CN108949725B - 复合酶制剂的生产和纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶制剂技术领域，公开了复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备里氏木霉种子液，步骤2）制备匍枝根霉种子液，步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，步骤4）制备产酶培养基，步骤5）混合发酵产酶，步骤6）分离和纯化。本发明通过对粗酶液进行分离、纯化工艺，提高了酶活力，酶活损失少。

Description

复合酶制剂的生产和纯化工艺

技术领域

本发明属于酶制剂技术领域，涉及复合酶制剂的生产和纯化工艺。

背景技术

木聚糖酶是指可将半纤维素降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称。木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织、医药及能源等领域有着广泛的应用。木聚糖酶用作饲料酶制剂，可以有效解除木聚糖的抗营养作用，促进畜禽对粗饲料的消化吸收。木聚糖酶作为新型的纸浆漂白助剂，降低漂白用氯，解决纸浆工业中的环境污染问题。在纤维素燃料乙醇的生产实践中，添加木聚糖酶可剥离木质素与纤维素之间的聚合态，易于酶解过程中的酶与底物的充分接触，利于酶解反应的发生，同时能够分解半纤维素成为酵母可利用的单糖，提高出酒率，降低纤维乙醇的成本。

木聚糖酶在自然界分布广泛，可从动物、植物和微生物中获得。例如，海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母菌、瘤胃和反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都有木聚糖酶存在。微生物来源的木聚糖酶普遍存在于自然界中，且种类繁多，应用领域广泛，因此对微生物木聚糖酶的研究报道很多。木聚糖酶的生产菌株主要由细菌、真菌和霉菌。影响产酶的因素有很多，包括菌株选择，培养条件等。

日前研究和应用得最多的是细菌和真菌来源的木聚糖酶。木聚糖酶主要利用真菌和细菌等微生物进行发酵生产。木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用。

微生物发酵产碱性木聚糖酶在我国起步较晚，大多处于基础研究阶段，国内自主产品稀少，产品酶活低。专利CN102776166A公开了一种木聚糖酶生产方法，利用黑曲霉菌，以乳糖为主原料，采取液体深层发酵法生产木聚糖酶，但木聚糖酶的活力水平较低。专利CN105969752A公开了一种碱蓬筛选制备耐碱性木聚糖酶的制备方法，取葡萄糖、纤维素等混合，经高温灭菌制得细菌培养基，接种短小芽孢杆菌M-26，培养得到培养液，分离制得木聚糖酶，但是存在发酵成本较高的缺点。

纤维素酶是指能水解纤维素β-1,4的葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶由葡聚糖内切酶、 葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶三个主要成分组成的诱导型复合酶系。当三个主要成分的活性比例适当时，就能完成纤维素的降解。

现有技术大多采用单一菌株发酵生产一种酶，两种以上的菌株混合发酵生产两种以上的酶制剂的方式比较少，因为不同的菌株之间容易产生拮抗，产酶机理不同，难以协同共生。目前，已经有报道将里氏木霉和黑曲霉共培养，可以促进纤维素酶和半纤维素酶的分泌，并且木聚糖酶也有所提高，对于其他菌株的混合产酶报道较少。但是某些领域需要两种以上酶的产品，通常的做法是将不同的酶进行混合制备获得。近年来含有两种以上酶类型的酶制剂应用越来越广泛，据报道，在生长猪的玉米豆粕麸型日粮中加入木聚糖酶和纤维素酶后，猪的粗纤维的消化率能够提高30%以上，粗蛋白消化率提高10％以上。此外，木聚糖的酶解产物低聚木糖还具有调节动物肠道微生态环境、降低动物结肠炎的发生率和减少抗生素等兽药用量的功效，可使动物的生产性能得到进一步提高。

玉米秸秆属于农业废弃，大多被随意丢弃或者焚烧，但是焚烧会造成环境污染，已经被国家明令禁止，目前，很多企业在研究玉米秸秆的利用方法。由于原玉米秸秆中含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素，因此，可以作为菌株发酵产酶的底物。申请人之前的研究是采用混合发酵方式生产木聚糖酶和纤维素酶，在此基础上，申请人继续对发酵液进行了分离和纯化，制备出酶制剂。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，在已有研究的基础上，本发明提供了复合酶制剂的生产和纯化工艺。

本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：

复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备里氏木霉种子液，步骤2）制备匍枝根霉种子液，步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，步骤4）制备产酶培养基，步骤5）混合发酵产酶，步骤6）分离和纯化。

进一步地，所述步骤1）制备里氏木霉种子液，包括如下步骤：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2×10⁸cfu/ml的里氏木霉种子液。

进一步地，所述步骤2）制备匍枝根霉种子液，包括如下步骤：将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得浓度为5×10⁸cfu/ml的匍枝根霉种子液。

优选地，所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比。

进一步地，所述步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，包括如下步骤：将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到短小芽孢杆菌种子液。

进一步地，所述步骤4）制备产酶培养基，包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到3-4倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声频率为28kHz，然后添加磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L ，121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到产酶培养基。

进一步地，所述步骤5）混合发酵产酶，包括如下步骤：往发酵罐中装60%体积的产酶培养基，将里氏木霉种子液按照5-10%的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为 1:1.5，搅拌转速为 100rpm，培养温度为 30℃，培养12h，然后接种匍枝根霉种子液和短小芽孢杆菌种子液，接种量均为5-10%，通气比1:1.8，搅拌转速200rpm，培养温度32℃，继续培养12h，然后添加玉米秸秆粉20-40g/L，继续培养48-60h，得到发酵液；整个培养过程中，通过流加氨水控制pH为7.5-8.5。

优选地，所述玉米秸秆粉的制备方法包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，即得。

进一步地，所述步骤6）分离和纯化，包括如下步骤：将发酵液以5000rpm的转速离心10min，收集菌体沉淀和上清液，菌体沉淀用于制备菌体蛋白出售；将硫酸铵按照1kg:5L的比例添加至上清液中，搅拌混合，并置于0℃冰水浴处理60min，然后置于8000rpm离心分离10-15min，收集下层沉淀，再添加5倍重量的纯化水，搅拌均匀，通过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到复合酶制剂。

本发明菌株选择：实施方式中具体使用的菌株为里氏木霉 ATCC66589，匍枝根霉ATCC60748，短小芽孢杆菌ATCC700814；也可以使用同一种属中功能类似的其他菌株。

本发明技术方案通过对现有技术的改进，带来一系列的有益效果，主要包括以下几个方面：

里氏木霉的产纤维素酶能力较强，可以将纤维素组分酶解产生还原糖供匍枝根霉和短小芽孢杆菌使用，而且匍枝根霉和短小芽孢杆菌能够共生，可以利用纤维素酶解产生的还原糖，产生木聚糖酶酶解木质素，而酶解产物的消耗能够解除对纤维素酶的抑制作用；

本发明三种菌株具备协同产酶能力，木聚糖酶和纤维素酶的酶活较高，适合后续生产复合酶制剂；

玉米秸秆和豆粕是农业加工副产物，价格低廉，一般加工后用作饲料或直接废弃，附加值很低；本发明以玉米秸秆和豆粕为主要原料作为产酶培养基组分，降低了产酶成本；

本发明发酵产酶过程中，发酵初期，以菌株增殖为优先，产酶为辅，因此，选择氮源含量高的培养基，从而有利于菌株的增殖，发酵后期，菌株达到较高的浓度，此时，以产酶为主，添加适量的玉米秸秆粉，可以刺激菌株产生木聚糖酶和纤维素酶。

本发明通过对粗酶液进行分离、纯化工艺，提高了酶制剂的酶活力，酶活损失少。

附图说明

图1：混合发酵方式对产酶能力的影响；

图2：三种菌株混合发酵时间对产酶的影响；

图3：发酵培养过程中玉米秸秆粉的添加量对产酶的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：

制备里氏木霉种子液：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2×10⁸cfu/ml的里氏木霉种子液；

制备匍枝根霉种子液：将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得浓度为5×10⁸cfu/ml的匍枝根霉种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比；

制备短小芽孢杆菌种子液：将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，获得浓度为5×10⁸cfu/ml的短小芽孢杆菌种子液；

制备产酶培养基：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到3倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声频率为28kHz，然后添加磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L，121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到产酶培养基；

混合发酵产酶：往发酵罐中装60%体积的产酶培养基，将里氏木霉种子液按照8%的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为 1:1.5，搅拌转速为 100rpm，培养温度为 30℃，培养12h，然后接种匍枝根霉种子液和短小芽孢杆菌种子液，接种量均为8%，通气比1:1.8，搅拌转速200rpm，培养温度32℃，继续培养12h，然后添加玉米秸秆粉30g/L，继续培养60h，得到发酵液；整个培养过程中，通过流加氨水控制pH为8；所述玉米秸秆粉的制备方法包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，即得；

分离和纯化：将发酵液以5000rpm的转速离心10min，收集菌体沉淀和上清液，菌体沉淀用于制备菌体蛋白出售；将硫酸铵按照1kg:5L的比例添加至上清液中，搅拌混合并置于0℃冰水浴处理60min，然后将其置于8000rpm离心分离10min，收集下层沉淀，然后添加5倍重量的纯化水，搅拌均匀，通过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱（用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液平衡），用0.5mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到复合酶制剂。

实施例2

复合酶制剂的生产和纯化工艺，其包括如下步骤：

制备里氏木霉种子液：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2×10⁸cfu/ml的里氏木霉种子液；

制备匍枝根霉种子液：将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得浓度为5×10⁸cfu/ml的匍枝根霉种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比；

制备短小芽孢杆菌种子液：将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，获得浓度为5×10⁸cfu/ml的短小芽孢杆菌种子液；

制备产酶培养基：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到4倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声频率为28kHz，然后添加磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L ，121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到产酶培养基；

混合发酵产酶：往发酵罐中装60%体积的产酶培养基，将里氏木霉种子液按照5%的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为 1:1.5，搅拌转速为 100rpm，培养温度为 30℃，培养12h，然后接种匍枝根霉种子液和短小芽孢杆菌种子液，接种量均为10%，通气比1:1.8，搅拌转速200rpm，培养温度32℃，继续培养12h，然后添加玉米秸秆粉20g/L，继续培养48h，得到发酵液；整个培养过程中，通过流加氨水控制pH为7.5；所述玉米秸秆粉的制备方法包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，即得；

分离和纯化：将发酵液以5000rpm的转速离心10min，收集菌体沉淀和上清液，菌体沉淀用于制备菌体蛋白出售；将硫酸铵按照1kg:5L的比例添加至上清液中，搅拌混合并置于0℃冰水浴处理60min，然后将其置于8000rpm离心分离15min，收集下层沉淀，然后添加5倍重量的纯化水，搅拌均匀，通过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱（用0.05mol/L pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液平衡），用0.5mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到复合酶制剂。

实施例3

不同菌株配伍方式对发酵液酶活力的影响：

本发明采用常规3,5-二硝基水杨酸法检测发酵液中木聚糖酶和纤维素酶活力。

组别设置：

实验组：实施例1；

对照组1：同时接种，其余同实施例1；

对照组2：里氏木霉+匍枝根霉，其余同实施例1；

对照组3：里氏木霉+短小芽孢杆菌，其余同实施例1；

对照组4：匍枝根霉+短小芽孢杆菌，其余同实施例1；

如图1所示，实验组的发酵产酶活力最高，木聚糖酶活力达到288U/ml，纤维素酶活力达到206U/ml，明显高于同时接种的对照组1，以及采用两种菌株产酶的对照组2-4，里氏木霉的产纤维素酶能力较强，提前接种一段时间，其可以将纤维素组分酶解产生还原糖供匍枝根霉和短小芽孢杆菌使用，而且匍枝根霉和短小芽孢杆菌能够共生，可以利用纤维素酶解产生的还原糖，产生木聚糖酶，木聚糖酶可以酶解木质素，而酶解产物的消耗能够解除对纤维素酶的抑制作用。

实施例4

发酵时间和玉米秸秆粉添加量对发酵产酶的影响：

设定混合培养的时间点进行检测发酵液的酶活，分别为24，36，48，60，72，84（h）。如图2所示，随着混合培养时间的增加，酶活力迅速增加，60h后增加缓慢，两种酶均在72h达到峰值，随后有所下降，因此，选择混合培养的时间为60－72h最为合适。

发酵培养过程中玉米秸秆粉的添加量对产酶的影响，添加量设置为0,10,20,30,40,50（g/l），如图3所示，随着玉米秸秆粉添加量的增加，木聚糖酶和纤维素酶有所提高，木聚糖酶活力在30g/L的添加量时达到峰值，纤维素酶在40g/L时达到峰值，但是30－40g/L之间的添加量对酶活影响差距不到，因此选择30－40g/L的添加量较为合适。

实施例5

本发明复合酶制剂的指标检测：

以实施例1为例，检测了复合酶制剂的酶活以及回收率，具体见表1：

表1

指标	酶活力（万U/g）	酶活力回收率%
			木聚糖酶	7.2	61.7
纤维素酶	4.5	54.1

如表1所示，本发明复合酶制剂含有较高酶活力的木聚糖酶和纤维素酶，酶活力回收率达到61.7%和54.1%。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.复合酶制剂的生产和纯化方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备里氏木霉种子液，将里氏木霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到里氏木霉种子液；

步骤2）制备匍枝根霉种子液，将匍枝根霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到种子培养基上进行种子培养，获得匍枝根霉种子液，所述种子培养基的组分为：葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水，以上为重量百分比；

步骤3）制备短小芽孢杆菌种子液，将短小芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到短小芽孢杆菌种子液；

步骤4）制备产酶培养基，包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，然后与豆粕按照1:1的质量比混合，再添加到3-4倍重量的水中，然后500rpm搅拌5min，再升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声频率为28kHz，然后添加磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L，121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，得到产酶培养基；

步骤5）混合发酵产酶，包括如下步骤：往发酵罐中装60% v/v的产酶培养基，将里氏木霉种子液按照5-10%的接种量接种到发酵罐中，控制通气比为 1:1.5，搅拌转速为 100rpm，培养温度为 30-32℃，培养12h，然后接种匍枝根霉种子液和短小芽孢杆菌种子液，接种量均为5-10%，通气比1:1.8，搅拌转速200rpm，培养温度30-32℃，继续培养12h，然后添加玉米秸秆粉20-40g/L，继续培养48-60h，得到发酵液；整个培养过程中，通过流加氨水控制pH为7.5-8.5；

步骤6）分离和纯化，包括如下步骤：将发酵液以5000rpm的转速离心10min，收集菌体沉淀和上清液，菌体沉淀用于制备菌体蛋白；将硫酸铵按照1kg:5L的比例添加至上清液中，搅拌混合，并置于0℃冰水浴处理60min，然后8000rpm离心分离10-15min，收集下层沉淀，再添加5倍重量的纯化水，搅拌均匀，通过DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，洗脱，收集洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥得到复合酶制剂；

所述里氏木霉为里氏木霉ATCC66589，所述匍枝根霉为匍枝根霉ATCC60748，所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌ATCC700814。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米秸秆粉的制备方法包括如下步骤：将玉米秸秆粉碎，过50目筛，即得。

Images