CN118147109A - 一种酶组合物及其在食用油生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶组合物及其在食用油生产中的应用，属于发酵生产酶技术领域。本发明所述酶组合物，含有磷脂酶1300~1600U/mL、脂肪酶350~500U/mL、蛋白酶45~70U/mL、α‑淀粉酶1100~1400U/mL。本发明利用微生物发酵方式，对发酵培养基及发酵方式进行优化和改善，通过发酵制备含有多种高活性酶的酶组合物。本发明所提供的酶组合物可用于食用油脱胶工艺，脱胶效果要明显优于单一酶制剂。
Description
技术领域
本发明属于发酵生产酶技术领域，涉及一种酶组合物及其在食用油生产中的应用。
背景技术
众所周知，目前市场上销售的食用油大多都是经过精炼后制取的，而在精炼过程中包含脱胶、脱色、脱臭、脱蜡等几部分，该工序的目的就是去除毛油中的有害杂质，提高油脂的质量和储存稳定性。
脱胶是精炼工段中非常重要的工艺，也是精炼的第一道工序。工业生产中常用的脱胶方式多为水化脱胶法，利用磷脂胶溶性杂质的亲水性，向毛油中加入适量的热水或电解质水溶液，通过热搅拌使其进入油相中，从而形成磷脂分子和甘油三酯分子往复排列的双分子层，水分子在两层混合双分子层之间。发生水化作用的磷脂吸附着油中的其他胶质，颗粒变大并相互聚集，由小胶粒形成大的胶团，漂浮于毛油中，油厂可经过离心分离法分离已经沉降的胶杂。
酶法脱胶是在油脂精炼中采用现代生物工程高新技术，利用磷酸酯将毛油中的非水合磷脂水解掉一个脂肪酸，从而提高磷脂的亲水性，可以更方便、经济、环保地利用水化的方法将磷脂除掉，以达到油脂生产企业降低生产成本、提高出油率、增加经济效益的目的。
酶法脱胶具有以下显著的优点，首先可以提高经济效益：经过酶法脱胶后，可以显著提高精炼率，得率一般提高1%以上，可以在脱臭物中保留更多Ve，增加脱臭物价值；其次，对环境友好，采用酶法脱胶，其化学品消耗明显降低，且不产生皂角，简化了后续处理。
目前用于食用油脱胶工艺的酶主要为磷脂酶。已有现有技术公开，在水化脱胶过程中加入淀粉酶，可使多糖降解，油脂得率略有提高，但对磷脂去除效果不明显，磷脂酶与淀粉酶联合深度脱胶也有可能，但与单独的磷脂酶相比，效益较低。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种酶组合物及其制备方法，本发明所述酶组合物含有磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶，该酶组合物采用微生物发酵方式制备得到，所制备的酶组合物中各酶的活性较高，在用于食用油精炼脱胶工艺时，效果要优于单一酶制剂。
本发明采用了以下技术方案来实现上述目的：
一种酶组合物，以酶活性计，含有以下成分：磷脂酶1300~1600U/mL、脂肪酶350~500U/mL、蛋白酶45~70U/mL、α-淀粉酶1100~1400U/mL。
以上所述酶组合物是通过微生物发酵方式获得。
本发明提供上述通过微生物发酵方式制备酶组合物的方法，具体包括以下步骤：
（1）制备生产菌株种子液：以桔青霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌为生产菌株，将生产菌株分别活化、液体种子培养基中培养，获得浓度为2×108cfu/mL~5×108cfu/mL的种子液；
（2）预发酵：将大豆秸秆、海藻分别干燥、粉碎、过筛，混合，得混合物；加入混合物2-3倍重量的水，灭菌，得混合溶液；向混合溶液中接种桔青霉、黑曲霉种子液，在30-35℃下自然发酵2-3天，得预发酵混合物；
（3）混合发酵：将花生粕干燥、粉碎、过筛，加入1.5-2倍重量的水，然后加入葡萄糖、酵母浸粉、硝酸钠、玉米浆、维生素E、硫酸镁、硫酸亚铁，调节pH为7-7.5，灭菌，得基质溶液；向基质溶液中接种枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为150-200r/min，通风量1.5-2.5vvm，发酵温度30-35℃，发酵周期为1.5-2天，发酵过程用氨水调节pH为7-7.5；后加入上述预发酵混合物，继续培养1-1.5天，添加补料，再继续培养2-3天，发酵过程用氨水调节pH为7-7.5，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
进一步的，上述预发酵步骤中所述海藻为褐藻和/或红藻。
进一步的，上述预发酵步骤中大豆秸秆、海藻与混合发酵步骤中花生粕的重量比为1:(0.3-0.5):(1.5-2)。
进一步的，上述混合发酵步骤中葡萄糖的添加量为15-20g/L、酵母浸粉的添加量为10-12g/L、硝酸钠的添加量为1.5-2g/L、玉米浆的添加量为6-10g/L、维生素E的添加量为0.2-0.5g/L、硫酸镁的添加量为1-1.5g/L、硫酸亚铁的添加量为0.1-0.12g/L。
进一步的，所述混合溶液步骤中补料含有淀粉水解糖20-30g/L、肌醇磷脂3-5g/L、玉米粉15-20g/L、硫酸锰0.3-0.5g/L、硫酸铵2-3g/L、磷酸二氢钾3-6g/L。
更进一步的，所述补料的添加量为基质溶液体积的5-8%。
进一步的，上述方法预发酵中，桔青霉种子液的接种量为混合溶液体积的8-10%，黑曲霉种子液的接种量为混合溶液体积的5-6%。
进一步的，上述方法混合发酵中，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为基质溶液体积的10-12%、铜绿假单胞菌种子液的接种量为基质溶液体积的3-5%。
本发明还提供了上述酶组合物的具体用途，即所述酶组合物可用于食用油精炼工艺；所述的精炼工艺具体是指脱胶过程。
本发明具有以下有益效果：1.本发明中采用微生物发酵的方式生产含磷脂酶、脂肪酶、蛋白酶、α-淀粉酶的复合酶组合物，所得酶活性较高，且酶活配比适宜，构成的复合酶组合物可用于食用油脱胶工艺，脱胶效率高。
2.本发明提供的微生物发酵方式生产复合酶组合物的方法，通过对培养基成分进行优化，从而在发酵液中获得高活力的复合酶组合物。本发明中分为预发酵与混合发酵两个阶段，首先采用大豆秸秆、海藻作为预发酵培养基，接种黑曲霉、桔青霉，大豆秸秆中含有丰富的粗蛋白、粗脂肪和钙、磷等营养物质，红藻、褐藻等海藻中含有钠、钾、铁、钙等营养素，还含有丰富的不饱和脂肪酸，可为黑曲霉、桔青霉提供充足的营养物质，有利于黑曲霉、桔青霉的大量增殖；在混合发酵中，枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌发酵形成优势菌群后，再添加黑曲霉、桔青霉预发酵产物，共同发酵后，形成复合菌群，添加含有肌醇磷脂的补料后，诱导复合菌群产酶，从而在发酵液中获得高活力的复合酶组合物，且复合酶组合物中磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的酶活配比适宜。
3.本发明微生物发酵方式中采用大豆秸秆、海藻、花生粕等原料提供微生物所需的碳源和氮源等营养成分，原料易得且价廉，无需经过复杂的前处理，生产成本低，生产产率高。
4.利用本发明方法和培养基生产的复合酶组合物，其酶活率大大提高，将该复合酶组合物用于食用油脱胶工艺中，可有效脱除油脂中的磷脂，提高精炼率；同时该复合酶组合物还可催化脂肪分解，形成多种类型的多不饱和脂肪酸，使得食用油中脂肪酸结构组成更加合理，丰富了食用油的营养组成，使其营养功能更为完善。
5.利用本发明所得复合酶组合物能够解决单一酶制剂处理效果差、效率低的问题，在较少使用量情况下，能够更好的进行脱胶，成本低、效果好；且有效解决了现有技术中磷脂酶和淀粉酶共同使用收率低的难题，使用本发明复合酶组合物进行食用油脱胶工艺，其收率大大提高。
附图说明
图1：磷脂酶活性对比；
图2：蛋白酶活性对比；
图3：脂肪酶活性对比；
图4：α-淀粉酶活性对比；
图5：复合酶脱胶效果对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请权利要求所保护的范围。
实施例1 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将黑曲霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为3.5×108cfu/mL的黑曲霉种子液；
2.将桔青霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2×108cfu/mL的桔青霉种子液；
3.将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为5×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌种子液；
4.将铜绿假单胞菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为2.5×108cfu/mL的铜绿假单胞菌种子液。
以上所接种的黑曲霉、桔青霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
预发酵：
取10kg大豆秸秆干燥、粉碎，过80目筛；取5kg褐藻干燥、粉碎，过100目筛；将过筛后的大豆秸秆和褐藻混合均匀，得混合物；加入混合物3倍重量的水，混合均匀，121℃蒸汽灭菌30min，得混合溶液；混合溶液自然冷却至室温后，接种体积量10%的桔青霉种子液、6%的黑曲霉种子液，在30-35℃下自然发酵2天，得预发酵混合物。
混合发酵：
取2kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入2倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖15g/L、酵母浸粉12g/L、硝酸钠1.5g/L、玉米浆10g/L、维生素E 0.2g/L、硫酸镁1.5g/L、硫酸亚铁0.1g/L，调节pH为7，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量12%的枯草芽孢杆菌、3%的铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为200r/min，通风量2.5vvm，发酵温度30℃，发酵周期为2天，发酵过程用氨水调节pH为7；后加入上述预发酵混合物，继续培养1.5天，添加基质溶液体积5%的补料（含有淀粉水解糖30g/L、肌醇磷脂3g/L、玉米粉20g/L、硫酸锰0.3g/L、硫酸铵3g/L、磷酸二氢钾3g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至室温），再继续培养3天，发酵过程用氨水调节pH为7，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
实施例2 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将黑曲霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2×108cfu/mL的黑曲霉种子液；
2.将桔青霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为4.5×108cfu/mL的桔青霉种子液；
3.将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为3.3×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌种子液；
4.将铜绿假单胞菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为3.5×108cfu/mL的铜绿假单胞菌种子液；
以上所接种的黑曲霉、桔青霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
预发酵：
取10kg大豆秸秆干燥、粉碎，过80目筛；取3kg褐藻干燥、粉碎，过100目筛；将过筛后的大豆秸秆和褐藻混合均匀，得混合物；加入混合物2倍重量的水，混合均匀，121℃蒸汽灭菌30min，得混合溶液；混合溶液自然冷却至室温后，接种其体积量8%的桔青霉种子液、5%的黑曲霉种子液，在30-35℃下自然发酵3天，得预发酵混合物。
混合发酵：
取1.5kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入1.5倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、硝酸钠2g/L、玉米浆6g/L、维生素E 0.5g/L、硫酸镁1g/L、硫酸亚铁0.12g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量10%的枯草芽孢杆菌、5%的铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为150r/min，通风量1.5vvm，发酵温度35℃，发酵周期为1.5天，发酵过程用氨水调节pH为7.5；后加入上述预发酵混合物，继续培养1天，添加基质溶液体积8%的补料（含有淀粉水解糖20g/L、肌醇磷脂5g/L、玉米粉20g/L、硫酸锰0.5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾6g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至室温），再继续培养2天，发酵过程用氨水调节pH为7.5，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
实施例3 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将黑曲霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2.3×108cfu/mL的黑曲霉种子液；
2.将桔青霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为3.7×108cfu/mL的桔青霉种子液；
3.将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为4.1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌种子液；
4.将铜绿假单胞菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为3.3×108cfu/mL的铜绿假单胞菌种子液。
以上所接种的黑曲霉、桔青霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
预发酵：
取10kg大豆秸秆干燥、粉碎，过80目筛；取4kg红藻干燥、粉碎，过100目筛；将过筛后的大豆秸秆和褐藻混合均匀，得混合物；加入混合物3倍重量的水，混合均匀，121℃蒸汽灭菌30min，得混合溶液；混合溶液自然冷却至室温后，接种其体积量9%的桔青霉种子液、6%的黑曲霉种子液，在33℃下自然发酵2天，得预发酵混合物。
混合发酵：
取2kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入2倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖18g/L、酵母浸粉12g/L、硝酸钠1.8g/L、玉米浆8g/L、维生素E 0.3g/L、硫酸镁1.2g/L、硫酸亚铁0.11g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量11%的枯草芽孢杆菌、5%的铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为180r/min，通风量2vvm，发酵温度33℃，发酵周期为2天，发酵过程用氨水调节pH为7.5；后加入上述预发酵混合物，继续培养1.5天，添加基质溶液体积6%的补料（含有淀粉水解糖25g/L、肌醇磷脂4g/L、玉米粉18g/L、硫酸锰0.4g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾5g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至室温），再继续培养2天，发酵过程用氨水调节pH为7.5，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
实施例4 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将黑曲霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2.1×108cfu/mL的黑曲霉种子液；
2.将桔青霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为3.9×108cfu/mL的桔青霉种子液；
3.将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为4.8×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌种子液；
4.将铜绿假单胞菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为2.6×108cfu/mL的铜绿假单胞菌种子液。
以上所接种的黑曲霉、桔青霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
预发酵：
取10kg大豆秸秆干燥、粉碎，过80目筛；取3kg红藻干燥、粉碎，过100目筛；将过筛后的大豆秸秆和褐藻混合均匀，得混合物；加入混合物2倍重量的水，混合均匀，121℃蒸汽灭菌30min，得混合溶液；混合溶液自然冷却至室温后，接种其体积量7%的桔青霉种子液、5%的黑曲霉种子液，在33℃下自然发酵2天，得预发酵混合物。
混合发酵：
取1.8kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入1.5倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖16g/L、酵母浸粉10g/L、硝酸钠2g/L、玉米浆8g/L、维生素E 0.3g/L、硫酸镁1g/L、硫酸亚铁0.12g/L，调节pH为7，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量11%的枯草芽孢杆菌、5%的铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为200r/min，通风量2vvm，发酵温度35℃，发酵周期为2天，发酵过程用氨水调节pH为7；后加入上述预发酵混合物，继续培养1.5天，添加基质溶液体积6%的补料（含有淀粉水解糖25g/L、肌醇磷脂5g/L、玉米粉15g/L、硫酸锰0.4g/L、硫酸铵3g/L、磷酸二氢钾3g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至室温），再继续培养3天，得到发酵液，发酵过程用氨水调节pH为7.5，发酵液离心，上清液即为上清液，将上清液冻干，取上清液即得酶组合物。
对比例1 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将桔青霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为3.7×108cfu/mL的桔青霉种子液；
2.将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为4.1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌种子液。
以上所接种的桔青霉、枯草芽孢杆菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
预发酵：
取10kg大豆秸秆干燥、粉碎，过80目筛；加入大豆秸秆3倍重量的水，混合均匀，121℃蒸汽灭菌30min，得混合溶液；混合溶液自然冷却至室温后，接种其体积量9%的桔青霉种子液，在33℃下自然发酵2天，得预发酵混合物。
混合发酵：
取2kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入2倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖18g/L、酵母浸粉12g/L、硝酸钠1.8g/L、玉米浆8g/L、维生素E 0.3g/L、硫酸镁1.2g/L、硫酸亚铁0.11g/L，调节pH为7，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量11%的枯草芽孢杆菌，搅拌转速为180r/min，通风量2vvm，发酵温度33℃，发酵周期为2天，发酵过程用氨水调节pH为7；后加入上述预发酵混合物，继续培养1.5天，添加基质溶液体积6%的补料（含有淀粉水解糖25g/L、肌醇磷脂4g/L、玉米粉18g/L、硫酸锰0.4g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾5g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至室温），再继续培养2天，发酵过程用氨水调节pH为7，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
对比例2 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将黑曲霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2.3×108cfu/mL的黑曲霉种子液；
2.将桔青霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为3.7×108cfu/mL的桔青霉种子液；
3.将枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为4.1×108cfu/mL的枯草芽孢杆菌种子液；
4.将铜绿假单胞菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为3.3×108cfu/mL的铜绿假单胞菌种子液。
以上所接种的黑曲霉、桔青霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
混合发酵：
取2kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入2倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖18g/L、酵母浸粉12g/L、硝酸钠1.8g/L、玉米浆8g/L、维生素E 0.3g/L、硫酸镁1.2g/L、硫酸亚铁0.11g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量11%的枯草芽孢杆菌、5%的铜绿假单胞菌种子液、9%的桔青霉种子液、6%的黑曲霉种子液，搅拌转速为180r/min，通风量2vvm，发酵温度33℃，发酵2天，添加基质溶液体积6%的补料（含有淀粉水解糖25g/L、玉米粉18g/L、硫酸锰0.4g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾5g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至室温），再继续培养4天，发酵过程用氨水调节pH为7.5，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
对比例3 酶组合物制备
制备生产菌株种子液：
1.将黑曲霉接种到PDA固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基中进行种子培养，得到浓度为2.3×108cfu/mL的黑曲霉种子液；
2.将铜绿假单胞菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行种子培养，得到浓度为3.3×108cfu/mL的铜绿假单胞菌种子液。
以上所接种的黑曲霉、铜绿假单胞菌均为自中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的普通菌株。
预发酵：
取4kg褐藻干燥、粉碎，过100目筛；加入褐藻3倍重量的水，混合均匀，121℃蒸汽灭菌30min，得混合溶液；混合溶液自然冷却至室温后，接种其体积量6%的黑曲霉种子液，在33℃下自然发酵2天，得预发酵混合物。
混合发酵：
取2kg花生粕干燥、粉碎，过80目筛，加入2倍重量的水，混合均匀后，加入葡萄糖18g/L、酵母浸粉12g/L、硝酸钠1.8g/L、玉米浆8g/L、维生素E 0.3g/L、硫酸镁1.2g/L、硫酸亚铁0.11g/L，调节pH为7.5，121℃蒸汽灭菌30min，得基质溶液；基质溶液自然冷却至室温后，接种其体积量5%的铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为180r/min，通风量2vvm，发酵温度33℃，发酵周期为2天，发酵过程用氨水调节pH为7.5；后加入上述预发酵混合物，继续培养4天，发酵过程用氨水调节pH为7.5，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
一、本发明酶组合物活力测定。
参考以下标准或检测方法别对实施例1-4、对比例1-3所得的上清液进行磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的酶活检测。
其中，蛋白酶检测标准：GB/T23527-2009，脂肪酶检测标准：CB/T 23535-2009，α-淀粉酶检测标准：GB8275-2009。
磷脂酶活力测定方法参考以下步骤：
配制浓度为0.35％(W/W)的卵磷脂悬液，用1mol/L的NaOH调节卵磷脂悬液的pH至8左右。取20mL卵磷脂悬液置于100mL三角瓶中，在35℃温度的水浴中预热5min，然后向各瓶中加入3mL待测上清液，在35℃温度水浴中振荡反应20min，放入冰水中冷却。在三角瓶中加入1％(W/W)酚酞50μl作指示剂，在冰水浴中，用标定的2.5mmol/LNaOH滴定，记录所消耗NaOH，将消耗2.5mmol/LNaOH1μL定义为1个磷脂酶活力单位(U)。
结果见附图1-4所示，实施例1-4与对比例1-3对比，磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的酶活显著提高，实施例1中α-淀粉酶活性高达1336、蛋白酶活性高达66，实施例2中脂肪酶活性高达474，实施例3中磷脂酶活性高达1532，实施例1-4中，磷脂酶活性均在1300以上、蛋白酶活性均在45以上、脂肪酶活性均在350以上、α-淀粉酶活性均在1100以上；对比例1中磷脂酶、α-淀粉酶活性相对较高，分别为1028、953，但蛋白酶、脂肪酶的活性较低；对比例2中蛋白酶的酶活达到102，但磷脂酶、α-淀粉酶活性较低；对比例3中脂肪酶活性相对较高，为332，但其他酶活性较低。整体分析，实施例1-4中复合酶整体活性优于对比例1-3中复合酶。本发明中通过采用桔青霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌同时生产，并通过对发酵方式进行改进和调整，获得复合酶，同时提高了复合酶中各酶的酶活。
二、本发明酶组合物在植物油脂（大豆油）精炼脱胶工艺中的应用。
1.取大豆毛油（山东金胜粮油食品有限公司提供）1kg，加热至80℃，加入质量分数为45%的柠檬酸1.5mL，在80℃，500r/min条件下酸处理20min。结束后冷却至35℃，加入质量分数4%氢氧化钠溶液混匀调节pH值，再加入适量蒸馏水和上清液（10mL），于10000r/min高剪切混合1min，然后在500r/min，35℃条件下搅拌进行酶解脱胶，每隔30min取样，将样品置于90℃热水中灭酶10min，进行含磷量分析。
含磷量测定方法：取油样约5mL，在10000r/min条件下离心1min，取上层油样测定磷含量，油脂中磷含量的测定参照GB/T 5537-2008《粮油检测：磷脂含量的测定》。
结果附图5所示，在2h以内，添加实施例1-4所得上清液的油样磷含量明显下降，之后随着时间的延长，磷含量下降速率减缓，磷含量基本趋于稳定，下降不明显，在3.5h时，添加实施例1-4上清液的油样磷含量已降至10mg/kg以下；添加对比例1-3所得上清液的油样，磷含量下降幅度较实施例1-4缓慢，且在4h内的磷含量明显高于实施例1-4，添加对比例2上清液的油样，其4h时的磷含量为11.3mg/kg。
2.取上述反应4h后的脱胶油，测定脱胶油的含磷量以及收率。
结果见下表1，在反应4h后，添加实施例1-4所得上清液的油样，磷含量较低，脱胶油的收率在95%以上；添加对比例1-3所得上清液的油样，磷含量偏高，其中对比例2的磷含量为11.3，高于10mg/kg；结果说明使用本发明所提供的酶组合物，可以有效缩短食用油脱胶反应的时间，且有效降低食用油中磷含量，效果明显。
此外，本发明实施例1-4所得上清液中，脂肪酶活性较高，在脱胶过程中，油脂中部分脂肪酸甘油酯倍水解成小分子脂肪酸或不饱和脂肪酸，可丰富食用油中脂肪酸结构，虽然会导致油脂中酸价有所上升，但变化不明显且在国家标准之内。
表1 脱胶油指标检测结果
Claims (10)
1.一种酶组合物，其特征在于，以酶活性计，含有以下成分：磷脂酶1300~1600U/mL、脂肪酶350~500U/mL、蛋白酶45~70U/mL、α-淀粉酶1100~1400U/mL。
2.根据权利要求1所述的酶组合物，其特征在于，所述的酶组合物是由微生物发酵方式获得。
3.一种利用微生物发酵方式制备权利要求1或2所述酶组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备生产菌株种子液：以桔青霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌为生产菌株，将生产菌株分别活化、液体种子培养基中培养，获得浓度为2×108cfu/mL~5×108cfu/mL的种子液；
预发酵：将大豆秸秆、海藻分别干燥、粉碎、过筛，混合，得混合物；加入混合物2-3倍重量的水，灭菌，得混合溶液；向混合溶液中接种桔青霉、黑曲霉种子液，在30-35℃下自然发酵2-3天，得预发酵混合物；
混合发酵：将花生粕干燥、粉碎、过筛，加入其1.5-2倍重量的水，然后加入葡萄糖、酵母浸粉、硝酸钠、玉米浆、维生素E、硫酸镁、硫酸亚铁，调节pH为7-7.5，灭菌，得基质溶液；向基质溶液中接种枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌种子液，搅拌转速为150-200r/min，通风量1.5-2.5vvm，发酵温度30-35℃，发酵周期为1.5-2天，发酵过程用氨水调节pH为7-7.5；后加入上述预发酵混合物，继续培养1-1.5天，添加补料，再继续培养2-3天，发酵过程用氨水调节pH为7-7.5，得到发酵液，发酵液离心，取上清液即得酶组合物。
4.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预发酵步骤中海藻为褐藻和/或红藻。
5.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预发酵步骤中大豆秸秆、海藻与混合发酵步骤中花生粕的重量比为1:(0.3-0.5):(1.5-2)。
6.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合发酵步骤中葡萄糖的添加量为15-20g/L、酵母浸粉的添加量为10-12g/L、硝酸钠的添加量为1.5-2g/L、玉米浆的添加量为6-10g/L、维生素E的添加量为0.2-0.5g/L、硫酸镁的添加量为1-1.5g/L、硫酸亚铁的添加量为0.1-0.12g/L。
7.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述所述混合发酵步骤中补料含有淀粉水解糖20-30g/L、肌醇磷脂3-5g/L、玉米粉15-20g/L、硫酸锰0.3-0.5g/L、硫酸铵2-3g/L、磷酸二氢钾3-6g/L；所述补料的添加量为基质溶液体积的5-8%。
8.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预发酵步骤中，桔青霉种子液的接种量为混合溶液体积的8-10%，黑曲霉种子液的接种量为混合溶液体积的5-6%。
9.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合发酵步骤中，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为基质溶液体积的10-12%、铜绿假单胞菌种子液的接种量为基质溶液体积的3-5%。
10.一种酶组合物在食用油精炼工艺中的应用，其特征在于，所述酶组合物为权利要求1-2所述酶组合物。
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