CN112300945B - 一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺 - Google Patents

一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺。该黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂由黑曲霉菌株QM‑1通过固态发酵而成，该菌株保藏号为CGMCC No，19629，保藏日为2020年5月7日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明方法解决了发酵过程中产率低、成本高、发酵工艺条件复杂等问题；可高效生产含植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、β‑葡聚糖酶的饲用复合酶制剂，并根据所需饲用酶制剂配比调节发酵条件，提高某一种酶的活力，解决牲畜生产过程中饲料利用率和生产效率较低的问题，为不同生长阶段的牲畜提供适宜的饲用复合酶制剂，解决畜牧业经济发展和生态保护相矛盾的问题。

Description

一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺。
背景技术
饲用复合酶是由生物体内合成的，并由人工进一步收集、提取和提纯而成的，在动物体内起作用的一类生物活性高分子物质，其作用条件温和，一般不需要强酸强碱、高温高压、耗能低，只需降低活化能且没有化学污染，是一种绿色天然生物催化剂。在禽畜饲料中加入外源酶，会促进动物对饲料中营养的吸收，减短生长周期，提高肉产品质量，提高饲料利用率，减少畜牧养殖业对激素的依赖，因此，在畜牧业中被广泛应用。
饲用复合酶中有多个酶系，可催化水解不同底物。针对反刍动物幼体消化系统尚未发育成熟，消化道内缺乏相应酶类，饲料不易消化等问题有积极的作用，且能有效降低饲料原料中抗营养因子的毒害作用，补充禽畜体内内源酶的不足，从而提高动物对饲料的消化率和利用率，提高动物养殖业生产性能。因此，添加饲用复合酶是提高饲料消化吸收率的有效途径。饲用复合酶制剂所包含的酶类主要有植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶等。
植酸酶可分解植酸产生禽畜可利用的三磷酸肌醇和单磷酸肌醇等中间产物。如果动物体内缺乏植酸酶，则结垢于消化道内壁的植酸不能被动物吸收利用，以粪便的形式排出体外，植酸中含有的磷元素通过水循环在河流中富集，造成水体富营养化等问题。
纤维素酶是一类复杂的酶系，主要为葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶等，其主要作用有：①降低饲料在禽畜消化系统中的粘性，加快饲料中纤维素代谢利用；②对禽畜的胃粘膜有保护功能，减少饲料贴附的可能；③使饲料中含纤维物质细胞壁开裂，释放内溶物质，提高吸收率。
果胶酶是能够分解分解果胶质的一类酶的总称，有不同的分类。其主要作用有：①解除饲料在消化道内壁的粘结，改善动物生产性能；②补充内源酶的不足，改善肠道功能；③瓦解植物细胞壁及胞间层，提高饲料转化利用效率。动物细胞无法自身合成该酶类，在饲料中添加该酶类，十分必要。
淀粉酶是专门水解淀粉的一类酶，主要包括：α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和糖化酶。主要作用：①尚未发育成熟的动物体内淀粉酶分泌不足，在幼小动物饲料中添加淀粉酶，可加快进入成年期。②提高动物内源性消化酶的分泌及活性。
木聚糖酶包括β-1, 4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶。在饲料中的作用与上述其他酶的作用相似。
β-葡聚糖是一类由右旋葡糖以β-2糖苷键连接的同聚物，在谷物中含量最多。大部分禽畜体内不产该酶类，导致谷物中的β-葡聚糖不能降解，从而降低动物对谷物的消化率，及时添加β-葡聚糖可提高禽畜日增重、饲料利用率及营养物质消化吸收率，降低生产成本。
微生物固体发酵产饲用酶是目前应用最广泛的饲用酶制剂生产方法，能得到种类丰富，活性高的饲用酶。自然界可以产饲用复合酶制剂的菌种很多。
黑曲霉（Aspergillus niger），属真菌界、无性型真菌门、子囊菌菌亚门、半知菌纲、丝孢目、杯霉科、曲霉属，是常见的真丝菌种，广泛分布于自然界，在发酵工业中大量应用，尤其在饲用酶制剂、酿醋、果汁、制酱和白酒酒行业中大量应用。黑曲霉的生长对营养及设备的要求低，培养基中只要有水源、氮源、碳源等基本元素即可满足黑曲霉的生长。大量研究表明，黑曲霉固体发酵可产淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，均可用作动物饲用酶。
黑曲霉生长繁殖能力强，培养条件简单易行且不易受到杂菌污染，产酶速度快，发酵产物多并没有有害物质，被认证是安全的菌株，高产和高分泌的优点，在发酵工业中有广泛的商业用途。采用麸皮发酵，将麸皮中营养成分充分利用，提高麸皮的利用价值，原料易得且价格便宜，对于发酵设备要求低，易于推广。此外，黑曲霉作为宿主菌，具有强的分泌和修饰能力及与哺乳动物类似的翻译后加工能力，重组子的遗传稳定性较好，因此，黑曲霉具有多种高活性酶表达体系。
黑曲霉发酵有液体发酵和固体发酵等发酵模式，但固体发酵培养基容易配制，培养发酵工序简单，发酵成本低。利用黑曲霉固体发酵产饲用复合酶制剂是近几年研究的热点。饲用酶提高禽畜日粮中各种营养代谢的利用率，减少日投量，促进禽畜生产，且酶制剂为生物活性分子，在禽畜体内分解，不会在体内积累而影响到肉质品质，酶制剂还能提高禽畜应激能力和免疫能力、可减少排泄物中的氮磷含量。青藏高原畜牧业发达，牛羊、家禽养殖基地众多，所需饲料量庞大，且大量放牧导致草场退化，动物排泄物中的氮、磷过多会导致水体富营养化，地区生态环境受到威胁。
目前，黑曲霉固体发酵中在以麸皮为发酵培养基时，能够发酵出丰富的饲用复合酶，但培养基碳源氮源比、附加氮源种类、温度、pH等因素对产酶活性有不同的影响。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂及其制备工艺。
一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂，其中，该黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂由黑曲霉菌株QM-1通过固态发酵而成，该黑曲霉菌株QM-1保藏号为CGMCC No，19629，保藏日为2020年5月7日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号）；该饲用复合酶制剂包含6种饲用复合酶：植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶。
上述一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂的制备工艺，具体步骤包括如下：
S1，高产复合酶菌株的获得：将实验室条件下的普通黑曲霉菌株接种到PDA培养基上，接种后分别用幅度≥300Lx的紫外线照射30s、60s、90s、120s，并于30℃培养温度下反复进行筛选，进行酶活测定，通过上述多轮次紫外诱变，筛选出产饲用酶活力高、酶量高的黑曲霉菌株QM-1；
S2，黑曲酶菌株QM-1接种活化：配置斜面活化培养基，接种黑曲酶菌株QM-1进行菌种活化，在30℃恒温培养箱中培养72h；
S3，固体发酵培养：以麸皮：豆粕=3～15:0～5的比例配比作为碳源和氮源，以硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、牛肉膏或酵母膏作为附加氮源，按照料蒸馏水比10:8配置固体发酵培养基；将S2活化的黑曲酶菌株QM-1接种后，在温度25～30℃，pH 3.0～8.0条件下进行发酵5～6天，即获得含有6种饲用复合酶的饲用复合酶制剂；
S4，酶活性测定：植酸酶酶活力测定方法采用硫酸亚铁-钼酸铵法；纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶酶活均采用DNS法。其中，酶制剂的质量是由其活性、纯度、稳定性、配方和包装来评定，最后对产品的质量进行鉴定，以保证产品的安全性和高活性。
进一步的，S1中所述PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其中，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL自然pH。
进一步的，S2中所述斜面活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其中，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH。
进一步的，S3所述麸皮和豆粕的优化比例为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4。
进一步的，所述6种饲用复合酶活力均较高的固体发酵培养条件为：发酵温度30℃，麸皮：豆粕=7:3，硝酸铵做附加氮源，pH=7，发酵时间6天。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：本发明的方法解决了发酵过程中产率低、成本高、发酵工艺条件复杂等问题。本技术可高效生产含植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的饲用复合酶制剂，并根据所需饲用酶制剂配比调节发酵条件，提高某一种酶的活力，解决牲畜生产过程中饲料利用率不高，生产效率较低的问题，为不同生长阶段的牲畜提供适宜的饲用复合酶制剂，解决畜牧业经济发展和生态保护相矛盾的问题。
附图说明
图1为本发明QM1黑曲霉菌株图；
图2为本发明QM1黑曲霉菌株固体发酵后获得的饲用复合酶制剂；
图3为利用本发明饲用复合酶制剂制得的草块、草颗及草粉新型绿色环保饲料。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂，其中，该黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂由黑曲霉菌株QM-1通过固态发酵而成，该黑曲霉菌株QM-1保藏号为CGMCC No，19629，保藏日为2020年5月7日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号）；该饲用复合酶制剂包含6种饲用复合酶：植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶。
上述一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂的制备工艺，具体步骤包括如下：
（1）高产复合酶菌株的获得
将实验室条件下的普通黑曲霉菌株接种到PDA培养基上，接种后分别用幅度≥300Lx的紫外线照射30s、60s、90s、120s，并于30℃培养温度下反复进行筛选，进行酶活测定，通过上述多轮次紫外诱变，筛选出产饲用酶活力高、酶量高的黑曲霉菌株QM-1（详见附图1）；其中，PDA培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL自然pH。
（2）黑曲酶菌株QM-1接种活化
配置斜面活化培养基，其中，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL自然pH，接种黑曲酶菌株QM-1进行菌种活化，在30℃恒温培养箱中培养72h。
（3）固体发酵培养步骤
1）固体发酵培养条件优化——单因素实验
通过单因素实验，对比不同条件下的各酶活力，选出最适条件。
结果显示，pH＝5时，各种酶活性相对较高；在30℃度条件下发酵，各种酶活性相对较高，30℃与动物体温相近，酶制剂投入到饲料中会有明显的效果；60℃时，这四种酶酶活性处于较值；发酵天数为5天时，各种酶活性相对较高。
经过多次实验，确定单因素实验结果，黑曲霉菌株QM-1固体发酵工艺流程：最佳培养基配比，豆粕：麸皮=4：6 ，最佳料蒸馏水比10：8，发酵最佳温度30℃，最适pH 4.6和发酵最适培养时间144h。在此条件下，所测得的纤维素酶活力为3089U/g，果胶酶558U/g，淀粉酶508U/g，β-葡聚糖酶55U/g，植酸酶943U/g，木聚糖酶651U/g。
2）固体发酵培养条件优化——正交实验
由于不同因素之间存在交互作用，我们对QM-1菌株在不同条件下固体发酵饲用复合酶制剂开展了正交实验。
在前期试验的基础上，确定本正交试验为四因素三水平（详见表1），选用正交表L9（34）设计（详见表2）。
表1 正交试验因素水平表
水平 A 温度（℃） B 麸皮：豆粕（共20g) C 不同氮源（g） D pH
1 25 8:2 牛肉膏 5
2 28 7:3 硝酸钠 6
3 30 6:4 硝酸铵 7
表2 L9(34)正交表
序号 A B C D
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 2 1 2 3
5 2 2 3 1
6 2 3 1 2
7 3 1 3 2
8 3 2 1 3
9 3 3 2 1
表3正交试验下各酶活力
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正交实验结果显示：在30℃、麸皮：豆粕=8:2、硝酸铵为附加氮源、pH=7时培养黑曲霉发酵产的植酸酶活力370.00（U/mL）最高；在28℃、麸皮：豆粕=8:2、硝酸钠、pH=8的条件下培养黑曲霉发酵产纤维素酶，酶活力506.43（U/mL）为最高；在28℃、麸皮:豆粕=7:3、硝酸铵、pH=6的条件下培养黑曲霉产果胶酶，酶活力719.30（U/mL）最高；在28℃、麸皮：豆粕=6:4、牛肉膏做氮源、pH=7，培养6天产淀粉酶是最佳培养条件，酶活力为2872（U/mL）；在25℃、麸皮：豆粕=7:3、选用硝酸钠做附加氮源、pH=7的条件下培养黑曲霉所产的木聚糖酶活力为507.05（U/mL）最高；在25℃、麸皮：豆粕=8:2、牛肉膏为附加氮源、pH=6的条件下培养黑曲霉产的β-葡聚糖酶活力=2501（U/mL）最高。
3）固体发酵培养
黑曲霉菌株QM-1固体发酵产6种饲用酶的最佳工艺条件各不相同，在产饲用复合酶时可有针对性的选择发酵工艺条件，获得高效产某一种酶的复合酶制剂；或可选择6种饲用复合酶活力均较高的条件。即以麸皮：豆粕=7:3的比例配比作为碳源和氮源，以硝酸铵作为附加氮源，按照料蒸馏水比10:8配置固体发酵培养基；将S2活化的黑曲酶菌株QM-1接种后，在温度30℃，pH 7.0条件下进行发酵6天，即获得含有6种饲用复合酶的饲用复合酶制剂（详见附图2）。
采用硫酸亚铁—钼酸铵法测定植酸酶酶活力为211（U/mL）；采用DNS法测定纤维素酶活力为441（U/mL）、果胶酶活力为719（U/mL）、淀粉酶活力为2467（U/mL）、木聚糖酶活力为365（U/mL）、β-葡聚糖酶活力为2223（U/mL）。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂，其特征在于，该黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂由黑曲霉菌株QM-1通过固态发酵而成，该黑曲霉菌株QM-1保藏号为CGMCC No，19629，保藏日为2020年5月7日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；该饲用复合酶制剂包含6种饲用酶：植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶。
2.一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂的制备工艺，其特征在于，具体步骤包括如下：
S1，黑曲酶菌株QM-1接种活化：配置斜面活化培养基，接种黑曲酶菌株QM-1进行菌种活化，在30℃恒温培养箱中培养72h；所述的黑曲酶菌株QM-1保藏号为CGMCC No，19629，保藏日为2020年5月7日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
S2，固体发酵培养：以麸皮：豆粕=3～15:0～5的比例配比作为碳源和氮源，以硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、牛肉膏或酵母膏作为附加氮源，按照料蒸馏水比10:8配置固体发酵培养基；将S2活化的黑曲酶菌株QM-1接种后，在温度25～30℃，pH 3.0～8.0条件下进行发酵5～6天，即获得含有6种饲用酶的饲用复合酶制剂，所述的6种饲用酶分别为植酸酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶。
3.根据权利要求2所述的一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂的制备工艺，其特征在于，S1中所述斜面活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其中，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，自然pH。
4.根据权利要求2所述的一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂的制备工艺，其特征在于，S2所述麸皮和豆粕的优化比例为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4。
5.根据权利要求2所述的一种黑曲霉固态发酵产饲用复合酶制剂的制备工艺，其特征在于，所述6种饲用酶活力均较高的固体发酵培养条件为：发酵温度25℃，麸皮：豆粕=7:3，硝酸铵做附加氮源，pH=7，发酵时间6天。
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