碳化合物为碳源的无机盐基础培养基中，在25-40℃下通气培养，使pO₂＞25％，pH4-5；

(2)培养至4-7小时，当pO₂值突然上升时开始流加补充料，补充料与基础培养基相同，只是其中大量元素含量增加5-10倍，微量元素含量增加10-30倍，碳源含量增加30-50倍；

(3)流加补充料过程中，始终使pO₂＞30％，pH4-5，前5-30小时加速流加，后阶段30-70小时匀速流加，最终发酵液体积增加40-80％，菌体生物量湿重达到150-300g/升；

(4)从培养物中分离出酶液。

5、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，使用蔗糖或棉籽糖或葡萄糖或菊芋汁为唯一碳源，使用无机氮化合物或尿素为培养基氮源。

6、按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的碳源为蔗糖，所述的无机氮化合物为硫酸铵。

7、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，基础培养基中C源浓度为0.9-1.1％；流加补充料中C源浓度为35-60％(重量)，并在流加过程中保持发酵液中C源浓度为1.5-3.0％(重量)。

8、按照权利要求7所述的方法，其特征在于，基础培养基中C源浓度为1.0％(重量)；流加补充料中C源浓度为50％(重量)，并在流加过程中保持发酵液中C源浓度为2.5％(重量)。

9、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，培养基装量为罐有效总体积的40-60％；流加补充料体积为基础料体积的40-80％。

10、按照权利要求9所述的方法，其特征在于，培养基装量为罐有效总体积的50％；流加补充料体积为基础料体积的70％。

11、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程中pH控制在4.5，用氨水控制pH值。

12、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的无机盐培养基含有0.6-1.4％(重量)氮化合物为氮源，0.8-1.2％(重量)有机碳化合物为碳源，0.4-0.7％(重量)磷酸盐，0.8-1.2％(重量)镁盐，1.5-4.0ppm的铁、锰盐、硼酸盐、维生素物质和0.2-1.10ppm的铜、锌、钴和碘盐。

13、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程中pO₂值控制在25-50％，转速为450-1000rpm。

14、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程中pO₂值控制在30-40％。

15、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，菌体湿重控制在180-300g/L。

16、按照权利要求15所述的方法，其特征在于，菌体湿重控制在230g/L。

17、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵液中最高胞外菊粉酶活性达到45-75U/ml。

18、按照权利要求17所述的方法，其特征在于，发酵温度为38℃，发酵液中最高胞外菊粉酶活性达到60U/ml。

19、按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酵母为克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxinus)。

20、一种利用由权利要求4所述的方法生产的菊粉酶糖化降解菊粉生产高果糖浆的方法，包括：菌体与酶液分离后，将菊粉酶液与含糖量8-17％的菊粉溶液按照1∶8～17的体积比混合，在45-55℃下酶解糖化30-40小时，得到高果糖浆。

21、按照权利要求21所述的方法，其特征在于，菊粉酶降解菊粉的条件为：菊糖浓度15％(重量)，酶液与8-15％(重量)菊粉液混合比例为1∶15，酶解温度为50℃，酶解时间为36小时。

22、按照权利要求1所述的酵母菌株在生产高果糖浆中的应用。

Images